許 帥 孫景春 劉石林 林承剛張立斌 孫麗娜 楊紅生,3①

(1. 中國科學院海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境科學重點實驗室 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋生態(tài)與環(huán)境科學功能實驗室 中國科學院海洋大科學研究中心 中國科學院海洋牧場工程實驗室 青島 266071；2. 中國科學院大學 北京 100049；3. 中國科學院種子創(chuàng)新研究院 武漢 430072)

棘皮動物(Echinodermata)是一類古老、特殊的海洋生物，在5 億多年以前的古生代寒武紀即已出現(xiàn)，是無脊椎動物中進化地位最高等的類群。世界范圍內現(xiàn)存棘皮動物7000 余種，化石種類接近13000 種，幾乎全營底棲生活，分布范圍廣泛，從熱帶海域到寒帶海域，從潮間帶到數(shù)千米的深海都有分布(廖玉麟等,2011; Pawson, 2007)?，F(xiàn)存的棘皮動物普遍認為可分為5 個綱，包括海百合綱(Crinoidea)、海星綱(Asteroidea)、蛇尾綱(Ophiuroidea)、海膽綱(Echinoidea)和海參綱(Holothurioidea)。棘皮動物門為海洋生境所特有，其幼蟲兩側對稱而成體多五輻射對稱，體壁中有CaCO3為主要成分的內骨骼向外突出成棘刺，有特殊的水管系統(tǒng)輔助攝食、運動和其他功能，在海洋生態(tài)系統(tǒng)的結構和功能中發(fā)揮著重要作用(廖玉麟等, 2011)。棘皮動物中，海參綱和海膽綱的一些種類具有很高的經(jīng)濟、營養(yǎng)和藥用價值，逐漸被人們采捕和養(yǎng)殖。但由于近幾年來采捕過度、養(yǎng)殖規(guī)模急劇擴大和近親交配嚴重等原因，一些棘皮動物種質退化問題非常明顯，良種缺乏、病害發(fā)生日趨嚴重、對病害和環(huán)境脅迫的抵抗能力顯著降低。以刺參(Apostichopus j aponicus)為例，在20 世紀80 年代，人們突破了刺參苗種規(guī)?；庇夹g。21 世紀以來，養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展，刺參成為引領我國第5 次海水養(yǎng)殖浪潮的主要品種。然而，從2004 年開始，養(yǎng)殖刺參陸續(xù)出現(xiàn)大規(guī)模死亡現(xiàn)象，并出現(xiàn)種質退化現(xiàn)象，在近幾年尤為明顯，主要表現(xiàn)出生長速度慢、病害頻發(fā)、存活率低等問題，導致每年數(shù)10 億的經(jīng)濟損失(王印庚等, 2014)。野生刺參的資源量和種質質量亦急劇下降，已被世界自然保護聯(lián)盟納入瀕危物種紅色名錄(IUCN Red List of Threatened Species, IUCN 紅色名錄)。群體選育往往被用來解決經(jīng)濟品種種質退化及良種缺乏等問題，但此方法周期較長，且容易存在雌、雄性腺成熟不同步、親本運輸不方便以及配子利用率低等問題。而超低溫冷凍保存技術是生物材料進行長期保存的一種有效手段，能有效解決群體選育中的上述問題。對種質資源(包括精子、卵子和胚胎)進行超低溫冷凍保存，能夠提供不受季節(jié)限制的種質資源、提高配子的利用率；擴大雜交育種范圍，克服長期近親交配造成的種質資源衰退；使種質資源運輸更加便利，節(jié)約遺傳育種的資金；拯救珍稀、瀕臨滅絕的具有優(yōu)良性狀的物種，并可長期不間斷的為遺傳育種和現(xiàn)代生物技術的研究提供生物材料，為種質資源的保存和生物多樣性的保護開辟了新途徑。本文對海膽、海參和海星3 種主要棘皮動物的精子超低溫冷凍保存研究進行了系統(tǒng)歸納和整理，并展開描述了精子冷凍保存過程的各個步驟，以期為棘皮動物種質資源保存的進一步研究及產(chǎn)業(yè)化應用提供參考。

1 精子超低溫冷凍保存

1.1 超低溫冷凍保存技術原理

超低溫冷凍保存技術能夠長期、有效保存生物材料，它是指通過向細胞、胚胎和組織器官等添加適當?shù)目箖鲆?，使其在冷凍過程中免受或降低一系列低溫損傷(冰晶損傷、滲透損傷和溶質損傷等)的影響，并通過一定的降溫速率，使之快速越過危險區(qū)(-15℃～-60℃)，最后，投入液氮中(-196℃)進行長期保存的過程(劉清華, 2005)。理論上認為，在液氮中保存的生物樣品細胞內的一切生化反應處于“暫?！睜顟B(tài)，甚至完全停止，可以長時間保存。在需要的時候，以適當?shù)姆椒芍匦陆鈨?、激活液氮中的生物樣品，恢復其內部正常的生化反應，使其具有正常的生物學功能(齊文山等, 2014; Liu et al, 2015)。

1.2 精子進行超低溫冷凍保存的優(yōu)點

相對于卵子和胚胎等種質資源，精子的超低溫冷凍保存具有其獨特的優(yōu)勢。精子體積小，具有單層膜等相對簡單的結構，表面積與體積比相對較大，有利于水分和抗凍劑的滲透；而卵子和胚胎體積較大，表面積與體積比減小，并且具有豐富的卵黃、脂肪滴和多隔室生物系統(tǒng)，導致膜通透效率降低，雙層半透性膜系統(tǒng)和高的低溫敏感性又進一步限制了水分和抗凍劑在膜兩邊的滲透性(Tsai et al, 2012)。

1.3 精子超低溫冷凍保存技術的應用

到目前為止，精子的超低溫冷凍保存技術已在人類輔助生殖和牲畜育種中得到廣泛應用(Anger et al ,2003; Mocé et al, 2009; Sharma et al, 2015; Rozati et al,2017)。例如，冷凍保存已常規(guī)應用于協(xié)助馬(Janett et al,2003)和牛(Bhakat et al, 2011)的育種計劃。在水生物種中，為突破地理隔離，擴大雜交組合范圍，提供不受季節(jié)限制的精子庫，達到提高遺傳育種效率和瀕危物種保護的目的，人們亦對一些水生經(jīng)濟物種開展了精子超低溫冷凍保存研究。據(jù)統(tǒng)計，已有約200 種魚類的精子被冷凍保存(田永勝等, 2009; 齊文山等,2014; Liu et al, 2015)，針對軟體動物(牡蠣和鮑魚)、甲殼類(蝦和蟹)和棘皮動物(海膽)等水生經(jīng)濟物種的精子也有相應的冷凍保存研究(Dunn et al , 1973;Bhavanishankar et al, 1997; Dong et al, 2007)。但棘皮動物精子冷凍保存研究開展得較晚，且研究內容不夠系統(tǒng)全面，沒有形成產(chǎn)業(yè)化應用的發(fā)展模式(田永勝等, 2019)。棘皮動物中，海參綱和海膽綱的一些種類自古以來即被作為滋補佳品，常被用來預防和治療一些疾病，具有重要的經(jīng)濟價值和營養(yǎng)價值(廖玉麟等,2011; Bordbar et al, 2011)。因此，棘皮動物主要的精子冷凍保存研究也集中于這2 個綱的物種。

2 棘皮動物精子超低溫冷凍保存基本步驟

通常精子超低溫冷凍保存過程主要包括精子的收集與質量評估、稀釋劑制備、冷凍保護劑制備、精子與冷凍保護劑混合、冷卻、儲存、解凍和解凍后精子質量評價(圖1)。其中，抗凍劑的種類和濃度、稀釋液種類、精子與冷凍保護劑混合比例、降溫程序和解凍程序等因素均會對解凍后的精子質量產(chǎn)生極大的影響。解凍后評價精子質量的指標包括運動活力、形態(tài)變化、受精率、孵化率、細胞器完整性和代謝機能(Liu et al, 2015)。

圖1 精子超低溫冷凍保存技術流程Fig.1 Basic process for sperm cryopreservation technology

2.1 精子收集與活力檢測

海膽和海參等棘皮動物不能根據(jù)體型和外表分辨性別，因此，精子和卵子通常是一起收集。一般采用自然排精和獲取性腺2種方法收集棘皮動物的精子。自然排精是指通過升高海水溫度、陰干或注射KCl溶液等方式誘導棘皮動物排出成熟的精子，但此方法收集精子的質量容易受到粘液、海水或糞便的污染，而且收集的精子難于濃縮(Gwo et al, 2002)。獲取性腺是收集棘皮動物精子最常使用的方式，廣泛應用于海參、海星和海膽等動物的精子收集過程中。Shao等(2006)獲取新鮮刺參精液的操作為：當發(fā)現(xiàn)白色精液從位于刺參背部的生殖孔中釋放出來時，立即挑出雄性刺參，解剖獲得成熟雄性性腺并剪碎，用0.5 mm的篩網(wǎng)濾掉性腺管壁碎片，濾出新鮮精液，于4℃保存至使用。用此方法，每只雄性海參可收集約5 ml新鮮精子。

在獲取新鮮精液后，立即檢測精子活力，以判斷是否能用于后續(xù)的超低溫冷凍。精子的活力可通過光學顯微鏡統(tǒng)計樣本中運動精子的百分比來直接測量(Lyons et al, 2005; Vitiello et al, 2011; Mizuno et al,2019)。Mizuno 等(2019)采用含0.5%胎牛血清的人工海水激活稀釋500 倍的刺參精子，認為只有活力高于70%的精子才適用于超低溫冷凍保存。此外，還可通過計算機輔助精子分析系統(tǒng)(Computer-aided sperm analysis, CASA)來測量精子的運動能力，該系統(tǒng)能客觀評估精子的多種運動參數(shù)，比主觀觀察具有更高的準確性和測量效率(Acosta-Salmón et al , 2007)。Adams 等(2003)研究表明，同種海膽不同個體的新鮮精子雖然起初的運動活力無顯著差異，但經(jīng)過超低溫冷凍保存，解凍的精子質量卻存在顯著差異。因此，在進行超低溫冷凍實驗時，將3 個雄性個體的精子合并在一起以減少雄性個體精子之間的差異，此方法還解決了從棘皮動物(海膽)單只個體中只能收集到少量精子的問題， 這一現(xiàn)象在牡蠣中也有報道(Paniagua-Chavez et al, 2001; Dong et al, 2007)。新鮮精子的質量是影響精子超低溫冷凍保存成功與否的重要因素，冷凍后精子的質量與新鮮精子的質量有著密切的關系(Coloma et al, 2011; Orgal et al, 2012)。如何選取性腺質量好、精子活力高、精子抗凍能力強的親本對棘皮動物精子超低溫冷凍保存非常重要，如何評價和獲取高質量的棘皮動物新鮮精子仍需進一步深入研究。

2.2 稀釋劑的選擇

普遍認為，精液超低溫保存所需稀釋液必須具備的性質是抑制精子的活力、維持細胞電解質和滲透壓的平衡(Graham et al, 1990; 劉清華, 2005)。在海洋魚類和軟體動物精子冷凍保存中，常使用無Ca2+的Hank's平衡鹽溶液作為稀釋劑，其具有抑制精子活化和優(yōu)化精子滲透壓的能力，有利于在冷凍前節(jié)省精子中的能量從而保持精子的質量(Dong et al , 2005a)。Ca2+被認為能夠誘導精子的頂體反應，并能導致精子凝集(Paniagua-Chavez et al, 1998)，但在棘皮動物精子冷凍保存研究中，人工海水或過濾自然海水作為稀釋劑已被廣泛應用(表1)，而其他成分的稀釋劑研究鮮有發(fā)表。棘皮動物的精子是能被自然海水激活的，這顯然違反了稀釋液需滿足抑制精子活力的性質。Gallego等(2014)分析了2種游泳者(河豚和歐洲鰻魚)和2種無柄者(海膽和海鞘)海洋物種的精子運動參數(shù)和形態(tài)特征。結果顯示，海膽等無柄者海洋物種的精子被激活后，精子活力能保持更長的時間(約45 min)；Fabbrocini等(2017)研究表明，海膽精子在激活后可保持1 h的高活力，并保持相對運動活力達24 h。實驗時，海水用量較少和精子激活后能維持較長時間的活力，可能是過濾自然海水或人工海水能夠作為棘皮動物精子冷凍保存稀釋劑的原因。但隨著棘皮動物精子在稀釋液中時間的延長，其質量會下降，在今后研究中，應繼續(xù)了解棘皮動物精子的激活機制，發(fā)掘具有更好冷凍保存效果的稀釋劑，從而延長精子的運動能力，提高冷凍保存后的精子質量。

2.3 抗凍劑的選擇

抗凍劑在精子超低溫冷凍保存中非常重要，如果精子在冷凍保存中沒有抗凍劑的保護，解凍后的精子質量極差，并可能呈粘稠狀，無應用價值?？箖鰟┌雌浯┩讣毎さ哪芰煞譃闈B透性抗凍劑(CPA)和非滲透性抗凍劑(co-CPA)(Dong et al, 2005b)。

2.3.1 滲透性抗凍劑 滲透性抗凍劑能夠快速穿透細胞膜，滲入細胞內部并與水和電解質結合，在細胞內產(chǎn)生一定的摩爾濃度，能夠降低細胞內外未結冰電解質溶液的濃度、降低冰點、減少冰晶的形成，同時，能避免細胞內水分過分滲出造成細胞皺縮，從而導致容積損傷(劉清華, 2005; 楊培民等, 2008)。常用的滲透性抗凍劑包括二甲基亞砜(DMSO)、甲醇(METH)、乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、二甲基乙酰胺(DMA)和甘油(GLY)等，其中，DMSO 被極廣泛應用于海洋魚類和無脊椎動物精液超低溫冷凍保存，這與DMSO 對精子的冷凍保護效果好且適用于大多數(shù)物種的精子有關(Liu et al, 2015; Shao et al, 2006)。同時，DMSO 也在棘皮動物精子冷凍保存中提供了良好的冷凍保護作用。DMSO 作用的最適濃度范圍一般是5%～20%，但Dunn 等(1973)研究發(fā)現(xiàn)，DMSO 在海星精子冷凍保存中的有效濃度范圍是20%～30%，這可能是由于海星新鮮精液中精子濃度比較低，需要更多DMSO 來起作用(表1)。不同濃度的EG、PG、METH、DMA 和二甲基甲酰胺(DMF)被用于棘皮動物精子冷凍保存研究，但其冷凍保護效果均不如DMSO (Shao

et al, 2006; 表1)。不同物種的精子具有特定的最適抗凍劑種類和濃度范圍，這與其物種特異性有關。例如，Behlmer 等(1984)研究發(fā)現(xiàn)，GLY 比DMSO 對鱟(Limulus polyphermus L.)的精液的保護效果更好；濃度為 10%的 GLY 也為羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)精子提供了更成功的冷凍保存結果(Akarasanon et al, 2004)。GLY 已更成功地應用于蝦、蟹精子的冷凍保存，可能是由于GLY 是蝦、蟹動物脂代謝中的天然中間產(chǎn)物(Jeyalectumie et al, 1989)。但是，GLY 卻對海星、海膽、鮑魚、牡蠣的精子具有毒害作用，濃度為5%～40%的GLY 能夠導致上述物種的精子活力在冷凍前急劇降低(Dunn et al, 1973)。PG 能有效保護牡蠣和海膽精子，但其效果不及DMSO(Asahina et al, 1978)。

2.3.2 非滲透性抗凍劑(co-CPA) 葡萄糖(GLU)、海藻糖(TRE)、蔗糖(SUC)、蛋黃(Yolk)、甘氨酸(Gly)、聚乙二醇(PEG)和胎牛血清(FBS)等co-CPA 在精液超低溫冷凍保存中也發(fā)揮著重要的作用。co-CPA 的添加被發(fā)現(xiàn)可顯著改善精子冷凍保存后的存活率，如胎牛血清的添加能夠促進日本珍珠貝(Pincetada f ucata martensii)精子解凍后的運動活力，可能與胎牛血清能減少冷凍過程中精子所受的滲透效應和離子效應以及增強精子抵抗冷凍損傷的能力有關(Kawamoto et al ,2007)。Acosta-Salmón 等(2007)研究表明，單獨使用海藻糖可達到與DMSO 組合使用時相似的解凍后的精子活力。添加1%或2%的葡萄糖顯著改善了解凍后澳洲綠邊鮑魚(Haliotis l aevigata)精子的受精率(Liu et al, 2014b)。此外，Liu 等(2014a、2014b)研究表明，甘氨酸在海洋軟體動物的精子冷凍保存中起著積極的作用，已被優(yōu)先選擇作為冷凍保護介質。Dong 等(2006)認為，co-CPA 具有冷凍保護效果，與其能在冷凍保存過程中控制溶質的流入和流出來穩(wěn)定精子膜有關，雞蛋黃的作用主要是與精子膜相互作用，在冷凍過程中可以防止膜上脂類相態(tài)的變化以保護精子免受冷休克損傷；單糖的作用主要是與膜上磷脂相互作用，可維持膜的穩(wěn)定性，促進細胞脫水，還能為精子的運動提供能量。

2.3.3 抗凍劑之間的組合 為達到更好的精子冷凍保存效果，通常會將CPA 與co-CPA 組合搭配使用。Jeyalectumie 等(1989)研究表明，海藻糖單獨用于鋸緣青蟹(Scylla serrata)精子冷凍保存時效果較差，而海藻糖與DMSO 組合使用時，解凍后精子的活力顯著增加。在虹鱒(Oncorhynchus m ykiss)、細須石首魚(Icropogonias undul atus)精液的低溫保存中發(fā)現(xiàn)，DMSO 與蔗糖或葡萄糖組合使用時，具有正協(xié)同保護效應(Gwo et al, 1991)。在棘皮動物精子超低溫冷凍保存中，關于co-CPA 以及CPA 與co-CPA 結合使用的研究相對較少(表1)。不同物種有其最適種類或濃度的CPA 和co-CPA，這一差別可能因為親本來源的地理位置不同，從而產(chǎn)生了精子相關特征的遺傳變異(Thurston et al, 2002; Dong et al, 2005b)。

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2.4 精液稀釋比例和平衡時間

適宜的稀釋比例和平衡時間對精子冷凍保存至關重要，在精子冷凍保存操作過程中，通常將冷凍保護液和精子按一定比例稀釋混合并平衡一段時間，以達到用最適數(shù)量的冷凍精子實現(xiàn)最優(yōu)冷凍保存結果的目的(Liu et al, 2015)。

2.4.1 稀釋比例 稀釋比例是指精子和冷凍保護液在冷凍容器中的混合比例。稀釋對精子冷凍保存非常重要，精子稀釋程度低可能會導致解凍后精子發(fā)生有害凝集，而精子稀釋程度高可能會導致精子能量的快速消耗、生理學改變以及精液中保護性成分減少，稀釋程度的不當均可導致精子凍存后生存能力的下降(Paniagua-Chavez et al, 1998; Dong et al, 2005a)。Liu等(2015)研究指出，通過自然排精收集的精子濃度較小，其在超低溫冷凍保存過程中的稀釋倍數(shù)也較小，最大稀釋倍數(shù)為1∶10。棘皮動物精子獲取方式多為解剖收取性腺，獲取精液的精子密度高，在超低溫冷凍保存過程中的稀釋倍數(shù)也較高。研究表明，棘皮動物精子冷凍保存最適的稀釋比例范圍是1∶3～1∶20 (Dunn et al, 1973; Asahina et al, 1978; Adams et al, 2004; Fabbrocini et al, 2014; Shao et al, 2006;Mizuno et al, 2019)。從不同個體性腺中取出新鮮精液的精子密度不同，若按照統(tǒng)一的稀釋比例進行實驗存在一定弊端，將精子稀釋至特定濃度更能優(yōu)化實驗方案。Dong等(2006、2007)將太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)精子稀釋至1×109個/ml，Liu等(2014b)將綠邊鮑魚精子濃度稀釋至1.6×108個/ml，更有效地開展、比較并優(yōu)化了精子冷凍保存的相關實驗方案。

2.4.2 平衡時間 平衡時間是指精子與冷凍保護液接觸混合至開始降溫的時間段，平衡時間過短導致抗凍劑不能充分的進入精子細胞膜或與細胞膜結合，不能發(fā)揮其抗凍保護的作用；平衡時間過長，抗凍劑的毒害作用會對細胞造成不可逆轉的損傷。在以往棘皮動物精子冷凍保存研究中，并沒有考慮平衡時間這一因素對冷凍后保存效果的影響，在實驗過程中，只設立了單一的平衡時間，沒有設置對比，Mizuno等(2019)研究表明，平衡時間必須少于3 min，有的研究設置平衡時間為6～10 min(Shao et al, 2006; Fabbrocini et al, 2014)，甚至為30 min (Dunn et al, 1973)。Zheng等(2018)選取珠母貝(Pinctada f ucata m artensii)為研究對象，研究了新鮮珠母貝精子在5種不同抗凍劑、5種濃度經(jīng)歷不同平衡時間作用后精子存活率的變化，并利用模型模擬提出了不同種類抗凍劑和不同抗凍劑濃度條件下應有的最大平衡時間，從而判定不同抗凍劑的毒性大小，并初步篩選排除出毒性大且不適用于精子冷凍保存的抗凍劑。

2.5 降溫速率和解凍速率

降溫速率和解凍速率亦對精子冷凍保存至關重要。降溫速率太慢、冷凍效率低，抗凍劑對細胞的毒性作用會加劇，細胞膜上的脂質分子在高濃度電解質溶液中時間太長也會遭受損傷；降溫速率太快，細胞膜外的結冰速率會高于細胞內的結冰速率，造成細胞膜外的溶質濃度和滲透壓比膜內越來越高，可能造成滲透休克和冰晶損傷、并對細胞產(chǎn)生不可逆影響。解凍速率太慢，重結晶現(xiàn)象會加劇冰晶對細胞膜和細胞器的機械損傷；解凍速率太快，對解凍操作要求高，需要在很短的時間內結束解凍，并且高溫可能會對細胞產(chǎn)生熱應激，造成不可逆影響(Liu et al, 2015)。因此，適宜的降溫速率和解凍速率可以最低限度的降低冷凍保存過程對細胞造成的損傷。

2.5.1 降溫速率 在精子超低溫冷凍保存研究中，控制降溫速率的方法可分為非程序兩步降溫法和程序降溫法。非程序兩步降溫法通常使用帶架子的泡沫聚苯乙烯盒子等工具。首先將樣品快速降到距液氮面某一高度處，停留一段時間，使細胞充分脫水以減少胞內冰晶的形成，然后，投入到液氮中長期保存。該方法通過調節(jié)樣品距液氮面的高度來控制冷凍速率，并通過熱電偶測其冷凍速率，具有設備成本低且易于現(xiàn)場操作的優(yōu)點。目前，棘皮動物精子超低溫冷凍保存相關研究均采用非程序兩步降溫法。例如，在對刺參精液的超低溫冷凍保存研究中，Shao 等(2006)通過控制樣品距液氮液面的高度(2、4、6 和8 cm)來調整降溫速率為-77、-52、-35 和-19℃/min，放置15 min后，立即投入液氮保存，發(fā)現(xiàn)當降溫速率為-35℃/min時，精子解凍后的受精率最高(70%)。同樣，Mizuno 等(2019)控制樣品距液氮液面的高度為(5～17.5 cm)來調整降溫速率為-5.2～-65℃/min，將樣品冷卻至-50℃后，立即投入液氮保存，發(fā)現(xiàn)當降溫速率為-10.4℃/min (距液氮液面高度15 cm)時，精子解凍后獲得最高的受精率為(89.8±1.7)%，與新鮮精子的受精率[(92.7±1.8)%]無顯著差異。對比不同的棘皮動物精子冷凍保存的研究發(fā)現(xiàn)，同樣運用非程序兩步降溫法，不同研究得出的最適降溫速率差異較大，如-5、-20 和-50℃/min。Dunn等(1973)和Asahina 等(1978)的研究均表明，適合海膽精子的降溫速率約為-5℃/min，而Adams 等(2004)通過實驗對比卻發(fā)現(xiàn)，降溫速率-50℃/min 對海膽精子的冷凍效果明顯比-5℃/min 效果好，其中的原因有物種及其生存環(huán)境的差異，也有研究所使用的降溫裝置及冷凍容器的不同。

程序降溫法指通過程序降溫儀等儀器預先設計的冷凍程序來控制樣品的冷凍速率，然后將樣品投入液氮中保存。此種方法操作簡單、能精確控制并靈活改變降溫速率及平衡時間，有利于深入研究降溫速率對精子冷凍保存的影響，但儀器較為昂貴，方法不易普及。程序降溫法在海洋魚類和軟體動物精子冷凍保存研究中有使用，但在棘皮動物中并未使用。作者認為應將程序降溫法和非程序兩步降溫法結合使用，通過程序降溫法找到合適的降溫速率及降溫終點溫度，并以此設計適合的裝置，通過非程序兩步降溫法在實驗室或養(yǎng)殖場驗證與應用。

2.5.2 解凍速率 Liu 等(2015)在海洋軟體動物精子冷凍保存的解凍溫度分為3 個范圍：低溫(＜29℃)、中溫(30℃～49℃)和高溫(＞50℃)。按照此標準，以往棘皮動物精子冷凍保存研究的解凍溫度屬于中低溫度，解凍溫度從室溫、15℃～45℃水浴不等(Dunn et al,1973; Asahina et al, 1978; Adams et al, 2004; Fabbrocini

et al, 2014; Shao et al, 2006; Mizuno et al, 2019)。解凍操作的一般步驟為將樣品從液氮中取出，置于特定溫度水浴解凍，輕輕搖動使溫度均勻，待只剩少量固體時立即取出，在空氣中繼續(xù)搖動使其完全融化。作者認為適合某一物種精子冷凍保存的解凍溫度應模擬其自然排精、受精時的溫度，既保證了有合適的解凍速率，又能保證解凍溫度不會對精子產(chǎn)生溫度應激。本團隊實驗結果顯示，解凍溫度為20℃、37℃和50℃對刺參冷凍保存精子解凍后的活力影響不顯著(P＞0.05，未發(fā)表數(shù)據(jù))，這與Anchordoguy 等(1988)研究中不同解凍溫度對海蝦(Sicyonia i ngentis)冷凍保存精子活力影響的結果相似。但利用受精溫度作為解凍溫度可能會影響解凍的速率，從而造成解凍時的反玻璃化和重結晶等冷凍損傷。目前，仍缺乏能夠為棘皮動物乃至整個水生物種精子的冷凍保存選擇合適解凍溫度的理論，解凍過程應當成為以后研究的重點。

2.6 精子質量評價

冷凍精子經(jīng)解凍后應對其質量進行評價，評價精子質量的參數(shù)包括運動活力、形態(tài)變化、受精率、孵化率、細胞器完整性及代謝機能(圖1)。對冷凍精子進行全面系統(tǒng)的質量評價，并對比新鮮精子的相關參數(shù)，有利于進一步研究冷凍保存對精子的損傷機制。

2.6.1 運動活力和形態(tài)變化 冷凍精子運動能力測試與前述新鮮精子的運動能力測試相一致，一般有使用光學顯微鏡統(tǒng)計樣本中運動精子的百分比來直接測量和通過CASA 系統(tǒng)測量2 種方式，近幾年，CASA 系統(tǒng)由于其較高的準確性和效率而被廣泛應用(van der Horst et al, 2018)。眾多棘皮動物精子冷凍保存研究中并未使用CASA 系統(tǒng)對冷凍保存后的精子進行活力檢測，但Fabbrocini 等(2017)利用CASA系統(tǒng)的特定分析模型對海膽(Paracentrotus li vidus)的新鮮精子激活后不同時間的運動參數(shù)進行了詳細評估，評估的精子運動參數(shù)包括精子存活率(TM，活動精子數(shù)占總精子數(shù)的百分比)、活力(RAP，快速前向運動精子占總精子數(shù)的百分比)、密度、存活時間、平均曲線運動速度(VCL, μm/s)、平均直線運動速度(VSL, μm/s)、平均路徑速度(VAP, μm/s)、鞭打頻率(BCF)、頭部的側擺幅度(ALH)等，并提出使用濃度為0.05%的胎牛血清(BSA)作為抗粘劑。該研究表明，海膽精子在激活后可保持1 h 的高活力，并保持相對運動活力達24 h，比大多數(shù)魚類精液稀釋激活后保持高活力的時間更長，不需要抑制活力的過程。Fabbrocini 等(2017)的研究為CASA 系統(tǒng)在棘皮動物精子冷凍保存研究中的使用奠定基礎，為棘皮動物激活后的精子在實驗室研究中的應用提供數(shù)據(jù)支持。

對冷凍精子進行精子形態(tài)評估時，傳統(tǒng)上是通過掃描或透射電子顯微鏡觀察精子頭部、中段、尾巴、頂體、線粒體和細胞核的變化。觀察結果為了解冷凍保存對精子結構上的損傷提供了有效信息(Espinoza et al, 2010)。此外，CASA 系統(tǒng)中的輔助形態(tài)分析模塊還可協(xié)助區(qū)分精子的形態(tài)測量特性，進而提供有關精子冷凍保存后形態(tài)學變化及冷凍耐受能力的信息。目前，該技術已應用于山羊(Gravance et al, 1995)，歐洲鰻魚(Asturiano et al, 2007)和鹿(Esteso et al, 2009)等物種，但不適用于海洋軟體動物，其對棘皮動物是否適用有待研究。

2.6.2 受精率和孵化率 受精率和孵化率的檢測，指測量精子與成熟卵子結合產(chǎn)生受精卵并正常發(fā)育的能力，是精子冷凍保存技術的關鍵步驟。冷凍精子的濃度以及精子與卵子的比率對于成功受精至關重要，較低或較高的濃度和精卵比都會影響受精率。冷凍保存后，大多數(shù)精子的頂體和質膜已經(jīng)受損，受精能力顯著降低(Kurokura et al, 1990; Bury et al, 1993)。Kurokura 等(1989)研究表明，冷凍后的海膽精子只有5%～12%在形態(tài)上是正常的。Kurokura 等(1990)研究表明，經(jīng)冷凍后的牡蠣精子由于頂體被破壞，喪失了進入卵子的能力，精子聚集，導致受精率下降。冷凍保存精子的受精能力低于新鮮精子的受精能力，因此，受精實驗中需要增加冷凍精子的數(shù)量。Adams等(2004)對海膽新鮮精子和冷凍精子的研究表明，為獲得最大的受精率，所需新鮮精子濃度約為105/ml(卵子與精子的比例為1∶1000)，而冷凍精子則至少需要106/ml 的濃度(卵子與精子的比例為1∶10000)。Shao 等(2006)也得到了同樣的結果，其研究結果顯示，刺參卵子與冷凍精子的比例為1∶10000 時的受精率顯著高于二者比例為 1∶1000 時的受精率(P＜0.05)。

2.6.3 流式細胞術與細胞器完整性 電鏡觀察精子形態(tài)和受精率、檢查精子活力等評估步驟執(zhí)行較緩慢，相比較而言，流式細胞術具有在短時間內評估多個精子參數(shù)的優(yōu)點。通過流式細胞儀和熒光顯微鏡，可對冷凍前后精子的質膜(SYB/PI 染色，PMI)、線粒體膜電位[羅丹明123/碘化丙錠(PI)染色，MMP]、頂體(DND/PI 染色，AI)和DNA(AO 染色)等的完整性或損傷比例進行測定。如PI 不能通過活細胞膜，只可透過受損的細胞膜對細胞核染色(呈紅色)，羅丹明123 只可使線粒體功能完整的精子細胞著色(呈綠色)，因此，通過羅丹明123/PI 2 種染料進行熒光雙染色及流式細胞儀觀察，可檢測冷凍解凍后精子膜和線粒體結構及功能的損傷狀況(Adams et al, 2003)。Adams 等(2004)利用流式細胞術比較了海膽精子在凍前凍后的細胞膜完整性和線粒體功能的變化情況，研究表明，較高濃度的DMSO 在保留精子線粒體功能和膜完整性方面更為有效，但精子的線粒體功能和膜完整性對凍前凍后不同海膽個體精子間的受精能力基本無影響。

2.6.4 代謝機能 精液經(jīng)超低溫保存后，由于膜的損傷會導致精子內的酶滲漏到細胞外，而導致胞內酶的活性降低，精漿中酶的活性卻大大提高。超低溫保存還會導致細胞內ATP 水平的變化。冷凍前后精液中酶活性及水平的分析測定，不僅是評價低溫保存成功與否的重要指標，也是用來確定細胞損傷部位、研究損傷機理的有效途徑(Chauhan et al, 1994)。如果參與三羧酸循環(huán)的有關的酶活性降低并伴有水平的下降，則說明為精子提供能量的場所——線粒體受到損傷。常檢測的酶主要有琥珀酸脫氫酶(SDH)、乳酸脫氧酶(LDH)、Na+/K+-ATP 酶、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氧酶(CAT)與谷胱甘肽還原酶(GR)等?，F(xiàn)有的棘皮動物精子冷凍保存研究中尚未提及冷凍前后精子代謝機能的變化情況，下一步應借鑒魚類精子冷凍保存方面的類似研究，將該指標納入棘皮動物精子冷凍前后質量評價體系。

3 總結與展望

綜上所述，精子超低溫冷凍保存技術已廣泛應用于人類輔助生殖、畜牧和水生經(jīng)濟動物育種中。棘皮動物精子冷凍保存的研究內容相對滯后，此類研究中精子收集常用的方法是解剖獲取性腺法；常用的稀釋劑和抗凍劑分別為海水和DMSO；平衡時間、稀釋比例、降溫速率和解凍溫度等因素在篩選過程中因實驗條件不同而呈現(xiàn)多種結果。應繼續(xù)借鑒魚類、軟體動物精子的超低溫冷凍保存技術，不斷豐富人們對超低溫冷凍保存技術作用原理的認識，同時，根據(jù)棘皮動物精子自身的特點，重點研究稀釋劑的選擇、解凍過程和產(chǎn)業(yè)化應用等內容?；谏鲜黾游锞永鋬霰４嫜芯窟M展，提出以下待解決的問題和建議。

3.1 獲取高質量的新鮮精子

高質量的新鮮精子是冷凍保存成功的先決條件，在進行超低溫冷凍保存前，應保證所用新鮮精子具有低溫冷凍價值。為解決這個問題，應建立一系列評價指標，在精子冷凍保存前，統(tǒng)計不同親本個體的性腺指數(shù)、體重和年齡等參數(shù)，并檢測新鮮精子的各項運動參數(shù)；用相同的冷凍保存技術流程對上述來自同物種不同個體的精子進行冷凍保存，并對冷凍保存的精子進行質量評價；將冷凍前親本的性狀參數(shù)及精子的運動參數(shù)與其相對應的冷凍保存精子質量評價結果相關聯(lián)，篩選影響精子冷凍后質量的關鍵參數(shù)，做到從表型數(shù)據(jù)或新鮮精子的運動參數(shù)就能選擇出高質量的精子。

3.2 開發(fā)新型抗凍劑

抗凍劑在冷凍保存技術中發(fā)揮著至關重要的作用，相對來說，DMSO 是目前最符合“低毒、高效”標準的抗凍劑，即使在低濃度下也能提高膜對ATP的滲透能力(Gironi et al, 2020)。應不斷深入研究各種抗凍劑的保護機制，根據(jù)抗凍劑的保護原理及抗凍劑具備的生化特性，開發(fā)具備低毒、高效特點的新型抗凍劑，為規(guī)范化超低溫冷凍保存提供更多的選擇。

3.3 優(yōu)化超低溫冷凍保存技術流程

超低溫冷凍保存技術中每一種參數(shù)的篩選是相對繁瑣的工作，如果對每一物種都進行重復的工作，費時費力。應不斷加強相關的理論研究，如超低溫冷凍對精子的損傷機制、抗凍劑對精子的保護機制、稀釋劑抑制精子活力原理和精子激活機制等，在此基礎上針對每一物種精子的特性，直接選擇最適的稀釋劑、滲透性抗凍劑、非滲透性抗凍劑，并設計最適的降溫程序及解凍程序。

3.4 精子超低溫冷凍保存技術原理的拓展和應用

種質資源不僅只有精子，還包含卵子和胚胎等。應將精子冷凍保存技術的原理和經(jīng)驗與卵子和胚胎相關方面的原理和經(jīng)驗相結合，不斷豐富超低溫冷凍保存原理，并應用于生產(chǎn)實踐，建立種質資源庫。棘皮動物的卵子和胚胎能否有效冷凍？冷凍精子和冷凍卵子受精后，受精率和孵化率如何？通過冷凍整個性腺得到冷凍的精(卵)母細胞解凍后能否培養(yǎng)為成熟精(卵)子并有效應用？這一系列問題均有待解決。相信隨著科學技術的發(fā)展，研究方法和手段的不斷更新，超低溫冷凍保存技術會越來越成熟，棘皮動物種質資源會得到有效的保護，可持續(xù)地為全人類提供更多優(yōu)質蛋白質和皂苷等營養(yǎng)物質。