徐宏征 張書諾 章一新 李科 閔沛如

乳腺癌相關(guān)的上肢淋巴水腫(BCRL)是公認(rèn)的與乳腺癌手術(shù)，包括腋窩淋巴結(jié)清掃及術(shù)后放療相關(guān)的并發(fā)癥[1]。乳腺癌前哨淋巴結(jié)活檢術(shù)后淋巴水腫發(fā)病率高達(dá)4%～10%，乳腺癌腋下淋巴結(jié)清除術(shù)后淋巴水腫發(fā)病率高達(dá)9%～41%[2-3]。其發(fā)病機(jī)制為受影響的組織液(淋巴液)增多，出現(xiàn)慢性炎癥，導(dǎo)致纖維脂肪組織增生和沉積，以及不適性水腫[4-5]。乳腺癌術(shù)后淋巴水腫的臨床癥狀包括上肢水腫、皮膚彈性差、關(guān)節(jié)活動(dòng)受限以及皮膚淋巴管炎(DLA)[6-7]。上肢過(guò)多的組織液會(huì)導(dǎo)致疼痛和焦慮，影響患者的日常生活和社交，同時(shí)粗大的肢體和增加的體重會(huì)降低身體功能，導(dǎo)致身體形象紊亂，對(duì)生活質(zhì)量產(chǎn)生顯著影響[8]。

目前，BCRL的常規(guī)非手術(shù)治療包括運(yùn)動(dòng)和仰臥起坐、手法淋巴引流、熱療、間歇?dú)鈮翰ǒ煼?、彈力繃帶等。盡管這些方法對(duì)各臨床階段都有一定的療效，但僅利用這些保守措施幾乎不可能取得顯著的癥狀改善。對(duì)于不能或不想接受外科手術(shù)的患者來(lái)說(shuō)，這些保守治療是重要的輔助工具[9-13]，不僅可以促進(jìn)側(cè)支淋巴流動(dòng)，還能去除多余的脂肪組織來(lái)改善淋巴水腫，從而減緩甚至防止原有淋巴水腫的惡化。

遠(yuǎn)紅外輻射(FIR)治療通過(guò)輻射、振動(dòng)/共振和熱效應(yīng)3種主要生物效應(yīng)對(duì)組織產(chǎn)生影響，其作用方式與熱療相似。輻射光譜的紅外區(qū)域位于可見光范圍的紅端之外，波長(zhǎng)在0.01～7.5×10-5cm。紅外線又分為近紅外線、中紅外線和遠(yuǎn)紅外線。在構(gòu)成紅外光譜的不同頻率中，遠(yuǎn)紅外線對(duì)生物體最為有利[14-15]。由于人類有機(jī)體的絕大部分是由55%～60%的水組成，而FIR能夠與水分子相互作用，引起熱反應(yīng)，從而提高組織溫度，擴(kuò)張血管；并且，遠(yuǎn)紅外線能夠穿透4 cm深的組織層，與水和其他有機(jī)分子產(chǎn)生共振作用[16]。這些效果使某些特定的病理情況能得到改善，例如改善淋巴水腫、促進(jìn)微循環(huán)和側(cè)支淋巴流動(dòng)[17]。目前，F(xiàn)IR療法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床，如血管相關(guān)疾病[18]、淋巴水腫[12-13，17]。研究表明，F(xiàn)IR能有效減少末端液體量、周徑以及DLA的發(fā)生次數(shù)[18]。但是，目前還沒(méi)有關(guān)于FIR的腫瘤安全性研究。本研究旨在證明FIR治療BCRL的腫瘤安全性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

如表1所示，本研究共納入2014年4月至2016年4月期間接收的63例女性BCRL患者，均接受過(guò)改良根治性乳房切除術(shù)、腋下淋巴結(jié)清掃術(shù)和放化療。全部患者隨機(jī)分為兩組，分別使用FIR(n=32)和加壓繃帶法(n=31)進(jìn)行治療。

表1 臨床資料Table 1 Population demographics

只有乳房切除術(shù)后5年，且出現(xiàn)上肢淋巴水腫超過(guò)1年的患者才被納入研究。有癌癥復(fù)發(fā)可能的患者、有可能干擾常規(guī)治療和隨訪時(shí)有嚴(yán)重并發(fā)癥的患者被排除在外。此外，發(fā)生DLA或血管栓塞的患者以及受影響的肢體太大而不能放置在治療室的患者也被排除在本研究外(圖1)。

圖1 分類圖Fig. 1 Consort diagram

1.2 治療方法

1.2.1 FIR治療儀

FIR治療儀由中國(guó)上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院研發(fā)[19]，能產(chǎn)生紅外輻射的元件被存放在耐高溫的不銹鋼室內(nèi)，安裝在內(nèi)環(huán)上的8個(gè)石英燈能發(fā)出6.0～14.0 μm波長(zhǎng)的紅外線[14]。此外，該設(shè)備還配有溫度控制裝置，可調(diào)節(jié)不銹鋼室內(nèi)的溫度。

1.2.2 FIR治療方案

本試驗(yàn)納入的患者開展FIR治療前均簽署書面知情同意書。治療方式為42 °C下，持續(xù)治療4周(共20 d)，每天1 h。并囑患者注意個(gè)人護(hù)理，如肢體衛(wèi)生、預(yù)防皮膚損傷以避免發(fā)生皮膚真菌病等[19]。

1.2.3 繃帶治療方案

本試驗(yàn)納入的患者進(jìn)行壓迫繃帶治療前均簽署書面知情同意書?；颊咴诿刻烨逍褧r(shí)用繃帶包扎12 h，治療4周(共20 d)。同樣建議患者注意個(gè)人護(hù)理，同F(xiàn)IR治療組。

1.2.4 倫理聲明

本研究經(jīng)過(guò)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。試驗(yàn)全程遵守所有的相關(guān)條例以及《赫爾辛基宣言》的指導(dǎo)方針。

1.2.5 隨訪觀察

治療后隨訪1年。隨訪觀察指標(biāo)：①腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)室抽取靜脈血，檢測(cè)與乳腺癌相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物(CA153和CA125)。正常范圍內(nèi)的結(jié)果記錄為陰性，高于正常范圍的結(jié)果為陽(yáng)性。CA125的正常范圍為0～35 U/ml，CA153的正常范圍為0～25 U/mL。②超聲檢查肝、脾、腎、乳腺、腋窩淋巴結(jié)、鎖骨上和鎖骨下淋巴結(jié)。如果檢查肝、脾、腎或乳腺時(shí)發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)腫大，記錄為陽(yáng)性，反之則為陰性。③不良反應(yīng)。如治療過(guò)程中有燙傷、局部感染、發(fā)熱、不適、疼痛等不良反應(yīng)者為陽(yáng)性，無(wú)不良反應(yīng)者為陰性。

1.3 體外試驗(yàn)

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

皮膚二倍體成纖維細(xì)胞來(lái)源于健康男性捐贈(zèng)者上臂的2 mm打孔活檢標(biāo)本。人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB231購(gòu)自美國(guó)ATCC。常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)添加100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素、2 mmol/L谷氨酰胺和10%胎牛血清(FBS)。置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 FIR處理

FIR處理是通過(guò)一個(gè)釋放FIR的裝置，發(fā)出波長(zhǎng)6.0～14.0 μm的光波。將需要照射的細(xì)胞(成纖維細(xì)胞、MCF-7和MDA-MB231)放入9 cm培養(yǎng)皿中，再置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(受照組)。細(xì)胞與光源的距離為30 cm。用實(shí)時(shí)溫度探測(cè)器監(jiān)測(cè)培養(yǎng)箱中的溫度，使其保持在37 ℃±0.5 ℃。照射時(shí)間為1 h，與本研究臨床試驗(yàn)的照射方案相同。未照射的細(xì)胞(未受照組)除了不接受FIR處理外，其他條件均與受照組相同。

1.3.3 細(xì)胞活力和增殖

將細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板中，每孔密度為4 000個(gè)細(xì)胞。受照組用FIR處理，每天1 h，連續(xù)7 d，而未受照組放置在同一區(qū)域，但不受照射。每天FIR處理后立即使用CCK-8試劑盒評(píng)估細(xì)胞活力和增殖能力。在試驗(yàn)過(guò)程中，細(xì)胞在10%CCK-8(Dojindo，日本)中培養(yǎng)。

1.3.4 FACS細(xì)胞周期的分析

受照組FIR處理1 h，未受照組不作處理。之后，收集受照組和未受照組的細(xì)胞，并將其固定在70%乙醇中，用冰的PBS洗滌2次，重懸，用核糖核酸酶A(50 μg/mL)在37 ℃下孵育30 min，PI(50 μg/mL)染色1 h，最后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。每組重復(fù)3次。

1.3.5 細(xì)胞凋亡的評(píng)估

受照組FIR處理1 h，未受照組不作處理。用流式細(xì)胞儀對(duì)受照組和未受照組的凋亡細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)說(shuō)明書，使用Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(BD Biosciences，美國(guó))。結(jié)果顯示，Annexin Ⅴ+/PI-染色的細(xì)胞是早期凋亡細(xì)胞，而顯示Annexin V+/PI+染色的細(xì)胞是晚期凋亡細(xì)胞。染色后，立即使用BD-FACS Calibur流式細(xì)胞儀和細(xì)胞檢測(cè)儀進(jìn)行分析。每組重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)

在FIR或壓迫繃帶治療1年后，F(xiàn)IR組和對(duì)照組的CA125、CA153均在正常范圍內(nèi)。

2.2 超聲檢測(cè)

在FIR或壓迫繃帶治療1年后，患者接受了肝臟、脾臟、腎臟、乳腺、腋窩淋巴結(jié)、鎖骨上淋巴結(jié)和鎖骨下淋巴結(jié)盆的超聲檢查。FIR組和對(duì)照組均未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)腫大。

2.3 不良反應(yīng)

對(duì)FIR和加壓繃帶治療可能引起的不良反應(yīng)進(jìn)行隨訪調(diào)查，如燒傷、局部感染、發(fā)熱、不適和疼痛等。兩組均無(wú)不良事件報(bào)告。

2.4 體外試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 細(xì)胞的活力和增殖

評(píng)估FIR處理對(duì)人原代成纖維細(xì)胞和兩種不同的人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB231和MCF-7的細(xì)胞活力和增殖率的影響。FIR處理1 h，每日1次，連續(xù)7 d。FIR處理后立即用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力和增殖能力。用細(xì)胞生長(zhǎng)曲線對(duì)CCK-8結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，所有細(xì)胞類型中受照組和未受照組之間的細(xì)胞活力和增殖能力不存在顯著差異(圖2)。

2.4.2 細(xì)胞周期分析

為了研究FIR處理對(duì)細(xì)胞周期的影響，我們用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞DNA含量進(jìn)行分析，并在FIR處理后立即測(cè)定不同階段細(xì)胞周期的細(xì)胞群比例。結(jié)果顯示，所有細(xì)胞類型中受照組和未受照組之間未見顯著差異，表明暴露于FIR處理不會(huì)影響細(xì)胞周期進(jìn)程(表2)。

圖2 兩組成纖維細(xì)胞、MBA-MD231細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞活力和增殖能力Fig. 2 Cell viability and proliferation ability of fibroblasts, MBA-MD231 and MCF-7 cells in the two groups

表2 兩組成纖維細(xì)胞、MBA-MD231細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞周期分析Table 2 Cell cycle analysis of fibroblasts, MBA-MD231 and MCF-7 cells in the two groups

2.4.3 細(xì)胞凋亡評(píng)估

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析FIR處理對(duì)凋亡閾值的影響，并使用Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示，F(xiàn)IR處理不影響正常成纖維細(xì)胞和MCF-7和MDA-MB231細(xì)胞的凋亡狀態(tài)(圖3)。

圖3 兩組成纖維細(xì)胞、MBA-MD231細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞凋亡評(píng)估Fig. 3 Apoptosis evaluation of fibroblasts, MBA-MD231 and MCF-7 cells in the two groups

3 討論

紅外輻射是電磁光譜中不可見的部分，波長(zhǎng)從750 nm到100 μm，頻率從400 THz到3 Hz，光子能量范圍為12.4～1.7 MΩ。紅外光譜位于可見光譜的長(zhǎng)波紅邊和太赫茲(從3 THz開始)光譜帶的短邊之間。FIR有3種主要的生物效應(yīng)：輻射、振動(dòng)/共振和熱效應(yīng)[18]。在細(xì)胞中，輻射和振動(dòng)促進(jìn)自由離子的振蕩，導(dǎo)致蛋白質(zhì)等大分子變性，從而增加組織中蛋白質(zhì)的吸收[14]。熱效應(yīng)可通過(guò)擴(kuò)張血液或淋巴管促進(jìn)微循環(huán)[11-12]。Liu等[12，19-21]發(fā)現(xiàn)，局部熱療能激活胰島細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，增強(qiáng)免疫功能，促進(jìn)微循環(huán)?；罨木奘杉?xì)胞可以水解過(guò)多的蛋白質(zhì)，降低膠體滲透壓，促進(jìn)間質(zhì)液體回流到淋巴水腫組織的循環(huán)系統(tǒng)。有研究證明，局部熱療可以改善微循環(huán)，減少慢性炎癥，促進(jìn)組織修復(fù)[22-25]。目前，壓迫包扎療法已應(yīng)用于頸部淋巴結(jié)清掃術(shù)后淋巴水腫患者，有助于減少淋巴液的積聚[19]。該方法已被證明是治療乳房切除術(shù)后淋巴水腫的一種安全的方法，并被廣泛應(yīng)用。

我們前期的研究表明，F(xiàn)IR治療能減少水腫肢體的周徑和含水量，還會(huì)降低DLA的發(fā)病率[17，19]。然而，F(xiàn)IR治療是否會(huì)影響乳腺癌復(fù)發(fā)率，甚至增加其轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，目前仍不清楚?；颊哳A(yù)后最重要的預(yù)測(cè)因素是癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸，因此目前的研究重點(diǎn)是明確鄰近表皮、前哨淋巴結(jié)、循環(huán)和遠(yuǎn)處是否存在轉(zhuǎn)移性腫瘤[26-28]。CA125和CA153被認(rèn)為是乳腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的特異性生物標(biāo)志物[29]。其中，CA153是乳腺癌患者的預(yù)后、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的標(biāo)志[30-32]。眾所周知，術(shù)前血清中CEA和CA153的水平對(duì)乳腺癌的預(yù)后有顯著影響[33]。在乳腺癌組織中CA125表達(dá)上調(diào)，但在非腫瘤導(dǎo)管中不表達(dá)[34]。在我們的研究中，63例患者在FIR或繃帶治療后，檢測(cè)了血清中的CA125和CA153，均未發(fā)現(xiàn)CA125或CA153。因此，我們認(rèn)為FIR治療不太可能引起腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。

超聲檢查是一種簡(jiǎn)單、廉價(jià)、高精度的方法，廣泛應(yīng)用于乳腺癌或轉(zhuǎn)移瘤的早期檢測(cè)[35-36]。在我們的研究中，經(jīng)過(guò)1年的隨訪，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)用FIR或壓迫繃帶治療的患者出現(xiàn)肝、脾、腎或乳腺的病理改變，也沒(méi)有新證據(jù)表明患者出現(xiàn)淋巴結(jié)腫大。這似乎進(jìn)一步證實(shí)了FIR治療BCRL的安全性和可靠性。

在臨床隨訪期間，我們監(jiān)測(cè)了FIR治療后可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)。沒(méi)有患者出現(xiàn)燒傷、局部感染、發(fā)熱、不適或疼痛等治療肢體的不良反應(yīng)，表明FIR在BCRL治療上有良好的耐受性。

盡管大多數(shù)乳腺癌患者在進(jìn)行手術(shù)切除、放療和/或化療后沒(méi)有出現(xiàn)臨床上可檢測(cè)到的殘留腫瘤跡象，但也可能存在個(gè)別殘留腫瘤細(xì)胞[37-38]。這些腫瘤細(xì)胞無(wú)法在臨床上檢測(cè)到，可能是因?yàn)榧?xì)胞數(shù)量太少或癌細(xì)胞處于潛伏期。因此，本研究的目的之一是評(píng)估FIR治療是否能激活乳腺癌術(shù)后淋巴水腫患者的殘余腫瘤細(xì)胞。

體外試驗(yàn)部分，為了模擬FIR治療期間的體內(nèi)環(huán)境，我們將細(xì)胞維持在37 °C±0.5 °C的溫度下，每次照射處理后檢測(cè)MDA-MB231、MCF-7細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的細(xì)胞增殖和活力。結(jié)果表明，受照組和未受照組之間未發(fā)現(xiàn)顯著差異(P>0.05)，表明FIR不太可能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖并增加乳腺癌的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。

細(xì)胞周期試驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞增殖沒(méi)有差異(P>0.05)，表明FIR不會(huì)縮短乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期，進(jìn)一步證實(shí)了FIR治療不會(huì)激活乳腺癌細(xì)胞。

Chen等[39]報(bào)道FIR照射可減弱培養(yǎng)的角質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡和死亡。在我們的研究中，受照組成纖維細(xì)胞、MDA-MB231和MCF-7細(xì)胞的凋亡狀態(tài)與未受照組相同。這提示FIR治療似乎不能誘導(dǎo)或延緩乳腺癌細(xì)胞凋亡。

本研究的局限性在于，所有淋巴水腫的患者都在5年前接受了乳腺切除術(shù)，因此這些患者體內(nèi)殘留的乳腺癌細(xì)胞可能相對(duì)穩(wěn)定，難以激活。對(duì)于乳腺切除術(shù)不到5年的患者，F(xiàn)IR治療是否安全還有待確定。在此研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，還需要進(jìn)一步的研究來(lái)驗(yàn)證FIR對(duì)乳腺癌術(shù)后早期淋巴水腫治療的安全性。