史芳瑜 徐全曉 賀利民 楊 衛(wèi)

1 河南省南陽(yáng)市第一人民醫(yī)院 473000； 2 河南省腫瘤分子生物學(xué)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

腎透明細(xì)胞癌(RCC)是泌尿系統(tǒng)中較為常見的惡性腫瘤，占腎臟原發(fā)性腫瘤的85%～90%，據(jù)中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)(CSCO)于2017年統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，我國(guó)腎癌發(fā)病率近年來呈快速遞增趨勢(shì)，總體發(fā)病率為3.35/10萬(wàn)人，其中男女比例為2∶1，75～80歲人群發(fā)病者達(dá)到高峰，為14.7/10萬(wàn)人，嚴(yán)重威脅人類的健康。RCC具有多重耐藥基因，國(guó)內(nèi)外大量研究表明：RCC免疫原性極強(qiáng)，對(duì)傳統(tǒng)放化療均不敏感；CSCO報(bào)告顯示，RCC的術(shù)后細(xì)胞因子治療基本不能獲益，其推薦的一線治療策略為舒尼替尼、培唑帕尼、索拉菲尼、阿昔替尼等靶向治療藥物，以代替常規(guī)的化療方案[1]，該方案雖比常規(guī)化療更容易發(fā)揮滿意效果，但其藥物的副作用及耐藥問題仍亟待解決。

由體外培養(yǎng)體內(nèi)回輸?shù)臉渫粻罴?xì)胞(DCs)和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)介導(dǎo)的細(xì)胞免疫治療是近年來異軍突起的治療手段，其中DC負(fù)責(zé)識(shí)別抗原，激活獲得性免疫系統(tǒng)，CIK通過發(fā)揮自身細(xì)胞毒性和分泌細(xì)胞因子殺傷腫瘤細(xì)胞，達(dá)到改善機(jī)體的免疫抑制狀態(tài)，提高患者的抗腫瘤免疫反應(yīng)，發(fā)揮特異性和非特異性免疫的雙重抗腫瘤作用[2]。鑒于靶向藥物治療RCC存在諸多問題，本研究通過對(duì)比分析DC-CIK聯(lián)合靶向治療和僅靶向治療對(duì)RCC患者淋巴細(xì)胞亞群影響的差異，追蹤觀察患者的預(yù)后及生存時(shí)間并分析其臨床意義，探討兩者的協(xié)同治療作用，為RCC的治療提供新的方案參考。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 本研究選取2011年1月—2015年7月期間于南陽(yáng)市第一人民醫(yī)院腫瘤科收治的48例患者，均經(jīng)過病理學(xué)確認(rèn)診斷為腎透明細(xì)胞癌，并參照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)分期標(biāo)準(zhǔn)，篩選T3～T4分期的患者；患者年齡40～77(52.1±8.7)歲，其中男30例，女18例；單側(cè)腎癌47例，雙側(cè)腎癌1例。依據(jù)患者自愿所選治療方法的不同分為舒尼替尼(Sunitinib，ST)治療組23例和DC-CIK聯(lián)合舒尼替尼(DC-CIK&ST)治療組25例。兩組患者的一般資料經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無(wú)顯著性差異，見表1。治療前由患者本人或法定代理人簽署知情同意書。

表1 兩組患者的一般資料

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 符合以下標(biāo)準(zhǔn)任一條則排除選擇：(1)生物制品過敏者；(2)非原發(fā)性腎癌患者；(3)心、肝功能嚴(yán)重不全者；(4)合并其他重大病癥者；(5)孕婦及哺乳期婦女；(6)患有免疫性疾病4周內(nèi)有藥物治療者。

1.3 儀器試劑 FACS Calibur型流式細(xì)胞分析儀(美國(guó)BD公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊镏破房萍脊?，人血清白蛋白(奧地利Baxter AG公司)，無(wú)血清培養(yǎng)基GT-T551(日本Takara公司)，單克隆抗體、rIL-4、rGM-CSF(以色列PROSPEC公司)，PHA、 INF-γ、IL-2(上海凱茂生物醫(yī)藥有限公司)。

1.4 治療方法

1.4.1 靶向治療方案：兩組患者的靶向治療均給予舒尼替尼，1次/d，50mg/次，口服，治療4周停2周，6周為1個(gè)療程；每個(gè)療程結(jié)束后進(jìn)行隨訪，主要檢查肝腎功能、血常規(guī)、甲狀腺功能等，借此指標(biāo)評(píng)估靶向治療的安全性；靶向治療有效且不良反應(yīng)可耐受者停藥2周后繼續(xù)下1個(gè)療程，出現(xiàn)不可耐受的不良反應(yīng)則降低舒尼替尼劑量直至給予停藥醫(yī)囑，并采取相應(yīng)治療，直至不良反應(yīng)顯著減輕或可耐受后，再次調(diào)整用藥劑量，直至恢復(fù)正常用藥量；治療過程中若出現(xiàn)中度及以上肝功能損傷則給予停藥4周復(fù)查肝功的醫(yī)囑。每2個(gè)療程進(jìn)行影像學(xué)、外周血淋巴細(xì)胞亞群檢查，借此指標(biāo)評(píng)價(jià)靶向治療的療效，其中靶向治療開始的第1天至出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展的時(shí)間標(biāo)記為無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)，靶向治療開始的第1天至患者死亡的時(shí)間標(biāo)記為總生存期(OS)。

1.4.2 DC-CIK治療方案：對(duì)于DC-CIK&ST組患者給予靶向治療的同時(shí)，進(jìn)行DC-CIK的輔助治療，靶向治療前1d采取患者外周血單核細(xì)胞(PBMC)，并記為第0天，于第5天負(fù)載抗原，采集培養(yǎng)7d后施以DC細(xì)胞懸液(總細(xì)胞數(shù)為約10×107個(gè)，不少于5×107個(gè))的淋巴結(jié)區(qū)域(雙側(cè)鎖骨上、雙側(cè)腋下、雙側(cè)腹股溝區(qū))皮下注射，以后1次/3d，共5次；自第0天開始的第10天，施以CIK細(xì)胞懸液(總細(xì)胞數(shù)為約10×109個(gè)，不少于5×109個(gè))的靜脈回輸，1次/2d，共4次。依照此方案每5次DC治療加4次CIK治療為1個(gè)療程，每2個(gè)療程間隔2個(gè)月，每位患者至少施以1個(gè)療程；DC-CIK聯(lián)合靶向治療期間監(jiān)測(cè)白細(xì)胞數(shù)目<3×109/L或出現(xiàn)肝功能損傷者給予停藥4周復(fù)查肝功能的醫(yī)囑。

1.4.3 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)：兩組患者均于治療前及第2個(gè)療程后1個(gè)月采取外周血2ml，混入肝素抗凝；檢測(cè)前，取100μl，分別加入鼠抗人具有熒光標(biāo)記的單克隆抗體20μl，閉光條件下孵育30min后，緩慢加入磷酸鹽緩沖液3ml并充分洗滌，洗滌后于1 500r/min離心5min，迅速棄去離心上清液，再加入磷酸鹽緩沖液1ml并充分混勻，按照美國(guó)BD公司試劑說明書操作，上機(jī)檢測(cè)CD3+T、CD19+B、CD3-CD56+NK、CD3+CD56+NK-T、CD4+、CD8+、CD8+CD28+、CD8+CD28-、CD4+CD25+Treg所占百分比，記錄并分析數(shù)據(jù)。

1.5 臨床療效評(píng)估 隨訪時(shí)間自2011年3月—2017年7月，兩組患者均在完成第1個(gè)療程后對(duì)其病情現(xiàn)狀進(jìn)行臨床評(píng)估，患者可在出現(xiàn)異常體征和癥狀時(shí)隨時(shí)復(fù)查并記錄，治療后3個(gè)月再次評(píng)估病情狀態(tài)，之后每3～6個(gè)月復(fù)查1次，直至失訪；臨床療效按實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(RECIST)分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、病情穩(wěn)定(SD)和病情進(jìn)展(PD)，不良反應(yīng)按WHO(1998)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，分為0～Ⅳ度。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者臨床療效比較 ST組患者中，PR+SD共15例(65.2%)，PD 8例(34.8%)；DC-CIK&ST組患者中，PR+SD共20例(80.0%)，PD 5例(20.0%)，兩組均無(wú)CR病例，兩組的臨床療效評(píng)估不存在顯著性差異(P=0.91)。

2.2 兩組患者治療前后淋巴細(xì)胞亞群比較 據(jù)表1結(jié)果可知，ST組患者中，僅CD4+CD25+Treg細(xì)胞在治療前后出現(xiàn)顯著性差異，治療后顯著降低，其他均未出現(xiàn)顯著性改變，表明ST組治療方案對(duì)患者淋巴細(xì)胞亞群的影響主要體現(xiàn)在對(duì)CD4+CD25+Treg細(xì)胞比率的抑制作用；DC-CIK&ST組在治療前后對(duì)淋巴細(xì)胞亞群的影響是多方面的，CD3+T細(xì)胞、CD4+CD25+Treg細(xì)胞均出現(xiàn)了顯著性差異，其中CD3+T細(xì)胞、CD3+CD56+NK-T細(xì)胞、CD8+CD28+細(xì)胞顯著性增加，CD4+CD25+Treg細(xì)胞顯著性降低；另外，兩組患者治療后淋巴細(xì)胞亞群相比也出現(xiàn)了顯著性差異，其中DC-CIK&ST組患者的CD3+CD56+NK-T細(xì)胞較ST組患者顯著增加，而CD4+CD25+Treg細(xì)胞則出現(xiàn)顯著降低。

表1 兩組患者治療前后淋巴細(xì)胞亞群分析

2.3 兩組患者的生存期比較及其與淋巴細(xì)胞亞群的關(guān)系 ST組患者隨訪時(shí)間中位為34.1個(gè)月(分布為2.5～68.2個(gè)月)，截止自末次隨訪，本組23例患者中2例未進(jìn)展，21例出現(xiàn)進(jìn)展，該組患者的中位PFS為5.3個(gè)月(95%CI 3.2～7.3個(gè)月)；另該組患者中4例患者生存，其余19例患者死亡，患者的中位OS為18.3個(gè)月(95%CI 7.5～34.1個(gè)月)。DC-CIK&ST組患者的隨訪時(shí)間中位為35.4個(gè)月(分布為3.2～71.4個(gè)月)，截止自末次隨訪，本組25例患者中有2例患者未進(jìn)展，其余23例出現(xiàn)病情進(jìn)展，該組患者的中位PFS為7.8個(gè)月(95%CI 4.2～11.5個(gè)月，對(duì)比ST組患者呈顯著性差異，P<0.05)；另該組患者中7例患者生存，其余18例患者死亡，患者的中位OS為22.1個(gè)月(95%CI 10.5～33.7個(gè)月，對(duì)比ST組患者呈顯著性差異，P<0.05)。將兩組患者的生存期數(shù)據(jù)進(jìn)行Kaplan-Meier分析，結(jié)果如圖1所示。

圖1 兩組患者的生存期比較

兩組患者在接受不同治療過程中，CD3+CD56+NK-T細(xì)胞與CD4+CD25+Treg細(xì)胞變化具有顯著性差異，為探討CD3+CD56+NK-T細(xì)胞與CD4+CD25+Treg細(xì)胞在治療中所發(fā)生的變化與患者生存期的關(guān)系，以所有患者該兩項(xiàng)參數(shù)的治療前后變化值中位數(shù)為界，將所有患者分為兩組，分別與患者各自的生存期數(shù)據(jù)進(jìn)行Kaplan-Meier分析，結(jié)果如圖2、圖3所示。

圖2 CD3+CD56+NK-T細(xì)胞的變化對(duì)患者生存期影響

據(jù)圖2、圖3所示結(jié)果可知：在接受治療過程中，CD3+CD56+NK-T細(xì)胞上升明顯的患者，較CD3+CD56+NK-T細(xì)胞上升不明顯的患者生存期顯著延長(zhǎng)，其中位生存期分別為25.7個(gè)月和11.2個(gè)月(P<0.01)；而CD4+CD25+Treg細(xì)胞下降明顯的患者(改變值大于中位數(shù)組)，較CD4+CD25+Treg細(xì)胞下降不明顯的患者(改變值小于中位數(shù)組)生存期顯著延長(zhǎng)，其中位生存期分別為26.3個(gè)月和12.8個(gè)月(P<0.01)。進(jìn)一步將患者年齡、PLT、BMI、KPS評(píng)分、LDH與治療過程中兩種細(xì)胞比率的改變進(jìn)行多因素COX回歸分析，發(fā)現(xiàn)CD3+CD56+

NK-T細(xì)胞的改變?nèi)匀伙@著影響患者的生存時(shí)間(95%CI 1.571～5.316，P=0.009)，CD4+CD25+Treg細(xì)胞的改變也同樣顯著影響患者的生存時(shí)間(95%CI 5.147～9.264，P=0.002)。

3 討論

靶向藥物舒尼替尼是目前藥物治療腎透明細(xì)胞癌的一線用藥之一，在全世界范圍內(nèi)都有較高的評(píng)價(jià)，作為一種多靶向酪氨酸激酶抑制劑，它主要作用于干細(xì)胞因子受體、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體等多項(xiàng)受體[3-4]，國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)臨床數(shù)據(jù)表明該藥具較強(qiáng)的抑制腫瘤增殖和抗腫瘤血管生成的作用[5-6]。與此同時(shí)，也有調(diào)查顯示約有15%的腎癌患者對(duì)舒尼替尼等藥物存在先天性耐藥，另有一些患者在接受舒尼替尼或其他靶向藥物治療后也逐漸出現(xiàn)耐藥和一定的病程進(jìn)展[7]，因而單純靶向治療藥物也具有一定局限性。

DC-CIK免疫細(xì)胞治療中，DC細(xì)胞以MHC限制形式呈遞抗原給CIK細(xì)胞，使CTL細(xì)胞得以大量增殖，同時(shí)可激活CIK細(xì)胞的MHC限制性殺傷能力；而CIK細(xì)胞可促進(jìn)DC細(xì)胞成熟并大量分泌IL-12、IL-18等因子，進(jìn)一步誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖成熟并主導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答；二者聯(lián)合培養(yǎng)及回輸在患者體內(nèi)具有更強(qiáng)的殺傷效應(yīng)和增殖能力[8-9]，而DC-CIK與靶向藥物等聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)人體抗腫瘤作用會(huì)進(jìn)一步提高，發(fā)揮延緩或阻止腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的作用，降低甚至一定程度避免因腫瘤免疫逃逸而誘發(fā)的靶向藥物的耐藥。

本研究回顧性總結(jié)了2011年1月—2015年7月期間于南陽(yáng)市第一人民醫(yī)院腫瘤科收治的48例腎透明細(xì)胞癌病例，比較了單純靶向療法和DC-CIK聯(lián)合靶向療法治療腎透明細(xì)胞癌的差異，結(jié)果表明，聯(lián)合療法可顯著提升患者生存期，顯著改善患者的預(yù)后，聯(lián)合療法對(duì)患者淋巴細(xì)胞亞群的改變與其對(duì)患者生存期的影響存在相關(guān)性。

綜上所述，DC-CIK聯(lián)合靶向治療的方法于臨床治療腎透明細(xì)胞癌對(duì)患者預(yù)后有較大的利好，建議臨床推廣擴(kuò)大研究規(guī)模，深入探討該方法對(duì)患者的作用機(jī)制，保障該方法健康有序的發(fā)展。