李長青,陸 昊,蓋如新,周 洋,王沛政,李衛(wèi)東

(1.海南三亞國家級珊瑚礁自然保護(hù)區(qū)管理處,海南 三亞，572000;2.海南熱帶海洋學(xué)院 生態(tài)環(huán)境學(xué)院 海南 三亞，572022；3.海南大學(xué) 生態(tài)環(huán)境學(xué)院，?？?570228)

0 引言

珊瑚礁是世界上生物多樣性最豐富的生態(tài)系統(tǒng)之一。20世紀(jì)珊瑚白化已經(jīng)造成世界各地珊瑚大量死亡，對海洋生態(tài)系統(tǒng)造成了嚴(yán)重影響[1]。由于全球氣候變暖，世界各地珊瑚礁白化頻率和程度在增加，珊瑚礁覆蓋大幅下降[2]。中國南海經(jīng)常發(fā)生由于溫度變化原因?qū)е碌纳汉靼谆录3]，在過去40年間，中國南海北部東沙環(huán)礁水溫升高2 ℃導(dǎo)致40%的珊瑚以前所未有的速度白化[4]。

珊瑚共生體包括珊瑚宿主、珊瑚內(nèi)共生蟲黃藻和微生物，微生物包括細(xì)菌、真菌、古細(xì)菌和病毒等；內(nèi)共生生物與宿主之間相互作用和溝通機(jī)制對宿主健康發(fā)揮著重要作用[5-6]。蟲黃藻是珊瑚體內(nèi)重要的、能進(jìn)行光合作用的內(nèi)共生生物[7]15667。如今珊瑚共生蟲黃藻受到全球海面溫度升高的威脅，這種溫度帶來的壓力通常會導(dǎo)致珊瑚體內(nèi)蟲黃藻釋放，最終致珊瑚白化和死亡[8]。當(dāng)環(huán)境發(fā)生變化時，蟲黃藻能夠通過改變其在珊瑚宿主內(nèi)的群體結(jié)構(gòu)從而適應(yīng)宿主體[9-10]。

珊瑚和蟲黃藻共生體適應(yīng)不斷變化的環(huán)境條件的能力取決于宿主和共生體群體的穩(wěn)定性[7]15668。Berkelmans等[11]認(rèn)為珊瑚對溫度的耐受性與其體內(nèi)共生的蟲黃藻類型有關(guān)。共生蟲黃藻優(yōu)勢種群與地理隔離和環(huán)境變化有關(guān)系[12]。在共生蟲黃藻多樣性研究中，科學(xué)家對其形態(tài)與超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了長期探索和研究[13]，但是由于蟲黃藻種類繁多，其形態(tài)學(xué)特征還不能完全解決蟲黃藻分類問題[14]。相比傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類，使用 DNA 序列進(jìn)行蟲黃藻分類分析則顯得更為高效與方便[15]。通過分子學(xué)方法研究蟲黃藻多樣性發(fā)現(xiàn)，蟲黃藻具有極高的多樣性[16]，其種類也可由A-I的9個主要系群細(xì)分為上百個種[17]。如今ITS2(the internal transcribed spacer 2)區(qū)域仍然是學(xué)者們區(qū)分蟲黃藻種類最為有效的DNA標(biāo)記方法之一[18]866。

除蟲黃藻外，珊瑚內(nèi)共生細(xì)菌對珊瑚健康狀態(tài)也有著直接影響[19]，珊瑚共生細(xì)菌主要集中在其黏液和體內(nèi)，對維護(hù)珊瑚健康和抵抗疾病有著非常重要的保護(hù)作用[20]355,[21]。隨著高通量技術(shù)的快速發(fā)展，結(jié)合高通量技術(shù)分析細(xì)菌多樣性方法已經(jīng)在珊瑚內(nèi)共生細(xì)菌種群研究中得到很好的應(yīng)用。Sunagawa等[22]利用高通量技術(shù)測序方法測序細(xì)菌16s rRNA基因，分析Montastraeafaveolata珊瑚內(nèi)共生細(xì)菌多樣性。Bayer等[23]利用高通量方法，分析紅海Stylophorapistillata珊瑚內(nèi)共生細(xì)菌多樣性，發(fā)現(xiàn)Endozoicomonas在這種珊瑚內(nèi)胚層組織中非常豐富，這種細(xì)菌與珊瑚有著密切聯(lián)系。當(dāng)環(huán)境發(fā)生變化時，如溫度升高，珊瑚共生菌在珊瑚體內(nèi)可以產(chǎn)生有益化合物或抗體等來應(yīng)對這種來自環(huán)境的壓力，來維持整個珊瑚的穩(wěn)定性[20]357。Kushmaro等[24]研究發(fā)現(xiàn)海水溫度升高只是一個誘導(dǎo)因素，當(dāng)海水溫度升高時，珊瑚自身抵抗力會下降并增加細(xì)菌毒性。在關(guān)于珊瑚病原體研究中發(fā)現(xiàn)珊瑚白化和弧菌有著直接關(guān)系[25-27]。羅尼氏弧菌Vibrioshilonii會產(chǎn)生胞外毒素進(jìn)而抑制蟲黃藻光合作用，使蟲黃藻溶解導(dǎo)致珊瑚白化，且不同蟲黃藻對羅尼氏弧菌Vibrioshilonii毒素響應(yīng)是不同的[28]。Serratia會導(dǎo)致珊瑚白痘病發(fā)生，最后影響珊瑚健康并造成珊瑚大面積死亡[29-30]。

綜上所述，共生藻和共生菌平衡對珊瑚的穩(wěn)定和健康非常重要，當(dāng)這種平衡由外界環(huán)境改變打破后，整個珊瑚共生藻與細(xì)菌共生系統(tǒng)的聯(lián)系斷裂，使得珊瑚白化或者感染疾病死亡。本研究通過2種珊瑚在熱刺激后短暫時間內(nèi)，利用高通量測序方法來研究它們體內(nèi)共生蟲黃藻和細(xì)菌多樣性及總量的變化情況，以期在全球氣候逐漸變暖的情況下為珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)和修復(fù)工作提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

所有實(shí)驗(yàn)樣品均從中國海南萬寧市外海采集，實(shí)驗(yàn)采集軟珊瑚皮革珊瑚(Sarcophytontrocheliophorum)和石珊瑚腎形真葉珊瑚(Euphylliaancora)各5個個體，并將所有皮革珊瑚和腎形真葉珊瑚分割成約10 cm2的小個體，并將其附著在陶瓷基座上。于本實(shí)驗(yàn)室珊瑚館暫養(yǎng)2周，珊瑚缸水體量為60 L，溫度為26 ℃，鹽度為35，pH為8.2，光暗比為12 h∶12 h,2周后待2種珊瑚所有個體恢復(fù)正常，觸手正常伸展后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 急性升溫應(yīng)激

隨機(jī)挑選10個皮革珊瑚與10個腎形真葉珊瑚個體，分別放置于2個水族缸中(溫度：26 ℃，鹽度：35，pH：8.2，光暗比12 h∶12 h，體積：70 cm×50 cm×60 cm)。在24 h內(nèi)調(diào)節(jié)加熱棒緩慢升高水族缸水溫(每隔4 h升高1 ℃)，當(dāng)水溫升高至32 ℃后維持12 h，其他環(huán)境條件不變。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，剪取對照組中5個皮革珊瑚個體的觸手各0.2 g，混合命名S-1；對照組腎形真葉珊瑚各0.2 g，混合命名E-1；處理組皮革珊瑚命名S-2與腎形真葉珊瑚命名E-2。

1.2.2 DNA提取、擴(kuò)增和測序

使用海洋生物基因組DNA提取試劑盒(擎科，廣州，中國)提取珊瑚共生體樣本基因組。嚴(yán)格遵循試劑盒說明書步驟操作，所提 DNA 經(jīng)過質(zhì)量檢測后存放于-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

對細(xì)菌16s rRNA基因的V3-V4可變區(qū)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，高通量測序接頭序列均用下劃線標(biāo)注。ITS引物和16s rRNA引物反應(yīng)體系與PCR擴(kuò)增程序參照文獻(xiàn)[31]方法。根據(jù)Illumina MiSeq平臺的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程構(gòu)建 PE2×300庫，最后于Illumina Miseq PE300平臺測序(Majorbio)。

以DNA為模板，ITS2正向引物：

5-TACACGACGCTCTTCCGATCTACTGGAATTGCAGAACTCCGTG - 3

ITS2-reverse反向引物：

5-GAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAACTAGGGGATCCATATGCTTAAGTTCAGCGGGT - 3

對蟲黃藻ITS2 rDNA基因進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。

使用正向引物341F：

5′-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCCTACGGGNGGCWGCAG -3′

反向引物805R：

5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC-3′對細(xì)菌16s rRNA基因的V3-V4可變區(qū)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。

1.2.3 序列信息學(xué)分析

參照Liang等[32]的方法，使用Trimmomatic軟件平臺剔除低質(zhì)量分?jǐn)?shù)(<20)序列。將所有樣本序列按照序列間的距離進(jìn)行聚類，序列按97%相似度標(biāo)準(zhǔn)分成不同OTU(Operational Taxonomic Units)?；贠TU聚類分析結(jié)果，使用軟件Motuur對樣本聚類結(jié)果進(jìn)行阿爾法多樣性指數(shù)分析得到單樣本的多樣性(Alpha多樣性),通過 Good’s物種覆蓋度(Coverage)、群落豐富度(Ace)和群落多樣性(Shannon)指數(shù)反映微生物群落的覆蓋率、豐度和多樣性。

1.2.4 蟲黃藻ITS2序列分析

根據(jù)NCBI中的Genbank含有的蟲黃藻ITS2數(shù)據(jù)庫對所有樣本進(jìn)行blastn比對分析，篩選出OTU序列的最佳比對結(jié)果，并對比對結(jié)果進(jìn)行過濾，默認(rèn)滿足相似度>90%且coverage>90%的序列被用來后續(xù)分類，不滿足條件的序列則被歸為unclassified[17]。最后在每種珊瑚測序結(jié)果中選取豐度較大且具有代表性的OTUs使用Maximum parsimony來構(gòu)建進(jìn)化樹。

使用QIIME進(jìn)行network分析。選取豐度排序在前100位的OTU信息，繪圖時選取具有顯著聯(lián)系 (weight≥100) 的節(jié)點(diǎn)，采用kamada kawai算法進(jìn)行繪圖。樣本以矩形為標(biāo)識，不同樣本顏色不同，OTU或物種分類以餅圖為標(biāo)識，面積大小代表整體豐度大小，餅圖中的不同色塊代表不同樣本在該OTU或物種分類上的豐度大小。

1.2.5 細(xì)菌16s序列分析

2 結(jié)果

2.1 蟲黃藻多樣性分析

蟲黃藻引物ITS2測序結(jié)果共獲得234 547個Raw num，然后按照barcode標(biāo)簽序列識別并區(qū)分樣品得到各樣本數(shù)據(jù)(表1)。最后處理過濾和去除嵌合體與非特異性擴(kuò)增序列后總共得到233 991個有效序列(S-1：44 091；S-2：55 356；E-1：38 039；E-2：96 505)。每個樣品獲得的OTUs進(jìn)行多樣性指數(shù)分析(表2)。從Chao指數(shù)和Ace指數(shù)可以看出，在熱處理后，2種珊瑚的共生蟲黃藻測序數(shù)據(jù)總數(shù)明顯增多。在升溫后，腎形真葉珊瑚的Shannon指數(shù)降低，但皮革珊瑚Shannon指數(shù)幾乎不變，Simpson指數(shù)分析可以得到相同結(jié)果。升溫前后來看Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均表明蟲黃藻多樣性方面腎形真葉珊瑚顯著高于皮革珊瑚。

表1 蟲黃藻ITS2序列測序數(shù)據(jù)信息統(tǒng)計

表2 Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計

將每個樣品的OTUs與Genbank含有的蟲黃藻ITS2數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blastn比對分析，最后選取豐度較高的OTUs使用Maximum parsimony來構(gòu)建進(jìn)化樹(圖1)。結(jié)果顯示，在皮革珊瑚中存在Clade C和Clade D兩個系群蟲黃藻，其中：Clade C系群為皮革珊瑚優(yōu)勢種群，在腎形真葉珊瑚中同樣有Clade C和Clade D兩種蟲黃藻，但Clade D為優(yōu)勢種群。選取豐度排序在前100位的OTU信息，選取具有顯著聯(lián)系 (weight≥100) 的節(jié)點(diǎn)最后進(jìn)行network分析并繪圖，結(jié)果如圖2。

(a)皮革珊瑚 (b)腎形真葉珊瑚圖1 基于不同OTUs的ITS2基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

(a)皮革珊瑚 (b)腎形真葉珊瑚圖2 皮革珊瑚和腎形珊瑚的network分析結(jié)果注2：兩種珊瑚的圖中矩形代表樣本，不同樣本顏色不同；OTU以餅圖為標(biāo)識，面積大小代表整體豐度大小，餅圖中的不同色塊代表不同樣本在該OTU分類上的豐度大小。

2.2 細(xì)菌多樣性

基于細(xì)菌16s rDNA基因的測序結(jié)果，經(jīng)處理過濾和去除嵌合體與非特異性擴(kuò)增序列后，共計得到115 692個有效序列(表3)。將所有樣本序列按照序列間距離進(jìn)行聚類，再根據(jù)序列之間的相似性將序列分成不同的操作分類單元 (OTU)，把每個樣品獲得的OTUs進(jìn)行多樣性指數(shù)分析，結(jié)果見表4。從Chao指數(shù)和Ace指數(shù)可以看出，在熱處理后，2種珊瑚的內(nèi)共生細(xì)菌的總數(shù)均出現(xiàn)下降。熱處理后，2種珊瑚的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)呈現(xiàn)出明顯的差異，皮革珊瑚的內(nèi)共生細(xì)菌多樣性明顯下降，而腎形真葉珊瑚的內(nèi)共生細(xì)菌多樣性明顯增加。

表3 基于細(xì)菌16s rDNA基因各樣本數(shù)據(jù)信息

表4 Alpha多樣性指數(shù)

對每個樣品獲得的OTUs基于RDP數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種分類，獲得在屬水平上群落結(jié)構(gòu)分布柱狀圖(圖3)。皮革珊瑚在升溫前Spongiibacter、Achromobacter、Solimonas、Stenotrophomonas、Oceanococcus和Citrobacter為優(yōu)勢種群，升溫后細(xì)菌多樣性下降明顯，Delftia和Serratia上升為優(yōu)勢種群(圖4)，與對照組差異顯著(P<0.01)(圖5a)。腎形真葉珊瑚珊瑚升溫前優(yōu)勢種群為Oceanococcus(Ectothiorhodospiraceae科)、Solimonas(Sinobacteraceae科)、Marivita(Rhodobacteraceae科)、Citrobacter(Enterobacteriaceae科)和Stenotrophomonas(Xanthomonadaceae科)，升溫后腎形真葉珊瑚細(xì)菌多樣性增加，優(yōu)勢種群成為Alcanivorax(Alcanivoracaceae科)、Loktanella(Rhodobacteraceae科)、Neptuniibacter(Oceanospirillaceae科)、Leisingera(Rhodobacteraceae科)和Achromobacter(Alcaligenaceae科)，其中Oceanococcus、Spongiibacter、Marivita和Solimonas的數(shù)量顯著下降(圖5b)。

(a)皮革珊瑚

(b)腎形真葉珊瑚圖3 皮革珊瑚和腎形真葉珊瑚在熱處理前后內(nèi)共生的細(xì)菌群落多樣性變化

圖4 其生細(xì)菌各屬分類水平豐度熱圖

(a)皮革珊瑚 (b)腎形真葉珊瑚圖5 熱處理前后菌群豐度差異分析

3 討論

本研究利用高通量測序技術(shù)初步研究了急性熱刺激對中國南海2種珊瑚內(nèi)共生蟲黃藻及細(xì)菌的響應(yīng)?；诟咄繙y序技術(shù)OTUs框架，利用ITS2 rDNA引物擴(kuò)增來研究珊瑚共生蟲黃藻的多樣性方法已被很多的研究者認(rèn)可和使用[33-35]。Chen等[36]曾報道中國南海的腎形真葉珊瑚的共生藻都為Clade C，而本研究高通量測序結(jié)果表明腎形真葉珊瑚共生藻優(yōu)勢系群為Clade D，皮革珊瑚內(nèi)共生蟲黃藻優(yōu)勢系群為Clade C。2種珊瑚在經(jīng)過熱刺激處理后，內(nèi)共生蟲黃藻優(yōu)勢系群并沒有發(fā)生改變，這與Stat等[37]研究一致。本研究的2種珊瑚在熱刺激后短暫時間內(nèi)蟲黃藻的總數(shù)增加，而 Strychar等[38]認(rèn)為珊瑚在受到外界熱環(huán)境影響后導(dǎo)致蟲黃藻逃逸，這可能由于珊瑚熱處理后珊瑚組織失水導(dǎo)致；在熱刺激后皮革珊瑚內(nèi)共生蟲黃藻多樣性變化不明顯，可能和皮革珊瑚對溫度的耐受性較強(qiáng)有關(guān)[39]，而在熱處理后腎形真葉珊瑚蟲黃藻多樣性下降。

在熱刺激后2種珊瑚內(nèi)共生細(xì)菌總數(shù)都下降，這可能和細(xì)菌本身對溫度的耐熱性有關(guān)，耐熱性低的細(xì)菌會在升溫后死亡。皮革珊瑚在升溫后內(nèi)共生細(xì)菌多樣性降低，內(nèi)共生細(xì)菌Delftia(Comamonadaceae科—Burkholderiales目)和Serratia(Enterobacteriaceae科—Enterobacteriales目)成為優(yōu)勢種群。其原因可能為Delftia是好氧菌(aerobic)，在熱刺激后珊瑚代謝增強(qiáng)，蟲黃藻總量增加，光合作用釋放了更多的氧氣，導(dǎo)致好氧菌Delftiasp數(shù)量增加成為優(yōu)勢菌所致。Ritchie[40]研究發(fā)現(xiàn)珊瑚共生細(xì)菌能夠分泌具有抗生素能力的黏液來抵抗Serratia，升溫破壞了珊瑚的這種抵抗能力。Chiu[41]對Euphyllia glabrescens的共生細(xì)菌分布研究發(fā)現(xiàn)Alphaproteobacteria經(jīng)常分布在黏液和表皮之間，而Gammaproteobacteria在胃腸道中檢測到，并且在黏液和表皮中很少觀察到。腎形真葉珊瑚在熱刺激前，Gammaproteobacteria(Oceanococcus、Solimonas、Citrobacter、Stenotrophomonas)和Alphaproteobacteria(Marivita)為優(yōu)勢種群，這和Chiu[41]的研究結(jié)果一致。腎形真葉珊瑚在熱刺激后其內(nèi)共生細(xì)菌多樣性變高，Alcanivorax(Alcanivoracaceae科)、Loktanella(Rhodobacteraceae科)、Neptuniibacter(Oceanospirillaceae科)、Leisingera(Rhodobacteraceae科)和Achromobacter(Alcaligenaceae科)變?yōu)閮?yōu)勢菌，常見的珊瑚病原菌Vibrio、Cyanobacteria和Serratia等變化不明顯。