王瑩瑩,徐煥煥,陳丹陽(yáng),王 洋,王瑞鵬,牛向麗

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

番茄(Solanumlycopersicum)是研究植物抗病分子機(jī)制中常用的模式植物,也是營(yíng)養(yǎng)豐富、用途廣泛的經(jīng)濟(jì)作物[1]。病害發(fā)生是導(dǎo)致番茄產(chǎn)量和品質(zhì)降低的重要原因,因此提高番茄抵御病害的能力十分必要[2]。植物抗病始于識(shí)別病原微生物,進(jìn)而激活體內(nèi)與抗病相關(guān)基因的表達(dá)[3]。IWS1(interact withSPT61)基因最先在酵母和哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn),因其與轉(zhuǎn)錄延伸因子SPT6 (Suppressor of Ty6)相互作用而被發(fā)現(xiàn)和命名。已有研究認(rèn)為,SPT6可以結(jié)合組蛋白H3,作為轉(zhuǎn)錄延伸因子促進(jìn)RNA聚合酶Ⅱ (RNA polymerase Ⅱ, RNAPⅡ)的轉(zhuǎn)錄延伸,在多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄延伸和mRNA加工中發(fā)揮調(diào)控作用[4]。IWS1通過(guò)與SPT6等蛋白質(zhì)形成復(fù)合體,提高RNAPⅡ所轉(zhuǎn)錄基因的表達(dá)[5-6]。而在DNA損傷等條件下,SPT6和IWS1蛋白會(huì)被降解,RNAPⅡ?qū)⑼Ｖ罐D(zhuǎn)錄,整個(gè)轉(zhuǎn)錄組都會(huì)受到影響[7]。在植物相關(guān)研究中,擬南芥AtIWS1基因被發(fā)現(xiàn)與抗病基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān),可以做為特異性激活通路的作用靶點(diǎn),它的表達(dá)增強(qiáng)了植物對(duì)病原菌的抵抗力和耐受性。AtIWS1基因的突變則會(huì)導(dǎo)致擬南芥植株變得矮小而易染病[8]。

但在番茄中SlIWS1基因的抗病防御功能研究很少。細(xì)菌性斑點(diǎn)病(bacterial speck)是番茄種植生產(chǎn)過(guò)程中的主要細(xì)菌病害,對(duì)植株的葉、莖、花和果實(shí)都可以產(chǎn)生影響[9],其病原微生物為丁香假單胞菌番茄致病變種(Pseudomonassyringaepv.tomato,Pst),是一種革蘭氏陰性細(xì)菌[10]。本文通過(guò)對(duì)丁香假單胞菌接種后番茄中SlIWS1基因的表達(dá)檢測(cè),以及SlIWS1基因克隆、植物表達(dá)載體構(gòu)建和瞬時(shí)表達(dá),探討SlIWS1與細(xì)菌病害的關(guān)聯(lián),并為其功能分析提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料

番茄(Solanumlycopersicum)、煙草(Nicotianabenthamiana)植株種植于合肥工業(yè)大學(xué)屯溪路校區(qū)人工氣候培養(yǎng)室。

1.1.2 載體與菌株

pEASY-Blunt克隆載體、植物表達(dá)載體pBTEX-FLAG(帶有植物組成型啟動(dòng)子CaMV35S、FLAG蛋白標(biāo)簽),由本實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5a、根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株GV2260、丁香假單胞桿菌菌株P(guān).syringaepv.tomatoDC3000(PstDC3000)、P.syringaepv.tomatohrcC mutant(PsthrcC),由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 試劑藥品

Trizol、反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)于Invitrogen公司;TransStart?FastPfu DNA Polymerase、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒、瓊脂糖膠回收試劑盒購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司;T4 DNA Ligase購(gòu)于Thermo Scientific;限制性內(nèi)切酶(KpnⅠ、XholⅠ、SalⅠ)購(gòu)于大連寶生物公司;FLAG標(biāo)簽小鼠單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;引物設(shè)計(jì)采用Primmer Premmier 5.0軟件,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;其他試劑均為國(guó)外原裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

分別取MgCl2、PstDC3000、PsthrcC真空滲透法接種處理的野生型番茄,以及PstDC3000接種處理的感病株系prf3[11]、抗性株系PtoR[12-13]的植株葉片,提取總RNA。取1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.2 番茄SlIWS1基因的克隆

根據(jù)SlIWS1基因(XM-004233331)編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)引物,引物序列為:

IWS1F1:TCACAAGTAGAGTAAACAAAGTCC,

IWS1R1:ACATGCGGCACCATTTAATC;

IWS1F2:CTTCCGCGGATGAGTTACAACAACGATCCGTAC,

IWS1R2:CATGGGCCCCTAGAGGTACTTCACCATGCCAC。

引入KpnⅠ、XolⅠ酶切位點(diǎn),然后以上述番茄葉片cDNA為模板,對(duì)SlIWS1基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；并以番茄Actin(XM-004233331)做為內(nèi)參基因,引物序列為:

SlActin-F:CGAGCAGTGTTTCCCAGTATT,

SlActin-R:AGCCTGGATAGCAACATACATAG。

對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。將SlIWS1基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化,與pEASY-Blunt載體連接、轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞。挑取單克隆培養(yǎng)后進(jìn)行菌落PCR鑒定,將陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行KpnⅠ、XholⅠ 酶切,并進(jìn)行測(cè)序,構(gòu)建pEASY-IWS1-Blunt載體。

1.2.3SlIWS1基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建

以KpnⅠ、SalⅠ酶切pBTEX-FLAG載體。DNA片段切膠回收后,進(jìn)行連接、大腸桿菌轉(zhuǎn)化,經(jīng)菌落PCR鑒定、測(cè)序驗(yàn)證,構(gòu)建CaMV35S：：BTEX-IWS1-FLAG載體(命名為pBTEX-IWS1-FLAG)。將測(cè)序正確的載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV2260,篩選鑒定陽(yáng)性克隆,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 SlIWS1在煙草葉片中的表達(dá)

本文采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)瞬時(shí)表達(dá)方法[14-16]，將轉(zhuǎn)入pBTEX-IWS1-FLAG載體的農(nóng)桿菌進(jìn)行劃線培養(yǎng)。挑取單菌落于3 mL LB 液體培養(yǎng)基(利福平 100 mg/L、卡那霉素 50 mg/L)中,28 ℃下200 r/min 培養(yǎng) 24 h;吸取300 μL菌液于2.7 mL培養(yǎng)液中,28 ℃轉(zhuǎn)接培養(yǎng)7 h;然后將菌液離心,加入3 mL 誘導(dǎo)液(AB鹽、IM培養(yǎng)液、200 mmol/L乙酰丁香酮、25 mg/mL卡那霉素),重懸培養(yǎng)11 h。暗處?kù)o置10 min,吸取2 mL菌液離心,以2 mL 誘導(dǎo)緩沖液(50 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸、200 mmol/L乙酰丁香酮)重懸細(xì)胞,測(cè)定OD600吸收值,調(diào)整至OD600=0.8;取一次性注射器,去掉針頭吸取農(nóng)桿菌菌液,注入生長(zhǎng)約5周的煙草的上部葉片中,36 h后收取樣品,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 SlIWS1蛋白表達(dá)情況的檢測(cè)

利用Western Blot檢測(cè)SlIWS1蛋白的表達(dá)情況。將上述煙草葉片樣品取出,液氮研磨后取約200 mg加入200 μL蛋白提取液(50 mmol/L三羥甲基氨基甲烷、150 mmol/L氯化鈉、5 mmol/L乙二胺四乙酸、10%甘油、1%聚乙烯吡咯烷酮、20 μmol/L二硫蘇糖醇、1 mmol/L苯甲基磺酰氟),充分渦旋后放置于冰上10 min,12 000 r/min,4 ℃離心10 min。然后吸取上清80 μL,加入上樣緩沖液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(100 V 1.5 h)、轉(zhuǎn)膜(250 mA 1 h)、牛奶封閉1 h和抗體結(jié)合,檢測(cè)SlIWS1蛋白的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄SlIWS1基因克隆

以MgCl2、PstDC3000、PsthrcC真空滲透法接種處理野生型番茄,PstDC3000接種處理的感病株系prf3、抗性株系PtoR植株葉片cDNA為模板,番茄Actin為內(nèi)參基因,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物如圖1所示。圖1中，M代表DNA Marker；1～3分別代表接種對(duì)照MgCl2溶液、病原菌PstDC3000、PsthrcC于野生型番茄；4～5分別代表接種PstDC3000于感病番茄品系prf3和抗病番茄品系PtoR。從圖1可以看出,擴(kuò)增產(chǎn)物為與預(yù)期大小(1 572 bp)基本一致的特異條帶。接種丁香假單胞桿菌病原菌株P(guān)stDC3000后,野生型番茄中SlIWS1基因表達(dá)水平明顯升高;接種無(wú)type Ⅲ分泌系統(tǒng)的突變菌株P(guān)sthrcC也同樣可以增加SlIWS1的表達(dá)量;在接種PstDC3000的感病番茄品系prf3、抗病番茄品系PtoR中也檢測(cè)到SlIWS1的表達(dá)。

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后與pEASY-Blunt載體連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)陽(yáng)性克隆鑒定其結(jié)果，如圖2所示;取陽(yáng)性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取、雙酶切鑒定其結(jié)果，如圖3所示,酶切后獲得了預(yù)期大小SlIWS1基因片段,并進(jìn)一步通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證,結(jié)果表明所擴(kuò)增基因確實(shí)為番茄SlIWS1基因編碼序列。

圖1 番茄SlIWS1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

M.DNA Marker；1～13.轉(zhuǎn)入SlIWS1基因pEASY-Blunt連接產(chǎn)物

M.DNA Marker 1.pEASY-IWS1-Blunt質(zhì)粒 2.pEASY-IWS1-Blunt質(zhì)粒Kpn Ⅰ、Xho Ⅰ酶切圖3 pEASY-IWS1-Blunt酶切鑒定

2.2 SlIWS1基因植物表達(dá)載體構(gòu)建

將已測(cè)序的pEASY-IWS1-Blunt載體按照1.2節(jié)方法所述進(jìn)行酶切、膠回收,連接于植物表達(dá)載體pBTEX-FLAG,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞。通過(guò)菌落PCR鑒定,獲取陽(yáng)性單克隆進(jìn)行測(cè)序測(cè)定,測(cè)序結(jié)果表明SlIWS1已連接于植物表達(dá)載體pBTEX-FLAG,完成pBTEX-IWS1-FLAG載體構(gòu)建。

2.3 煙草葉片中表達(dá)SlIWS1

將轉(zhuǎn)入pBTEX-IWS1-FLAG載體的農(nóng)桿菌單克隆,經(jīng)1.2節(jié)方法所述培養(yǎng)、注射于煙草葉片中。通過(guò)提取注射葉片總蛋白、聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫印跡,檢測(cè)到預(yù)期大小IWS1蛋白的表達(dá),如圖4所示。結(jié)果表明所構(gòu)建番茄SlIWS1基因載體可以在植物體內(nèi)進(jìn)行表達(dá),可用于進(jìn)一步的蛋白質(zhì)相互作用檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

1.pBTEX-FLAG載體 2.pBTEX-IWS1-FLAG載體圖4 免疫印跡檢測(cè)SlIWS1在煙草中的表達(dá)產(chǎn)物

3 討 論

IWS1基因的功能首先在酵母系統(tǒng)中進(jìn)行了報(bào)道[17]。在酵母中,IWS1做為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子能夠與組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶互作,共同調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄延伸,而組蛋白的甲基化可以調(diào)節(jié)基因的表達(dá)或關(guān)閉,決定基因的活性[18]。隨后發(fā)現(xiàn),IWS1是在動(dòng)植物體中均存在并參與重要調(diào)控的基因[19]。在擬南芥中,IWS1由植物激素油菜素內(nèi)酯(Brassinosteroid,BR)轉(zhuǎn)錄因子BES1組裝到靶基因,調(diào)節(jié)BR應(yīng)答基因的表達(dá),從而控制植物體的生物與非生物脅迫響應(yīng)、細(xì)胞伸長(zhǎng)、細(xì)胞分化和光形態(tài)建成等[20]。IWS1通過(guò)BR信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)控植株發(fā)育、提高抗病能力的功能。IWS1功能缺失突變體表現(xiàn)為半矮化,植株抵御病害能力減弱。在羅漢果中,四倍體植株的抗病能力優(yōu)于普通二倍體植株,也相應(yīng)發(fā)現(xiàn)IWS1基因表達(dá)水平高于二倍體[21]。在牡丹花中,IWS1穩(wěn)定表達(dá)可做為內(nèi)參基因[22]；而番茄同源SlIWS1基因在抗病防御系統(tǒng)中功能尚未進(jìn)行系統(tǒng)研究。在本文中,接種番茄斑點(diǎn)病病原菌可以誘導(dǎo)SlIWS1基因表達(dá)水平明顯升高,表明SlIWS1基因參與番茄的免疫防御應(yīng)答。

番茄是研究果實(shí)發(fā)育、抗病防御反應(yīng)的模式植物,相應(yīng)實(shí)驗(yàn)體系較為完備。根據(jù)已有的研究報(bào)道[23-24],在病原微生物-植物相互作用體系中,植物通過(guò)識(shí)別病原物的鞭毛等保守分子、或注入植物細(xì)胞內(nèi)的特異效應(yīng)蛋白,啟動(dòng)下游防御基因的轉(zhuǎn)錄激活。無(wú)論哪一種識(shí)別應(yīng)答均需調(diào)控特定基因的轉(zhuǎn)錄與延伸,因此SlIWS1基因可能在番茄的防御應(yīng)答中發(fā)揮上游調(diào)控作用,而本文對(duì)SlIWS1的基因克隆、植物表達(dá)載體構(gòu)建和植物體內(nèi)蛋白表達(dá)檢測(cè)(體內(nèi)蛋白表達(dá)顯示2條帶,其中一條帶為抗體的非特異帶),將為后續(xù)進(jìn)行SlIWS1蛋白質(zhì)相互作用和基因功能分析提供依據(jù)。