王宏 徐娟 江茜 康利 劉偉偉 袁玲 崔曉雪 劉琳娜 馮仁蕊 王蕾 李燕林

摘 要 目的：研究大黃-丹參藥對對慢性腎衰竭（CRF）模型大鼠腸源性尿毒素含量和腸道屏障功能的影響。方法：將55只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（10只）和造模組（45只），假手術(shù)組大鼠分離腎組織但不切除，造模組大鼠采用5/6腎切除法復(fù)制CRF模型。造模成功后（剔除死亡和不成模大鼠5只），將模型大鼠分為模型組（水）、尿毒清顆粒組（2.5 g/kg）和大黃-丹參藥對高、低劑量組（6、3 g/kg，以生藥量計），每組10只。假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃等體積水，各給藥組灌胃相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)12周。末次給藥后，采用全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清中肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）含量和24 h尿液中尿肌酐（Ucr）含量，并計算肌酐清除率（Ccr）;采用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法同時測定大鼠血清中尿毒素[氧化三甲胺（TMAO）、硫酸吲哚酚（IS）、硫酸對甲酚（PCS）]的含量;采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）法、免疫熒光法分別檢測大鼠回腸組織中閉合蛋白（Occludin）、緊密連接蛋白1（ZO-1）的mRNA和蛋白表達(dá)水平;采用蘇木素-伊紅染色法、Masson染色法觀察大鼠腎組織的病理學(xué)變化;采用透射電鏡法觀察大鼠結(jié)腸組織的超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中Scr、BUN、TMAO、PCS、IS含量均顯著升高（P<0.01），尿液中Ucr含量和Ccr及回腸組織中Occludin、ZO-1的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）;腎組織中腎小球硬化、腎小管擴(kuò)張，腎間質(zhì)可見炎性細(xì)胞浸潤和纖維化;結(jié)腸上皮屏障結(jié)構(gòu)重度損傷。與模型組比較，各給藥組大鼠血清中Scr、BUN、TMAO、PCS、IS含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;尿液中Ucr含量和回腸組織中Occludin、ZO-1的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著升高（大黃-丹參藥對低劑量組的ZO-1 mRNA除外，P<0.05或P<0.01）;腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤、纖維化程度和結(jié)腸上皮屏障結(jié)構(gòu)損傷程度均減輕。結(jié)論：大黃-丹參藥對能有效保護(hù)CRF模型大鼠殘存的腎功能，其作用機(jī)制可能與降低大鼠血清中腸源性尿毒素含量，上調(diào)回腸組織中Occludin、ZO-1 的mRNA及蛋白表達(dá)水平從而改善腸道屏障功能有關(guān)。

關(guān)鍵詞 大黃;丹參;慢性腎衰竭;腸源性尿毒素;腸道屏障;大鼠

中圖分類號 R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）07-0825-07

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effects of couplet medicine of Rheum palmatum-Salvia miltiorrhiza on the contents of enterogenous urotoxin and intestinal barrier function in chronic renal failure （CRF） model rats. METHODS： Totally 55 male Wistar rats were randomly divided into sham operation group （10 rats） and modeling group （45 rats）. In sham operation group， the kidneys were isolated but not removed; CRF model was reproduced by 5/6 nephrectomy in modeling group. After modeling （excluding 5 dead and non-modeling rats）， modeling rats were divided into model group （water）， Niaoduqing granules group （2.5 g/kg），couplet medicine of R. palmatum-S. miltiorrhiza groups （6， 3 g/kg， by crude drug）， with 10 rats in each group. Sham operation group and model group were given constant volume of water intragastrically. Administration groups were given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 12 weeks. After last administration， the contents of creatinine （Scr） and urea nitrogen （BUN） in serum， the content of urinary creatinine （Ucr） in urine were determined by automatic biochemical analyzer; creatinine clearance rate （Ccr） was calculated. The contents of enterogenous urotoxin [trimethylamine-N-oxide （TMAO）， indoxyl sulfate （IS） and p-cresyl sulphate （PCS）] were determined by UPLC-ESI-MS/MS. Real-time RT-PCR and immunofluorescence assay were used to detect the mRNA and protein expression of Occludin and ZO-1 in the ileum tissue. HE staining and Masson staining were used to observe the pathological changes of renal tissue. The ultrastructural changes of rat colon were observed by transmission electron microscope. RESULTS： Compared with sham operation group， serum contents of Scr， BUN， TMAO， PCS and IS were increased significantly in model group （P<0.01）， while urine content of Ucr， Ccr， mRNA and protein expression of Occludin and ZO-1 in ileum tissue were decreased significantly （P<0.01）; renal glomerulosclerosis， renal tubules dilation and inflammatory invasion and fibrosisin the interstitium were all found; the intestinal epithelial barrier structure of colon tissue was severely damaged. Compared with model group， serum contents of Scr， BUN， TMAO， PCS and IS were decreased significantly in administration groups （P<0.05 or P<0.01）; the mRNA and protein expression of Occludin and ZO-1 in the ileum tissue were increased significantly （except for mRNA expression of ZO-1 in R. palmatum-S. miltiorrhiza low-dose group （P<0.05 or P<0.01）; the infiltration of inflammatory cells in renal interstitium， the degree of fibrosis and the damage of intestinal epithelial barrier structure in colon tissue were reduced. CONCLUSIONS： Couplet medicine of R. palmatum-S. miltiorrhiza can effectively protect the residual renal function of CRF model rats， the mechanism of which may be associated with reducing the serum contents of enterogenous urotoxin， up-regulating mRNA and protein expresssion of Occludin and ZO-1 in the ileum tissue so as to improve intestinal barrier function.

KEYWORDS? ?Rheum palmatum; Salvia miltiorrhiza; Chronic renal failure; Enterogenous urotoxins;Intestinal barrier; Rats

慢性腎衰竭（Chronic renal failure，CRF）多發(fā)生于各種慢性腎病后期，表現(xiàn)為不可逆的進(jìn)行性腎功能損害[1]。其發(fā)病率高、預(yù)后差、并發(fā)癥復(fù)雜，已成為全球重大公共衛(wèi)生問題[2]。因此，如何采取有效措施延緩CRF的進(jìn)展并防止并發(fā)癥的出現(xiàn)，是臨床亟需解決的難題。“腸-腎軸”理論[3]闡述了CRF中腎與腸道在病理上的密切關(guān)系，指出腸道菌群紊亂導(dǎo)致的腸源性尿毒素蓄積及腸道屏障損壞是促進(jìn)CRF進(jìn)展及其并發(fā)癥發(fā)生的重要因素[4]。因此，“從腸治腎”有望成為CRF治療的新途徑。

中藥治療CRF療效明確[5]，其中大黃-丹參藥對為臨床治療CRF的高頻藥對[6];且相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，大黃、丹參及其有效成分對腸道屏障功能均具有保護(hù)作用[7-9]。基于“復(fù)方-藥對-有效成分”的研究思路，本課題組初步證實(shí)了大黃-丹參藥對具有保護(hù)CRF大鼠腎功能的作用，但具體機(jī)制不明?；诖?，本研究采用5/6腎切除法復(fù)制CRF模型大鼠，從腸源性尿毒素、腸道屏障角度探討大黃-丹參藥對延緩CRF進(jìn)展的相關(guān)作用機(jī)制，以期為中藥基于腸道系統(tǒng)治療CRF提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：單級微手術(shù)電凝器（武漢春光醫(yī)療美容儀器有限公司），7080型全自動生化儀（日本積水醫(yī)療科技有限公司），LC-30A型超高效液相色譜儀、LCMS-8040型三重四極桿質(zhì)譜儀聯(lián)用系統(tǒng)（日本島津公司），EG1150H型自動生物組織包埋機(jī)、UC7型超薄切片機(jī)、RM2255型切片機(jī)（德國Leica儀器有限公司），Ci-L型顯微鏡、Ni-U型熒光顯微鏡（日本Nikon公司），ME203E型電子分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司），ST16R型高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司），GET96-PLUS型基因擴(kuò)增儀（杭州柏恒科技有限公司），ABI7500型實(shí)時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）儀（美國ABI公司），HT7700型透射電子顯微鏡（日本HITACHI公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用主要藥品與試劑有：大黃、丹參飲片[天津市中藥飲片廠有限公司，批號分別為G1707045-01、G1706160-01;將兩種飲片按1 ∶ 1質(zhì)量比配伍，水煎煮2次后濃縮制成每毫升約含1.1 g（生藥）的濃縮液]，尿毒清顆粒（康臣藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號20181168，規(guī)格5 g/袋），注射用青霉素鈉[哈藥集團(tuán)制藥總廠，批號18020402-2，規(guī)格0.48 g（按C16H17N2NaO4S計）;使用時每瓶用5 mL生理鹽水溶解]，戊巴比妥鈉（北京化學(xué)試劑公司，批號020919），明膠海綿（江西眾強(qiáng)實(shí)業(yè)有限公司，批號20190328），蘇木素染色液、伊紅染色液、Masson染色液（北京索萊寶科技有限公司，批號分別為G1140、G1100、G1343），氧化三甲胺（TMAO）、對甲基苯基硫酸鉀、吲哚酚硫酸酯鉀鹽（上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司，批號1184-78-7、91978-69-7、2642-37-7，純度均大于98.0%），小鼠抗大鼠閉合蛋白（Occludin）單克隆抗體（美國Invitrogen公司，批號33-1500），兔抗大鼠緊密連接蛋白1（ZO-1）多克隆抗體（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號61-7300），Alexa Fluor? 555標(biāo)記的羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗、Alexa Fluor? 488標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（美國CST公司，批號分別為4409、4412），二脒基苯基吲哚（DAPI）、防熒光淬滅封片液[愛必信（上海）生物科技有限公司，批號分別為abs47047616、abs9234]，Trizol試劑、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號分別為CW0508S、CW2569M、CW2601M），乙腈、甲酸（色譜純），去離子水，PCR引物（由生工生物工程股份有限公司合成，引物序列及產(chǎn)物長度信息見表1）;其余試劑為實(shí)驗(yàn)室常用規(guī)格。

1.3 動物

本研究所用大鼠為SPF級雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量為180～200 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)合格證號為SCXK（京）2016-0006。動物飼養(yǎng)于天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所動物房，動物使用許可證號為SYXK（津）2016-0007。所有操作均嚴(yán)格按照天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動物倫理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行，并經(jīng)過倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號IMPS-EAEP-Z-2018B1008-02）。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

55只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，隨機(jī)取10只大鼠作為假手術(shù)組（分離腎組織，但并不切除），剩余大鼠采用5/6腎切除法[10]復(fù)制CRF模型大鼠。具體操作如下：大鼠先行右側(cè)2/3腎切除手術(shù)——術(shù)前2 h肌內(nèi)注射青霉素鈉（0.3 mL/只）預(yù)防感染，再腹腔注射戊巴比妥鈉（45? ?mg/kg）麻醉后，剃去右側(cè)腎區(qū)的毛發(fā)，并用碘伏-75%酒精消毒，以手術(shù)刀切開皮膚，找出右腎，剝離腎膜;以止血鉗夾住右腎的腎蒂，剪去右腎的上1/3和下1/3，以電凝器將切面有效止血，再用明膠海綿吸附止血后，將腎平穩(wěn)放回腹腔，逐層縫合。1周后大鼠再行左腎全切術(shù)——用3-0手術(shù)線結(jié)扎左腎腎蒂，切去左腎。各組大鼠于第2次術(shù)后1周，進(jìn)行眼眶取血，并測定血清中肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）含量，當(dāng)兩者水平較假手術(shù)組均升高時，表明大鼠造模成功（本研究共剔除死亡和不成模大鼠5只）。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、尿毒清顆粒組（2.5 g/kg，劑量根據(jù)臨床等效劑量換算而得）和大黃-丹參藥對高、低劑量組[6、3 g/kg（以生藥量計），劑量根據(jù)臨床等效劑量的12、6倍換算而得]，每組10只。假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃等體積水，給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥物（以水作為溶劑，灌胃體積為10 mL/kg），每天1次，連續(xù)12周。

2.2 標(biāo)本采集

末次給藥后，收集各組大鼠24 h尿液，以檢測尿肌酐（Ucr）含量。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（45 mg/kg）麻醉后，于腹主動脈取血。血樣靜置1～2 h后，以3 000? ? ? r/min離心10 min，分離上層血清于-20 ℃凍存，以檢測相關(guān)生化指標(biāo)。取血完成后，剖取各組大鼠腎組織，以4%多聚甲醛固定，用于蘇木素-伊紅（HE）染色和Masson染色;剖取回腸，部分用4%多聚甲醛固定，用于免疫熒光檢測，其余部分于-80 ℃凍存，用于RT-PCR檢測;剖取結(jié)腸，用2.5%戊二醛固定，用于透射電鏡觀察。

2.3 大鼠血清和尿液中腎功能指標(biāo)的檢測

取“2.2”項下采集的尿液和血清樣本，按照相關(guān)試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用全自動生化分析儀檢測血清中Scr、BUN含量和尿液中Ucr含量，并計算肌酐清除率[Ccr，Ccr=（Ucr×24 h尿量）/（Scr×1 440）]。

2.4 大鼠血清中腸源性尿毒素含量的檢測

取“2.2”項下采集的血清樣本，采用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（UHPLC-ESI-MS/MS）法同時測定大鼠血清中TMAO、硫酸吲哚酚（IS）、硫酸對甲酚（PCS）的含量。色譜條件采用色譜柱為InertSustain C18（100 mm×3.0 mm，3.0 ?m）;柱溫為35 ℃;流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液（25 ∶ 75，V/V）;流速為0.4 mL/min;進(jìn)樣量為10 ?L。質(zhì)譜條件采用離子源為ESI，正負(fù)離子模式;定量分析采用多重反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）;加熱模塊溫度為400 ℃;DL溫度為250 ℃;霧化氣流速為3.0 L/min;干燥氣流速為15 L/min;離子源電壓為4.0 kV。TMAO、IS、PCS質(zhì)譜分析條件見表2。

2.5 大鼠回腸組織中Occludin、ZO-1 mRNA表達(dá)水平的檢測

采用RT-PCR進(jìn)行檢測。按相關(guān)試劑（盒）說明書操作，將“2.2”項下凍存的各組大鼠回腸組織用Trizol試劑提取總RNA，并測定RNA濃度，然后將其稀釋為250 mg/L，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。取cDNA 1 μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（20 μL）包括：2×UltraSYBR Mixture 10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 1.6 μL，ddH2O 6.8 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃ 變性15 s，60 ℃ 退火1 min，40個循環(huán)。溶解條件為：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。以GADPH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算Occludin、ZO-1的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

2.6 大鼠回腸組織中Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)水平檢測

采用免疫熒光法進(jìn)行檢測。將“2.2”項下4%多聚甲醛固定好的回腸組織脫水，石蠟包埋后切片（4 μm），用二甲苯和100%、95%、85%、75%的乙醇溶液對切片進(jìn)行脫蠟，再以微波爐加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻至室溫后，以磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次;以5% BSA封閉40 min，向切片表面均勻滴加Occludin、ZO-1一抗（稀釋度分別為1 ∶ 100、1 ∶ 50），于4 ℃冰箱孵育過夜;以PBS洗滌3次后，向切片表面均勻滴加熒光二抗（稀釋度為1 ∶ 500），室溫避光孵育2 h;以PBS洗滌3次，滴加DAPI染色液復(fù)染細(xì)胞核，于室溫避光孵育10 min;以PBS洗滌3次，向切片滴加防熒光淬滅封片液封片，然后置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。采用Imaging 5.10.00軟件分析紅色和綠色區(qū)域的熒光強(qiáng)度（紅色熒光表示Occludin蛋白的陽性染色，綠色熒光表示ZO-1蛋白的陽性染色），用熒光強(qiáng)度來表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

2.7 大鼠腎組織的病理學(xué)形態(tài)觀察和結(jié)腸組織的超微結(jié)構(gòu)觀察

將“2.2”項下4%多聚甲醛固定好的腎組織脫水，石蠟包埋后切片（4 μm），進(jìn)行HE和Masson染色，然后于顯微鏡下觀察腎組織病理學(xué)形態(tài)變化并拍照。將“2.2”項下2.5%戊二醛固定好的結(jié)腸組織取出，于PBS中浸洗3次，以1%鋨酸室溫固定2 h，再以50%～100%的乙醇溶液和丙酮逐級脫水，然后浸透、包埋后，切片（60～80 nm），行乙酸雙氧鈾和酸鉛雙重染色，于透射電鏡下觀察并拍照。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大黃-丹參藥對對CRF模型大鼠血清和尿液中腎功能指標(biāo)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中Scr、BUN含量均顯著升高，尿液中Ucr含量和Ccr均顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，尿毒清顆粒組和大黃-丹參藥對高、低劑量組大鼠血清中Scr、BUN含量均顯著降低，尿液中Ucr含量顯著升高（P<0.05或P<0.01），詳見表3。

3.2 大黃-丹參藥對對CRF模型大鼠腸源性尿毒素含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中TMAO、PCS、IS含量均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，尿毒清顆粒組和大黃-丹參藥對高、低劑量組大鼠血清中TMAO、PCS、IS含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表4。

3.3 大黃-丹參藥對對CRF模型大鼠回腸組織中Occludin、ZO-1 mRNA表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠回腸組織中Occludin、ZO-1 mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，尿毒清顆粒組和大黃-丹參藥對高劑量組大鼠回腸組織中Occludin、ZO-1 mRNA以及大黃-丹參藥對低劑量組的Occludin mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），詳見表5。

3.4 大黃-丹參藥對對CRF模型大鼠回腸組織中Occludin和ZO-1蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠回腸組織中Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，尿毒清顆粒組和大黃-丹參藥對高、低劑量組大鼠回腸組織中Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01），詳見圖1、表6。

3.5 大黃-丹參藥對對CRF模型大鼠腎組織病理學(xué)形態(tài)的影響

HE和Masson染色結(jié)果均顯示：假手術(shù)組大鼠腎小球正常，腎小管上皮完整，未見變性、壞死及管型，腎間質(zhì)未見炎癥細(xì)胞浸潤和纖維化;模型組大鼠部分腎小球硬化，腎小管擴(kuò)張，腎間質(zhì)可見炎癥細(xì)胞浸潤和纖維化;與模型組比較，尿毒清顆粒組和大黃-丹參藥對高、低劑量組大鼠腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤和纖維化均有不同程度減輕，詳見圖2。

3.6 大黃-丹參藥對對CRF模型大鼠結(jié)腸組織超微結(jié)構(gòu)的影響

假手術(shù)組大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞輕微水腫，細(xì)胞膜完整;胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器數(shù)量豐富、結(jié)構(gòu)完整;微絨毛排列整齊、長短均一，未見明顯萎縮、脫落;上皮細(xì)胞間緊密連接、中間連接數(shù)量較多，橋粒豐富，細(xì)胞間隙狹窄;腸上皮屏障結(jié)構(gòu)完整。模型組大鼠腸上皮細(xì)胞重度水腫，上皮細(xì)胞大面積脫落、游離，細(xì)胞膜局部破損;胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器數(shù)量豐富，細(xì)胞器腫脹;微絨毛排列稀疏、大面積脫落;上皮細(xì)胞間緊密連接、中間連接數(shù)量減少，橋粒致密區(qū)較小，可見少量半橋粒，細(xì)胞間隙明顯增寬，腸上皮結(jié)構(gòu)屏障重度損傷。尿毒清顆粒組和大黃-丹參藥對高、低劑量組大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞中度水腫，細(xì)胞膜完整;胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器數(shù)量豐富，明顯腫脹;微絨毛排列整齊、長短均一，局部略微稀疏;上皮細(xì)胞間緊密連接、中間連接數(shù)量較多，橋粒豐富，細(xì)胞間隙小區(qū)域增寬;腸上皮屏障結(jié)構(gòu)損傷程度較模型組減輕，詳見圖3。

4 討論

CRF屬中醫(yī)學(xué)“溺毒”“水腫”“腎勞”“關(guān)格”等范疇，脾腎衰敗、水毒濕濁潴留是引起CRF的關(guān)鍵病因，因此治療CRF應(yīng)從通腑泄?jié)?、活血化瘀方面進(jìn)行[11]。大黃為通腑泄?jié)岽硭?，有推陳致新、清泄?jié)岫镜墓π?丹參為活血化瘀類藥物，有祛瘀生新、通行血脈之效[12]。基于此，本文研究大黃-丹參藥對對CRF模型大鼠腸源性尿毒素和腸道屏障功能的影響，以探討其對CRF緩解作用的機(jī)制。尿毒清顆粒是臨床治療CRF的常用藥物，在我國使用超過10年，療效顯著，具有通腑泄?jié)?、健脾利濕、活血化瘀等功效[13]，與大黃-丹參藥對的泄?jié)峄鲋畏╗6]類似，因此本研究選擇尿毒清顆粒作為陽性對照藥。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大黃-丹參藥對能夠顯著降低CRF模型大鼠血清中BUN、Scr含量，升高尿液中Ucr含量及Ccr，提示該藥對能夠通過促進(jìn)Scr的排泄來發(fā)揮保護(hù)CRF大鼠腎功能的作用。

在CRF進(jìn)展過程中，腸道系統(tǒng)會發(fā)生病變;而從修復(fù)腸道屏障和調(diào)節(jié)腸道代謝物等角度治療CRF中的腸道病變，對延緩CRF進(jìn)程、減緩腎損傷及降低心血管并發(fā)癥風(fēng)險等具有效果[4，14]。腸源性尿毒素是來源于食物且由腸道菌群酵解產(chǎn)生的一類腸道代謝物;膳食-腸道微生物-肝共同組成了腸源性尿毒素的生物合成途徑[15]。新生成的游離腸源性尿毒素如PCS和IS會與血液中的白蛋白可逆性地非共價結(jié)合，再循環(huán)到腎，通過腎小管上皮細(xì)胞主動分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制排出體外[16]。CRF患者的腸道環(huán)境因飲食變化和血液循環(huán)中尿毒素的流入而改變，促進(jìn)了腸源性尿毒素的生成;又因CRF患者腎功能受損、排出途徑受阻，導(dǎo)致腸源性尿毒素的體內(nèi)蓄積[17]。相關(guān)研究表明，蓄積的腸源性尿毒素可通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、激活炎癥反應(yīng)等機(jī)制促進(jìn)腎細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，加速腎纖維化進(jìn)程[15]。因此，降低腸源性尿毒素含量能有效延緩CRF進(jìn)展。本研究以尿毒素TMAO、PCS和IS為指標(biāo)，探討了大黃-丹參藥對清除腸源性尿毒素的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該藥對能有效降低血清中腸源性尿毒素的含量，提示其能促進(jìn)腸源性尿毒素的排泄，從而更好地保護(hù)CRF模型大鼠殘存的腎功能。

腸上皮屏障由一層連續(xù)的上皮細(xì)胞和將上皮細(xì)胞間隙密封起來的頂端連接復(fù)合體組成，是腸道屏障的主要決定因素，對維持腸道內(nèi)微生態(tài)、阻止病原微生物侵入至關(guān)重要[4]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，尿毒素水平的升高和脲酶菌群的增殖會增加腸道內(nèi)氨的產(chǎn)生，過量的氨轉(zhuǎn)化為氫氧化銨，可引起腸道pH值的改變和腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白的破壞[18]。腸屏障功能受損、腸道通透性增加、內(nèi)毒素入血引發(fā)炎癥反應(yīng)，會加重腎損傷[19]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠回腸組織中Occludin、ZO-1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;腎組織腎小球硬化，腎小管擴(kuò)張，腎間質(zhì)可見炎癥細(xì)胞浸潤和纖維化;結(jié)腸上皮屏障結(jié)構(gòu)重度損傷，表明CRF模型大鼠的腎組織和腸道屏障功能受損。經(jīng)大黃-丹參藥對干預(yù)后，大鼠回腸組織中Occludin、ZO-1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（低劑量組的ZO-1 mRNA除外，P<0.05或P<0.01）;腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤、纖維化程度和結(jié)腸上皮屏障結(jié)構(gòu)損傷程度均減輕，表明該藥對可減輕CRF模型大鼠的腸道屏障功能損傷。

綜上所述，大黃-丹參藥對能有效保護(hù)CRF模型大鼠殘存的腎功能;其作用機(jī)制可能與降低大鼠血清中腸源性尿毒素含量，上調(diào)回腸組織中Occludin、ZO-1的mRNA及蛋白表達(dá)水平從而改善腸道屏障功能有關(guān)。

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（收稿日期：2020-12-14 修回日期：2021-01-05）

（編輯：唐曉蓮）