黃海藝, 趙月明, 武曉亮, 陳珍珍, 許永玉,*

(1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 山東泰安 271018; 2. 泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 山東泰安 271000)

中華通草蛉Chrysoperlasinica在我國分布范圍廣、捕食量大、繁殖力強(qiáng)、發(fā)生期長，具有重要的生防價值。為發(fā)揮其生防優(yōu)勢，大規(guī)模工廠化繁殖及人工田間釋放是十分必要的。滯育是昆蟲生長、發(fā)育、繁殖的靜止?fàn)顟B(tài)，是昆蟲應(yīng)對不利環(huán)境條件適應(yīng)和選擇的重要生理對策(Tauberetal., 1986; Danks, 2002)。中華通草蛉為多化性昆蟲，在自然界中以成蟲兼性滯育越冬，滯育的誘導(dǎo)與解除具有一定的可塑性。前期研究發(fā)現(xiàn)，短光周期處理成蟲即可誘導(dǎo)中華通草蛉滯育而導(dǎo)致成蟲歷期的延長(Chenetal., 2017)。短光周期處理的中華通草蛉活動能力較弱，取食較少，種群抗逆能力較強(qiáng)，這對于天敵昆蟲的長期存儲研究是有意義的。許多昆蟲滯育的解除需要嚴(yán)格的外界條件或需花費一定的時間(Ko?táletal., 2000; 徐衛(wèi)華, 2008; 陳珍珍等, 2013b, 2013c)。與非滯育成蟲相比，中華通草蛉需要相對較長時間的長光照處理才能解除滯育恢復(fù)產(chǎn)卵。因此，在實際應(yīng)用中，根據(jù)生產(chǎn)和科研的需要，如何調(diào)控成蟲滯育的快速解除過程，是利用滯育成蟲來進(jìn)行長期存儲應(yīng)用中亟待解決的關(guān)鍵問題。

保幼激素(juvenile hormone, JH)可刺激滯育雌、雄成蟲的生殖發(fā)育，外源JH的使用抑制多數(shù)昆蟲的生殖滯育(Herman and Dallmann, 1981; Eizaguirreetal., 1998; Watanabe and Tanaka, 2000)。目前國內(nèi)外有關(guān)JH的代謝、合成、測定及分子作用機(jī)制的研究相對較成熟(李勝等, 2004; 嵇保中等, 2007; 劉艷等, 2007; 周樹堂等, 2012)，對生殖發(fā)育的調(diào)控也有較多報道(Lietal., 2011; Shengetal., 2011)。許多學(xué)者研究均發(fā)現(xiàn)，JH或JH類似物處理滯育成蟲均能引起成蟲滯育的終止及雌成蟲產(chǎn)卵期的提前(Kidokoroetal., 2006; Choetal., 2007)，且RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用更加明確了JH對昆蟲生殖發(fā)育過程中的促進(jìn)作用(Kangetal., 2014; Smykaletal., 2014; Luoetal., 2017)。這說明利用外源JH刺激可調(diào)控成蟲滯育解除的過程。Okuda等(1996)的研究還發(fā)現(xiàn)，一定量的JH類似物處理蝗蟲成蟲會促進(jìn)其生殖系統(tǒng)的發(fā)育，而超量的JH則會抑制成蟲生殖系統(tǒng)的發(fā)育，說明JH使用量、使用時期不同均會誘導(dǎo)昆蟲產(chǎn)生不同的生理響應(yīng)。

本研究通過點滴外源JH誘導(dǎo)中華通草蛉滯育解除，觀察對其滯育后發(fā)育的影響，為進(jìn)一步從根本上解決中華通草蛉滯育解除時間長、生殖發(fā)育恢復(fù)較慢的難題，使滯育解除不再是滯育蟲態(tài)存儲利用中的制約因素，同時也為其他天敵昆蟲的存儲及應(yīng)用研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試蟲選擇及滯育判斷標(biāo)準(zhǔn)

中華通草蛉自然越冬成蟲于10月中旬開始進(jìn)入滯育(牟吉元等, 1980)，通過解剖觀察卵巢發(fā)育級別判斷11月中旬幾乎所有成蟲個體均進(jìn)入深度滯育(許永玉等, 2002)。根據(jù)許永玉等(2002)的研究結(jié)果，中華通草蛉的成蟲體色由滯育型土黃色變?yōu)榉菧途G色并開始產(chǎn)卵，表明成蟲已解除滯育。

實驗用中華通草蛉越冬滯育成蟲于10月份網(wǎng)捕于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)大葉黃楊Buxusmegistophylla上。采集的成蟲置于罐頭瓶(高11 cm，直徑9 cm) 中，用紗布封口。一部分置于室外人工棚內(nèi)自然越冬，另一部分置于溫度25±1℃、相對濕度60%±5%、光周期15L∶9D的人工氣候室(RSZ智能人工氣候室，江蘇常州國華)飼養(yǎng)，連續(xù)飼養(yǎng)3代后建立穩(wěn)定室內(nèi)種群。成蟲飼喂啤酒酵母干粉飼料[ 將啤酒酵母干粉和蔗糖按10∶8的比例(v/v)混合，用研缽研細(xì)后過60目篩制成]和10%蜂蜜水。

1.2 不同劑量的外源JH處理對中華通草蛉自然越冬種群滯育后發(fā)育的影響

于11月15日隨機(jī)選取室外人工棚內(nèi)體色均為土黃色且體形、大小基本一致的中華通草蛉成蟲，手持微量點滴器點滴不同劑量(5, 15, 25和35 μg/成蟲)的外源JH 1 μL于中華通草蛉雌成蟲腹部第3節(jié)背面，當(dāng)前實驗劑量下中華通草蛉成蟲存活率為100%。外源JH購買于多倫多研究化學(xué)公司(Toronto Research Chemicals，產(chǎn)品目錄號E589400，純度95%)，用丙酮(純度為90%～95%)稀釋成不同濃度。對照(CK)只點滴丙酮。點滴后的雌、雄成蟲單頭配對放入罐頭瓶內(nèi)，置于溫度25±1℃、相對濕度60%±5%、光周期15L∶9D的人工氣候室(RSZ智能人工氣候室，江蘇常州國華)飼養(yǎng)，每日檢查記錄成蟲的存活情況、產(chǎn)卵前期、產(chǎn)卵歷期、產(chǎn)卵量和雌成蟲壽命，每處理15對成蟲。參照陳珍珍等(2013a)的方法，產(chǎn)卵前期是指從開始處理至成蟲開始產(chǎn)卵的時間即滯育解除需要的時間；產(chǎn)卵歷期是從開始產(chǎn)卵至產(chǎn)卵結(jié)束的時間；雌成蟲壽命是指從開始處理至處理成蟲死亡的時間。

1.3 外源JH處理不同日齡中華通草蛉滯育成蟲對其滯育后發(fā)育的影響

收集中華通草蛉連續(xù)飼養(yǎng)3代后建立穩(wěn)定室內(nèi)種群卵，置于溫度25±1℃、相對濕度60%±5%、光周期9L∶15D的光照培養(yǎng)箱內(nèi)(LRH-150-G光照培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠)飼養(yǎng)。幼蟲飼養(yǎng)方法參照Chen等(2017)，幼蟲孵化后單頭置于指形管中，在相同的環(huán)境條件下飼喂新鮮豆蚜Aphiscraccivora直至化蛹。成蟲羽化后單頭配對于罐頭瓶中并置于9L∶15D的光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)飼養(yǎng)。分別于成蟲羽化后第0, 5， 10, 20, 30和40天(即0, 5， 10, 20, 30和40日齡滯育成蟲)，手持微量點滴器點滴15 μg/成蟲外源JH于中華通草蛉雌成蟲腹部背面，以未點滴外源JH的相同滯育誘導(dǎo)時間的成蟲為對照。后轉(zhuǎn)于溫度25±1℃、相對濕度60%±5%、光周期15L∶9D的人工氣候室(RSZ智能人工氣候室，江蘇常州國華)，每日檢查記錄成蟲的存活情況、產(chǎn)卵前期、產(chǎn)卵歷期、單雌產(chǎn)卵量和雌成蟲壽命。每處理重復(fù)15對成蟲。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用統(tǒng)計軟件SPSS19.0對試驗所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，獲得平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤。所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)；對不同處理間的差異進(jìn)行Tukey氏HSD多重比較分析，兩組數(shù)據(jù)之間的差異性比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量的外源JH處理對中華通草蛉成蟲滯育解除及滯育后發(fā)育的影響。

隨著外源JH處理劑量的提高，成蟲產(chǎn)卵前期呈先下降后上升的變化趨勢(圖1: A)。對照組產(chǎn)卵前期最長，為11.55±0.78 d，點滴外源JH的處理組其產(chǎn)卵前期均顯著短于對照組[F(4,70)=7.809;P<0.001]，其中15和25 μg/成蟲JH處理組產(chǎn)卵前期最短，分別為6.43±0.31 d和6.29±0.35 d。與對照組相比，點滴外源JH處理能顯著加快滯育解除速度。

圖1 不同劑量的外源保幼激素處理對中華通草蛉滯育成蟲產(chǎn)卵前期(A)、產(chǎn)卵歷期(B)、雌蟲壽命(C)和單雌產(chǎn)卵量(D)的影響Fig. 1 Effects of different doses of exogenous juvenile hormone (JH) on the pre-oviposition period (A), oviposition duration (B),female longevity (C) and number of eggs laid per female (D) of diapause adults of Chrysoperla sinica CK: 點滴丙酮對照Topical application of acetone as the control. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同字母代表不同劑量處理間在0.05水平上差異顯著(P<0.05, Tukey氏HSD多重比較)。Data in the figure are means±SE. Different lowercase letters above bars indicate significant differences between different treatment doses (P<0.05, Tukey’s HSD test).

成蟲產(chǎn)卵歷期則隨著外源JH點滴劑量的增加，呈先升高后下降的趨勢(圖1: B)。除35 μg/成蟲處理組外，其他濃度外源JH處理組產(chǎn)卵歷期均顯著長于對照組[F(4, 62)=5.500;P<0.001]。15 μg/成蟲處理組產(chǎn)卵歷期最長，為72.47±5.76 d；對照組產(chǎn)卵歷期最短，為37.78±3.84 d。15 μg/成蟲外源JH處理中華通草蛉產(chǎn)卵歷期比對照組約延長1.94倍。

雌蟲壽命隨著外源JH點滴劑量的增加，呈先升高后下降的趨勢(圖1: C)。15 μg/成蟲JH處理組雌蟲壽命最長，為85.47±6.11 d， 35 μg/成蟲JH處理組雌蟲壽命最短，為44.7±7.07 d。15 μg/成蟲JH處理組的雌蟲壽命顯著長于對照和35 μg/成蟲JH處理組[F(4, 67)=5.586;P<0.001]。與對照相比，15 μg/成蟲外源JH處理的中華通草蛉雌蟲壽命延長了約30%。

隨著外源JH點滴劑量的增加，成蟲單雌產(chǎn)卵量呈先升高后降低的變化趨勢(圖1: D)。15 μg/成蟲JH處理組產(chǎn)卵量最多，為327.82±6.11粒；對照組產(chǎn)卵量最少，為153±4.16粒。15 μg/成蟲JH處理組產(chǎn)卵量顯著高于對照組和35 μg/成蟲外源JH處理組[F(4, 64)=3.932;P=0.006]。與對照組相比，15 μg/成蟲JH處理組的產(chǎn)卵量增加了約113.72%；35 μg/成蟲JH處理組產(chǎn)卵量與對照組比較無顯著差異(P=1.000)。

2.2 外源JH處理對不同日齡中華通草蛉滯育成蟲滯育后發(fā)育的影響

與作對照的未經(jīng)外源JH處理的中華通草蛉成蟲相比，點滴15 μg/成蟲外源JH處理的中華通草蛉滯育成蟲的產(chǎn)卵前期顯著縮短，即滯育解除速度顯著加快(圖2: A)。處理滯育成蟲日齡為0, 5, 10和20日齡時，處理組與對照組產(chǎn)卵前期均有極顯著性差異(0日齡:t=5.452,df=27,P<0.001; 5日齡:t=4.576,df=38,P<0.001; 10日齡:t=5.186,df=22,P<0.001; 20日齡:t=8.390,df=19,P<0.001)。處理日齡為20日齡時，外源JH處理組的產(chǎn)卵前期比對照組縮短11 d，縮短約70%。

未經(jīng)外源JH處理的對照組中華通草蛉滯育成蟲的產(chǎn)卵歷期隨著處理日齡的增加呈逐漸下降趨勢(圖2: B)。15 μg/成蟲外源JH處理組的產(chǎn)卵歷期隨著處理日齡的增加，先升高后下降。處理日齡為0日齡時，處理組的產(chǎn)卵歷期極顯著短于對照組(t=3.524,df=33,P=0.001)，其他日齡則外源JH處理組和對照組間無顯著性差異(5日齡:t=1.522,df=36,P=0.137; 10日齡:t=0.261,df=31,P=0.796; 20日齡:t=0.253,df=34,P=0.802; 30日齡:t=2.106,df=32,P=0.053; 40日齡:t=1.081,df=30,P=0.288)。

未經(jīng)外源JH處理的對照組中華通草蛉滯育雌成蟲壽命隨著處理日齡的增加，呈先下降后上升再下降趨勢(圖2: C)。15 μg/成蟲外源JH處理組的雌蟲壽命隨著處理日齡的增加，先升高后下降。處理日齡為0日齡時，處理組的雌蟲壽命極顯著短于對照組(t=3034,df=33,P=0.004);處理日齡為5日齡和40日齡時，處理組的雌蟲壽命極顯著長于對照組(5日齡:t=-3.380,df=39,P=0.001; 40日齡:t=-3.270,df=31,P=0.002)；其余日齡處理組和對照組間雌蟲壽命無顯著性差異(10日齡:t=0.012,df=31,P=0.0.991; 20日齡:t=0.237,df=34,P=0.814; 30日齡:t=0.708,df=32,P=0.484)。

單雌產(chǎn)卵量均隨著處理日齡的增加，呈先上升后下降趨勢(圖2: D)。除了0日齡，其余日齡的15 μg/成蟲外源JH處理組產(chǎn)卵量均顯著低于對照組(5日齡:t=2.357,df=23,P=0.026; 10日齡:t=2.686,df=23,P=0.013; 20日齡:t=2.381,df=23,P=0.025; 30日齡:t=3.568,df=24,P=0.001; 40日齡:t=2.255,df=28,P=0.032)。

3 討論

3.1 JH對昆蟲滯育解除的促進(jìn)作用

JH信號調(diào)節(jié)短光周期誘導(dǎo)的昆蟲冬季的生殖滯育(Denlinger and Armbruster, 2014)。前人研究發(fā)現(xiàn)，在滯育誘導(dǎo)期滴加外源JH可推遲昆蟲進(jìn)入滯育，已經(jīng)進(jìn)入滯育的昆蟲點滴外源JH，可以暫時解除昆蟲滯育，并促進(jìn)卵巢發(fā)育恢復(fù)生殖(Denlingeretal., 2012; 高俏等, 2018)。本研究發(fā)現(xiàn)，點滴外源JH對中華通草蛉滯育的解除有一定的促進(jìn)作用，且滯育解除的速度(產(chǎn)卵前期)隨著劑量增大逐漸加快，表現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)(圖1)。對馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata處理也發(fā)現(xiàn)了相似的變化趨勢，即不同滯育深度的馬鈴薯甲蟲點滴JH及其類似物后轉(zhuǎn)入長光照下，相對于對照組顯著縮短了產(chǎn)卵前期，且滯育解除率隨著劑量增大而增大(Schooneveldetal., 1977)。同樣地，給滯育的三帶喙庫蚊Culextritaeniorhynchus成蟲和黃蛺蝶Polygoniacaureum點滴外源JH或類似物烯蟲酯(methoprene)，均能夠能刺激雌蟲卵巢發(fā)育并促進(jìn)滯育解除(王瑜等, 1994; Hiroyoshietal., 2017)。不同劑量外源JH點滴處理后，綜合產(chǎn)卵前期、產(chǎn)卵歷期、單雌產(chǎn)卵量和雌蟲壽命研究結(jié)果， 15 μg/成蟲的外源JH劑量是深度滯育的中華通草蛉自然越冬種群快速解除滯育的最佳劑量。此時滯育解除最快，產(chǎn)卵量最高，成蟲壽命和產(chǎn)卵歷期最長。

對不同滯育時期的麗蠅Melindapusilla點滴JH類似物烯蟲酯，相同的劑量下越冬滯育維持時期使用，短暫促進(jìn)卵巢發(fā)育但不形成成熟卵，而在越冬滯育解除時使用超過80%個體開始產(chǎn)卵，說明外源JH在不同滯育時期促進(jìn)滯育解除的作用是不一樣的(Aguietal., 1991)。中華通草蛉屬短日照滯育型，光周期是誘導(dǎo)滯育的主要因素，成蟲是滯育誘導(dǎo)的敏感蟲態(tài)，在光周期為9L∶15D的短光周期條件下誘導(dǎo)，滯育率為100%(Xuetal., 2004)。在前期研究中，短光周期下飼養(yǎng)的中華通草蛉成蟲均出現(xiàn)明顯的滯育表型和生殖延遲，即短光周期誘導(dǎo)的中華通草蛉種群均可進(jìn)入滯育(Chenetal., 2017)。滯育強(qiáng)度通常用給定的條件下結(jié)束滯育所需要的時間表示(Danks, 1987)。本研究發(fā)現(xiàn)，中華通草蛉在25℃短光周期處理條件下，20日齡滯育成蟲處理組產(chǎn)卵前期最長，說明此時程度最深；其次，超過30日齡的滯育成蟲，未點滴外源JH的對照組和點滴外源JH處理組都出現(xiàn)產(chǎn)卵前期急劇下降(圖2: A)，說明已經(jīng)由深度滯育轉(zhuǎn)為逐漸解除滯育；最后，不同日齡的滯育成蟲點滴外源JH對中華通草蛉的滯育解除均有一定的促進(jìn)作用，且20日齡滯育成蟲產(chǎn)卵前期縮短11 d(縮短了約70%)(圖2: A)。

3.2 JH對昆蟲生殖的調(diào)節(jié)作用

昆蟲在性成熟過程中遇到的外源或者內(nèi)源激素的變化對成蟲均有較大的影響(Gruntenkoetal., 2010)。用JH或類似物烯蟲酯處理的雄性果蠅，促進(jìn)其釋放性信息素并在較年輕時交配，說明JH控制生殖成熟和性信號傳導(dǎo)(Tealetal., 2000)。前人研究還發(fā)現(xiàn)，JH對發(fā)育中的神經(jīng)回路的建模有直接影響(Malaterreetal., 2003)，對蜜蜂的研究也表明，JH對發(fā)育成熟的成蟲行為所需的神經(jīng)可塑性很重要(Fahrbach and Robinson, 1996)。本研究中，初羽化成蟲立即雌雄配對放入一個罐頭瓶中，然后對其進(jìn)行不同時間的短光周期誘導(dǎo)滯育處理，點滴外源JH后顯著縮短了其產(chǎn)卵前期，在此過程中是否由于JH含量的增加觸發(fā)了其雌、雄交配行為提前而導(dǎo)致的生殖提前，還需要進(jìn)一步證實。

JH是引發(fā)卵巢發(fā)育及卵黃發(fā)生所必需的，但也有一定的劑量效應(yīng)。隨著JH點滴劑量的增加，成蟲產(chǎn)卵量呈先升高后下降的變化趨勢，且以15 μg/成蟲的處理組產(chǎn)卵量最多，顯著高于對照組(圖1: D)，說明適宜劑量的外源JH處理可刺激昆蟲生殖能力的提高。利用JH類似物處理昆蟲同樣證明了這一點，低劑量的苯氧威(fenoxycarb)處理紅蝽Dysdercussimilis促進(jìn)卵黃生成增加，高劑量處理則抑制卵黃生成和絨毛膜形成，導(dǎo)致卵母細(xì)胞萎縮(Govind, 2014)，利用蚊蠅醚處理西方蜜蜂Apismellifera工蜂也會出現(xiàn)低濃度可導(dǎo)致卵黃原蛋白Vg在血淋巴中的發(fā)生和積累，而高濃度可抑制Vg蛋白的合成的現(xiàn)象(Pintoetal., 2000)。JH類似物(JHA)對滯育的大猿葉甲Colaphellusbowringi成蟲的卵巢發(fā)育有明顯的促進(jìn)作用(Liuetal., 2016)。外源JH處理不同日齡的中華通草蛉滯育成蟲，其產(chǎn)卵量相對于未點滴外源JH處理的中華通草蛉顯著降低(圖2: D)。從點滴15 μg/成蟲外源JH的成蟲產(chǎn)卵量顯著高于對照的結(jié)果來看，可能是由于處理不同日齡的對照組未點滴丙酮作為對照，說明丙酮對于中華通草蛉有一定的毒性，在使用過程中應(yīng)換其他的方法對JH進(jìn)行稀釋。但通過生殖力變化趨勢可以發(fā)現(xiàn)，滯育誘導(dǎo)20 d之前解除滯育其生殖能力較高，甚至高于對照未經(jīng)滯育誘導(dǎo)的成蟲，而20 d之后則生殖力開始下降，證明了短時間的滯育誘導(dǎo)可提高其成蟲的生殖能力。

Medina等(2003a, 2003b)的研究結(jié)果表明，田間最大劑量的JH類似物(蚊蠅醚)處理普通草蛉Chrysoperlacarnea發(fā)現(xiàn)，雖然其對成蟲生命力和產(chǎn)卵力沒有影響，但在雌蟲卵黃沉積時處理則會影響其幼蟲孵化率。因此，雖然我們研究了點滴JH對中華通草蛉滯育后發(fā)育的影響，但JH是否影響中華通草蛉滯育后的卵質(zhì)量、卵孵化率和子代發(fā)育等，這些工作需要進(jìn)一步展開。而在天敵保育方面中，本研究結(jié)果解決了中華通草蛉滯育解除耗費時間長的瓶頸問題，為成蟲滯育天敵的高效存儲利用與滯育的快速解除提供了新思路。

3.3 結(jié)論

綜合考慮對生殖能力各項指標(biāo)和雌蟲壽命的影響，認(rèn)為15 μg/成蟲的外源JH劑量是中華通草蛉滯育快速解除的最佳使用劑量。最佳使用時期為滯育20 d的成蟲，此時點滴外源JH對中華通草蛉成蟲滯育解除后的生殖能力影響最小。