陳曉璐，郭振旺，鄧家剛, 3, 4，郝二偉, 3, 4，杜正彩, 3, 4，盧炳達(dá)，任 鑫，侯小濤, 3*

基于肉桂質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）預(yù)測(cè)的質(zhì)量控制研究

陳曉璐1, 2，郭振旺2，鄧家剛2, 3, 4，郝二偉2, 3, 4，杜正彩2, 3, 4，盧炳達(dá)1，任 鑫1，侯小濤1, 2, 3*

1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530200 2. 廣西中藥藥效研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530200 3. 廣西農(nóng)作物廢棄物功能成分研究協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧 530200 4. 廣西中醫(yī)藥大學(xué) 廣西中醫(yī)藥科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，廣西 南寧 530200

建立一種基于肉桂質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker）預(yù)測(cè)的質(zhì)量控制方法，并運(yùn)用化學(xué)計(jì)量學(xué)綜合分析不同產(chǎn)地肉桂質(zhì)量差異。采用高效液相色譜法，通過(guò)同時(shí)測(cè)定肉桂中肉桂醛、香豆素、肉桂醇、肉桂酸及鄰甲氧基肉桂醛5種Q-Marker含量，建立肉桂藥材的指紋圖譜，采用聚類分析、主成分分析等化學(xué)計(jì)量學(xué)手段對(duì)27批肉桂藥材質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。建立了一測(cè)多評(píng)法，肉桂醇、肉桂酸及鄰甲氧基肉桂醛與內(nèi)參物肉桂醛的相對(duì)校正因子分別為0.135 7、0.211 5、1.592 7；建立了不同產(chǎn)地27批肉桂的HPLC指紋圖譜及共有模式，并進(jìn)行聚類分析、主成分分析和正交偏最小二乘判別分析。結(jié)果顯示，27批不同產(chǎn)地肉桂可聚為5類，肉桂醛、香豆素是體現(xiàn)3個(gè)主產(chǎn)地間樣品差異的主要標(biāo)志性成分，并提示越南產(chǎn)的肉桂成分含量與中國(guó)廣東、廣西產(chǎn)的肉桂存在差異。建立的一測(cè)多評(píng)法能準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便地測(cè)定肉桂中Q-Marker的含量，不同產(chǎn)地的肉桂藥材質(zhì)量存在一定的差異性。為肉桂質(zhì)量控制提供了更為科學(xué)、全面的依據(jù)和基礎(chǔ)。

肉桂；質(zhì)量標(biāo)志物；一測(cè)多評(píng)法；化學(xué)計(jì)量學(xué)；香豆素；肉桂醇；肉桂酸；鄰甲氧基肉桂醛；肉桂醛

肉桂為樟科植物肉桂Presl的干燥樹皮，是我國(guó)傳統(tǒng)的“上品”中藥，具有悠久的應(yīng)用歷史。其味辛、甘，性大熱，歸腎、脾、心、肝經(jīng)，具有補(bǔ)火助陽(yáng)、引火歸元、散寒止痛、溫通經(jīng)脈的功效[1]。肉桂具有藥食同源的特質(zhì)，也是世界上重要的香料之一，相關(guān)產(chǎn)品涉及醫(yī)藥、調(diào)味品、日用品、食品、農(nóng)藥等領(lǐng)域。目前世界肉桂主要生產(chǎn)國(guó)為中國(guó)、印度尼西亞、越南及斯里蘭卡，2013年中國(guó)肉桂產(chǎn)量超越印度尼西亞成為世界第一大肉桂產(chǎn)區(qū)，并維持至今[2]。

《中國(guó)藥典》2015年版[3]僅以肉桂醛單一成分作為肉桂HPLC含量測(cè)定的指標(biāo)成分，不能充分反映肉桂藥材的質(zhì)量屬性。一測(cè)多評(píng)法（quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS）是依據(jù)中藥飲片及中藥制劑中多個(gè)有效成分之間存在的內(nèi)在函數(shù)關(guān)系，遴選出有效、廉價(jià)、易得的成分作為內(nèi)參物，建立一種測(cè)定單個(gè)有效成分實(shí)現(xiàn)同時(shí)測(cè)定多個(gè)有效成分的快速測(cè)定方法，可以很大程度上克服對(duì)多指標(biāo)成分質(zhì)量控制的限制[4]。目前，QAMS已廣泛應(yīng)用于玄參、茯苓、補(bǔ)骨脂等藥材的研究中[5-7]。

中藥質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker）理論指出，中藥質(zhì)量標(biāo)志物是能夠作為反映中藥安全性和有效性的標(biāo)示性物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制的一種或多種化學(xué)物質(zhì)[8]，為肉桂藥材的質(zhì)量控制提供了有益思路。根據(jù)Q-Marker概念，前期對(duì)肉桂Q-Marker進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析[9]，肉桂中的肉桂醛、鄰甲氧基肉桂醛成分為其抗炎、降血糖、免疫調(diào)節(jié)作用的主要功效成分；肉桂酸成分為其保護(hù)心肌細(xì)胞、抑制血小板聚集、抗菌作用的主要功效成分；肉桂醇成分為其抗菌作用的主要功效成分，是肉桂有效性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，可作為肉桂的主要Q-Marker。因此，本研究選擇香豆素、肉桂醇、肉桂酸、肉桂醛、鄰甲氧基肉桂醛等Q-Marker作為主要檢測(cè)指標(biāo)，建立多種Q-Marker的QAMS含量測(cè)定方法，并建立指紋圖譜，通過(guò)聚類分析、主成分分析和正交偏最小二乘判別分析對(duì)不同產(chǎn)地肉桂質(zhì)量進(jìn)行綜合分析，以期為建立一種以Q-Marker為導(dǎo)向的肉桂藥材質(zhì)量控制體系提供基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀，Waters 2998 PAD檢測(cè)器，Empower 2色譜數(shù)據(jù)工作站（美國(guó)Waters公司）；Agilent 1260高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；EL204萬(wàn)分之一電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；SQP十萬(wàn)分之一電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；SB25-12D超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；ELGA Classic UV型超純水儀（英國(guó)Veolia公司）；HL-1500A型萬(wàn)能粉碎機(jī)（上海塞耐機(jī)械有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品香豆素（批號(hào)DST190809-013，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%），成都德思特生物技術(shù)有限公司；肉桂醇（批號(hào)DL280148，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%）、肉桂醛（批號(hào)DF100126，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%），薩恩化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司；肉桂酸（批號(hào)C10197736，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%），上海麥克林生化科技有限公司；鄰甲氧基肉桂醛（批號(hào)S28D9G78359，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96%），上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲醇均為色譜純，Merck公司（德國(guó)）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.3 材料

11批（S01～S11）肉桂藥材樣品為實(shí)地采集，59批（S12～S70）均購(gòu)自廣西、廣東內(nèi)不同地區(qū)藥材市場(chǎng)，詳細(xì)信息見表1。經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授鑒定為樟科植物肉桂Presl的干燥樹皮。各批次藥材均留樣憑證存放于廣西中醫(yī)藥大學(xué)廣西中藥藥效研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫：0～20 min，24% A；20～21 min，24%～27% A；21～35 min，27%～35% A；體積流量1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL。在上述色譜條件下測(cè)定對(duì)照品及供試品溶液，5個(gè)成分的分離度良好，色譜圖見圖1。

表1 肉桂藥材來(lái)源信息表

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取對(duì)照品香豆素10.13 mg、肉桂醇0.50 mg、肉桂酸1.00 mg、肉桂醛50.00 mg、鄰甲氧基肉桂醛5.21 mg，置10 mL量瓶?jī)?nèi)，加甲醇溶解，并稀釋至刻度得到各對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別取對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL置于10 mL量瓶?jī)?nèi)，加甲醇稀釋至刻度，得到含香豆素1.013 0 mg/mL、肉桂醇0.050 3 mg/mL、肉桂酸0.100 1 mg/mL、肉桂醛5.005 0 mg/mL、鄰甲氧基肉桂醛0.521 5 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，依次稀釋1.25、1.67、2.5、5、10、20、100倍，得到1#～7#混合對(duì)照品溶液，備用。

1-香豆素 2-肉桂醇 3-肉桂酸 4-肉桂醛 5-鄰甲氧基肉桂醛

2.3 供試品溶液的制備

取不同產(chǎn)地肉桂粉末（過(guò)三號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率350 W，頻率35 kHz）30 min，放冷至室溫，稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系的考察 將“2.2”項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液按照“2.1”項(xiàng)下條件依次進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)（），溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到香豆素、肉桂醇、肉桂酸、肉桂醛、鄰甲氧基肉桂醛的回歸方程及線性范圍，見表2。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積及保留時(shí)間，結(jié)果顯示香豆素、肉桂醇、肉桂酸、肉桂醛、鄰甲氧基肉桂醛保留時(shí)間的RSD分別為0.11%、0.18%、0.11%、0.05%、0.04%，峰面積的RSD分別為1.80%、1.75%、1.70%、1.76%、1.77%，表明該方法精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次肉桂樣品（S58），按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果顯示香豆素、肉桂醇、肉桂酸、肉桂醛、鄰甲氧基肉桂醛峰面積的RSD分別為1.52%、1.91%、2.00%、1.63%、1.62%，表明室溫下樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表2 5種成分的線性回歸方程

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次肉桂樣品（S58），按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果顯示香豆素、肉桂醇、肉桂酸、肉桂醛、鄰甲氧基肉桂醛峰面積的RSD分別為1.90%、1.89%、1.93%、1.64%、1.73%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批次肉桂樣品（S58）共6份，每份約0.25 g，精密稱定，每份分別精密加入香豆素3.60 mg、肉桂醇0.22 mg、肉桂酸0.17 mg、肉桂醛14.30 mg、鄰甲氧基肉桂醛3.58 mg，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液5份，按照“2.1”項(xiàng)下條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算香豆素、肉桂醇、肉桂酸、肉桂醛、鄰甲氧基肉桂醛的平均加樣回收率分別為114.55%、111.40%、106.12%、97.63%、114.93%，RSD分別為1.46%、0.94%、1.28%、1.43%、0.96%，表明該方法的準(zhǔn)確性良好。

2.5 肉桂中多成分QAMS的建立及含量測(cè)定

2.5.1 相對(duì)校正因子（relative correction factors，）和的計(jì)算 取2#～7#混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，以肉桂醛為內(nèi)參物（s），對(duì)4種待測(cè)化合物香豆素（A）、肉桂醇（B）、肉桂酸（C）、鄰甲氧基肉桂醛（D）建立QAMS，各化合物的相對(duì)校正因子（s/i）根據(jù)以下公式計(jì)算[10-11]，結(jié)果顯示，香豆素、肉桂醇、肉桂酸、鄰甲氧基肉桂醛的RSD分別為1.15%、2.53%、3.61%、2.65%。

s/i(s/s)/(A/C)

s為內(nèi)參物對(duì)照品s峰面積，s為內(nèi)參物對(duì)照品s濃度，A為某待測(cè)成分對(duì)照品峰面積；C為某待測(cè)成分對(duì)照品濃度。

2.5.2 不同儀器和不同色譜柱對(duì)的影響 選取3種色譜柱（Waters XBridge C18色譜柱、Agilent 5 HC-C18色譜柱和Phenomenex Kinetex C18）和2種液相色譜系統(tǒng)（Waters e2695液相色譜系統(tǒng)和Aglient 1260液相色譜系統(tǒng)）對(duì)香豆素、肉桂醇、肉桂酸、鄰甲氧基肉桂醛的進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示香豆素、肉桂醇、肉桂酸、鄰甲氧基肉桂醛的RSD分別為1.54%、3.70%、1.24%、2.98%，結(jié)果表明在不同儀器和不同色譜柱下適應(yīng)性良好。

2.5.3 不同體積流量對(duì)的影響 采用Waters e2695液相色譜系統(tǒng)和Waters XBridge C18色譜柱分別在不同體積流量（0.8、1、1.2 mL/min）下測(cè)定不同濃度梯度的混合對(duì)照品溶液，得到香豆素、肉桂醇、肉桂酸、鄰甲氧基肉桂醛的RSD分別為0.70%、0.93%、0.96%、0.79%，結(jié)果表明在不同體積流量下適應(yīng)性良好。

2.5.4 不同柱溫對(duì)的影響 采用Waters e2695液相色譜系統(tǒng)和Waters XBridge C18色譜柱分別在不同柱溫（25、30、35 ℃）下測(cè)定不同濃度梯度的混合對(duì)照品溶液，得到香豆素、肉桂醇、肉桂酸、鄰甲氧基肉桂醛的RSD分別為0.39%、0.35%、0.83%、0.73%，結(jié)果表明不同柱溫下適應(yīng)性良好。

2.5.5 待測(cè)組分色譜峰定位 化合物的相對(duì)保留時(shí)間（relative retention time，RRT）可以用于樣品色譜圖中峰的標(biāo)定和指認(rèn)?；衔锵鄬?duì)保留時(shí)間（RRTs/i）根據(jù)以下公式計(jì)算。

RRTs/i＝RT/RTs

RT為待測(cè)化合物的保留時(shí)間，RTs為內(nèi)參化合物的保留時(shí)間。

結(jié)果顯示，香豆素、肉桂醇、肉桂酸、鄰甲氧基肉桂醛RRT的RSD分別為1.10%、3.30%、3.81%、1.71%，表明在不同高效液相色譜系統(tǒng)（Waters e2695液相色譜系統(tǒng)和Aglient 1260液相色譜系統(tǒng)）、不同品牌色譜柱（Waters XBridge C18色譜柱、Phenomenex Kinetex C18）中相對(duì)保留時(shí)間的重現(xiàn)性良好，說(shuō)明用RRT進(jìn)行色譜峰定位較為可行。

2.6 QAMS與外標(biāo)法（ESM）的含量測(cè)定結(jié)果分析

經(jīng)方法學(xué)優(yōu)化和考察后，對(duì)70批肉桂按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，采用QAMS建立內(nèi)參物肉桂醛與香豆素、肉桂醇、肉桂酸、鄰甲氧基肉桂醛的并對(duì)各成分含量進(jìn)行計(jì)算，同時(shí)采用ESM對(duì)香豆素、肉桂醇、肉桂酸、鄰甲氧基肉桂醛進(jìn)行含量測(cè)定，并對(duì)2種方法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，見表3。結(jié)果顯示，以QAMS法測(cè)定肉桂中香豆素含量與ESM法的結(jié)果有較大差異，考慮以肉桂醛作為內(nèi)參物的QAMS不適用于對(duì)香豆素的含量測(cè)定。而肉桂中肉桂醇、肉桂酸、鄰甲氧基肉桂醛的QAMS和ESM計(jì)算樣品中其余成分含量無(wú)顯著性差異，提示以肉桂醛為內(nèi)參物計(jì)算肉桂醇、肉桂酸、鄰甲氧基肉桂醛的含量測(cè)定方法具有較好的準(zhǔn)確性和可行性，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以應(yīng)用于肉桂提取物的質(zhì)量控制研究。

2.7 肉桂指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

為保證不同產(chǎn)地的肉桂均能納入指紋圖譜的分析范圍，樣品批次較少的產(chǎn)地如廣東肇慶市高良鎮(zhèn)、廣東云浮市郁南縣千官鎮(zhèn)大全產(chǎn)區(qū)、廣西東興等均選入分析，樣品批次較多的產(chǎn)地如廣西防城港防城區(qū)、廣西貴港市平南縣、廣西玉林市容縣等則隨機(jī)篩選出2～3批進(jìn)行指紋圖譜的建立。取27批產(chǎn)地為不同產(chǎn)地肉桂藥材色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”，設(shè)定S16為參照譜圖，采用中位數(shù)法進(jìn)行自動(dòng)匹配，加以多點(diǎn)校正，得到肉桂藥材的對(duì)照譜圖，并進(jìn)行相似度分析，樣品疊加圖見圖2。在共有模式下，標(biāo)定了6個(gè)共有色譜峰C1、C2、C3、C5、C6、C7，見圖3。相似度分析結(jié)果顯示27批樣品與對(duì)照?qǐng)D譜間的相似度為0.865～0.995，表明27批藥材相似度較高。通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)，確定C3、C4、C5、C6、C7號(hào)峰分別為香豆素、肉桂醇、肉桂酸、肉桂醛、鄰甲氧基肉桂醛。由于S03、S11、S48、S54、S55、S56批次未檢測(cè)出肉桂醇，因此C4號(hào)色譜峰肉桂醇未被標(biāo)記為共有峰。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果

續(xù)表3

ND表示未檢出

ND means not detected

圖2 27批肉桂藥材HPLC疊加圖

C3-香豆素 C4-肉桂醇 C5-肉桂酸 C6-肉桂醛 C7-鄰甲氧基肉桂醛

2.8 化學(xué)模式識(shí)別研究

2.8.1 聚類分析 以指紋圖譜C1、C2、C3、C5、C6、C7號(hào)共有峰的峰面積作為原始數(shù)據(jù)，采用SPSS 20.0軟件，以平均Euclidean距離為度量標(biāo)準(zhǔn)，采用組間連接法對(duì)已建立指紋圖譜的27批不同產(chǎn)地肉桂進(jìn)行聚類分析，見圖4。通過(guò)分析可知，當(dāng)組間距為10時(shí)，樣品可聚為5類，產(chǎn)地為廣東肇慶的S57、S59聚為一類，產(chǎn)地為越南清化的S70單獨(dú)聚為一類，產(chǎn)地為越南的S66、S67聚為一類，產(chǎn)地為越南清化的S68單獨(dú)聚為一類，其余批次聚為一類。聚類分析結(jié)果表明，越南產(chǎn)的肉桂與廣西、廣東2個(gè)產(chǎn)地的藥材質(zhì)量具有一定的差異性，除廣東肇慶產(chǎn)肉桂外廣西產(chǎn)地的肉桂藥材與廣東產(chǎn)的無(wú)顯著差異性。

2.8.2 主成分分析 對(duì)已建立指紋圖譜的27批不同產(chǎn)地肉桂C1、C2、C3、C5、C6、C7號(hào)共有峰的峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行主成分分析。結(jié)果顯示，共得到3個(gè)主成分因子，特征值分別為2.301、1.768、0.867，方差貢獻(xiàn)率分別為38.354%、29.467%、14.458%，累積方差貢獻(xiàn)率為82.279%，它代表了6個(gè)成分量的82.279%的信息量[12]，提示主成分因子1、2、3可作為不同產(chǎn)地肉桂的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

通過(guò)Kaiser標(biāo)準(zhǔn)化的正交旋轉(zhuǎn)法處理得到旋轉(zhuǎn)后的因子載荷矩陣見表4，主成分因子1與C3號(hào)、C5號(hào)、C6號(hào)峰相關(guān)性較強(qiáng)；主成分因子2對(duì)C1號(hào)、C2號(hào)峰的影響較大；主成分因子3對(duì)C3號(hào)、C7 號(hào)峰的影響最大。主成分與對(duì)應(yīng)變量計(jì)算可得主成分的得分（）：1＝?0.0891＋0.0142＋0.5693＋0.9315＋0.8326＋0.0617；2＝0.9191＋0.9162＋0.2423－0.1035－0.0626－0.2957；3＝?0.1811－0.0412＋0.5183－0.1175＋0.2896＋0.8957（i表示共有峰的峰面積經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)）。根據(jù)提取得到的3個(gè)主成分因子對(duì)27批次樣品進(jìn)行評(píng)分，計(jì)算綜合得分：＝(1×W1＋2×W2＋3×W3)/累積方差貢獻(xiàn)率（W1、W2、W3為主成分對(duì)應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率）。對(duì)主成分得分及綜合得分進(jìn)行排序，結(jié)果見表5，綜合得分越高，表明質(zhì)量越好[13]。結(jié)果顯示，中國(guó)廣西防城港防城區(qū)、廣東羅定、廣東肇慶市祿步鎮(zhèn)與越南產(chǎn)地的藥材質(zhì)量較好，對(duì)比相應(yīng)的指紋圖譜信息發(fā)現(xiàn)上述產(chǎn)地樣品中香豆素、肉桂酸、肉桂醛、鄰甲氧基肉桂醛的峰面積均較大，證明通過(guò)主成分分析提取的3個(gè)主成分能夠基本體現(xiàn)指紋圖譜的信息。

圖4 聚類分析圖

表4 主成分因子與變量間相關(guān)系數(shù)

分別以主成分因子1、2、3建立坐標(biāo)系，27批次不同產(chǎn)地肉桂藥材得分結(jié)果見圖5。主成分分析得分圖可將肉桂藥材分為3類，該分類情況與聚類分析結(jié)果吻合，表明除越南產(chǎn)肉桂與中國(guó)廣東肇慶產(chǎn)肉桂外，廣西與廣東的肉桂質(zhì)量相似，沒(méi)有明顯差異。

2.8.3 正交偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA） 用SIMCA 14.1軟件對(duì)27批不同產(chǎn)地肉桂樣品進(jìn)行OPLS-DA分析，根據(jù)聚類分析和主成分分析得到的結(jié)果，用OPLS-DA分別對(duì)廣西產(chǎn)地和越南產(chǎn)地、廣東產(chǎn)地和越南產(chǎn)地進(jìn)行建模分析。廣西和越南產(chǎn)地OPLS-DA模型2（cum）＝0.896，2（cum）＝0.888，2（cum）＝0.581；中國(guó)廣東和越南產(chǎn)地OPLS-DA模型2（cum）＝0.914，2（cum）＝0.908，2（cum）＝0.750，可見2、2均大于0.5，說(shuō)明模型穩(wěn)定可靠，可用于中國(guó)廣西和廣東肉桂樣品與越南樣品的區(qū)分，得分圖見圖6、7，明顯看出中國(guó)廣西與廣東所產(chǎn)的肉桂明顯區(qū)別于越南產(chǎn)的肉桂，廣東肇慶產(chǎn)地肉桂明顯區(qū)別于廣東其他產(chǎn)地肉桂，與聚類分析、主成分分析結(jié)果基本一致。采用變量重要性投影值VIP＞1為標(biāo)準(zhǔn)，可確定肉桂醛、香豆素是體現(xiàn)中國(guó)廣西、越南2個(gè)主產(chǎn)地間樣品差異的主要標(biāo)志性成分，肉桂醛、香豆素是體現(xiàn)中國(guó)廣東、越南2個(gè)主產(chǎn)地間樣品差異的主要標(biāo)志性成分，其余成分VIP值小于1，對(duì)樣品的區(qū)分影響較小，結(jié)果見圖8、9。

表5 主成分因子得分及綜合得分

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法及色譜條件的選擇

本實(shí)驗(yàn)考察了提取方式（超聲與靜置過(guò)夜）、提取時(shí)間（10、20、30 min）和提取溶劑（甲醇、50%乙醇、蒸餾水），實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示超聲提取30 min，提取溶劑選用甲醇對(duì)目標(biāo)成分提取的效果最佳。

圖5 肉桂藥材樣品主成分分析得分圖

圖6 中國(guó)廣西和越南OPLS-DA得分圖

圖7 中國(guó)廣東省和越南OPLS-DA得分圖

圖8 中國(guó)廣西壯族自治區(qū)和越南產(chǎn)的肉桂樣品中6種成分的VIP值圖

圖9 中國(guó)廣東省和越南產(chǎn)的肉桂樣品中6種成分的VIP值圖

本實(shí)驗(yàn)前期對(duì)色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，各成分的分離效果較好，保留時(shí)間適當(dāng)，峰形良好。在檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇上，本實(shí)驗(yàn)采用PAD二極管陣列檢測(cè)器對(duì)香豆素、肉桂醇、肉桂酸、肉桂醛、鄰甲氧基肉桂醛在210～800 nm下進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，并分別比較了供試品在250、260、270、290 nm波長(zhǎng)下的紫外特征吸收光譜。在250 nm時(shí)，色譜峰信息全面、色譜圖的特征性較強(qiáng)，可以同時(shí)測(cè)定肉桂中的5種成分，測(cè)定數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性較好。

3.2 內(nèi)參物的選擇

參照QAMS建立的技術(shù)指南[10]，本實(shí)驗(yàn)選擇肉桂醛作為內(nèi)參物，該成分不僅普遍存在于各類肉桂藥材中，而且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、易于獲得，各成分的RSD均小于5%，較為穩(wěn)定。另外，分別考察了不同柱溫、不同體積流量、不同色譜柱對(duì)的影響，結(jié)果顯示RSD均小于5%，說(shuō)明選擇肉桂醛作為內(nèi)參物建立的QAMS方法可行。

3.3 肉桂QAMS質(zhì)量評(píng)價(jià)

中藥及其制劑具有“多成分、多靶點(diǎn)、整合作用”特點(diǎn)，因此任何單一成分都難以準(zhǔn)確表達(dá)中藥及其制劑的整體質(zhì)量。QAMS可根據(jù)中藥有效成分內(nèi)在的函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，通過(guò)測(cè)定一個(gè)成分含量后實(shí)現(xiàn)多個(gè)成分的同步測(cè)定[10,14]。多指標(biāo)綜合質(zhì)量控制模式相比單一的外標(biāo)法測(cè)定更加全面和快速，能滿足快速檢測(cè)的需求，成為中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的發(fā)展趨勢(shì)[11,15-16]。伍彩紅等[17]建立QAMS法測(cè)定肉桂中4種揮發(fā)油成分，所測(cè)成分缺少國(guó)外產(chǎn)區(qū)批次的對(duì)比研究，因此本實(shí)驗(yàn)添加了國(guó)外批次，對(duì)肉桂中香豆素、肉桂醇、肉桂酸、肉桂醛、鄰甲氧基肉桂醛進(jìn)行了含量測(cè)定。

本團(tuán)隊(duì)前期對(duì)肉桂Q-Marker進(jìn)行預(yù)測(cè)分析[9]，綜合考慮傳統(tǒng)功效及化學(xué)可測(cè)性，認(rèn)為香豆素、肉桂醇、肉桂酸、肉桂醛與鄰甲氧基肉桂醛可作為Q-Marker用于肉桂的整體質(zhì)量評(píng)控指標(biāo)。因此，本研究擬采用QAMS法同時(shí)測(cè)定香豆素、肉桂醇、肉桂酸、肉桂醛與鄰甲氧基肉桂醛5種成分的含量，但研究中發(fā)現(xiàn)，不同批次肉桂樣品中的香豆素含量測(cè)定結(jié)果的RSD值較大，測(cè)定結(jié)果存在較大誤差。分析其原因，不同類型化合物因化學(xué)性質(zhì)與紫外吸收特征具有較大差別，且系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)中香豆素線性范圍過(guò)寬，都可能導(dǎo)致香豆素的出現(xiàn)偏差，影響含量準(zhǔn)確性[18]。因此，以肉桂醛作為內(nèi)參物的QAMS并不適用于對(duì)香豆素的含量測(cè)定，本研究?jī)H建立了同時(shí)測(cè)定肉桂藥材中肉桂醇、肉桂酸、肉桂醛與鄰甲氧基肉桂醛4種指標(biāo)成分的QAMS方法，70批次的QAMS結(jié)果與ESM實(shí)測(cè)值無(wú)顯著差異，所建立的方法精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，QAMS在肉桂的多指標(biāo)成分質(zhì)量評(píng)價(jià)中應(yīng)用是可行的。

3.4 不同產(chǎn)地肉桂質(zhì)量評(píng)價(jià)

結(jié)果顯示，香豆素、肉桂醇、鄰甲氧基肉桂醛含量最高的是越南產(chǎn)地的肉桂，分別為14.45、0.53、11.69 mg/g；肉桂酸、肉桂醛含量最高的是廣州產(chǎn)地的肉桂，分別為0.60、86.11 mg/g。其中，廣東產(chǎn)地的30批次肉桂樣品中僅有6批次檢測(cè)出肉桂醇，廣西產(chǎn)地的34批次肉桂樣品中有21批次檢測(cè)出肉桂醇。為了更好的分析所測(cè)樣品中各含量的規(guī)律，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法建立了27批不同產(chǎn)地肉桂的指紋圖譜，相似度均在0.865以上，表明這27批肉桂藥材的整體質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定。為了更好地了解不同產(chǎn)地間藥材的差異，采用SPSS 20.0軟件對(duì)這27批肉桂藥材進(jìn)行聚類分析、主成分分析和正交偏最小二乘判別分析，結(jié)果顯示27批不同產(chǎn)地肉桂可聚為5類，肉桂醛、香豆素是體現(xiàn)3個(gè)主產(chǎn)地間樣品差異的主要標(biāo)志性成分，并提示越南產(chǎn)的肉桂成分含量與中國(guó)廣東、廣西產(chǎn)的肉桂存在差異，可能與生長(zhǎng)環(huán)境不同有關(guān)；而產(chǎn)于中國(guó)廣東、廣西的肉桂可能因生長(zhǎng)栽培環(huán)境相似，故無(wú)顯著差異。

3.5 肉桂Q-Marker的預(yù)測(cè)

為了準(zhǔn)確評(píng)價(jià)和控制中藥有效性，應(yīng)重點(diǎn)針對(duì)Q-Marker進(jìn)行研究分析。Q-Marker的研究和確定是基于有效、特有、傳遞與溯源、可測(cè)和處方配伍的“五原則”[8,19]，本研究前期已通過(guò)文獻(xiàn)研究全面系統(tǒng)的對(duì)肉桂Q-Marker進(jìn)行預(yù)測(cè)分析[9]，初步篩選出香豆素、肉桂醇、肉桂酸、肉桂醛與鄰甲氧基肉桂醛作為指標(biāo)成分。但通過(guò)含量測(cè)定及化學(xué)計(jì)量學(xué)分析研究可知，部分批次肉桂樣品中未能檢測(cè)出肉桂醇，因此暫時(shí)不將肉桂醇列為Q-Marker的考察范圍。研究結(jié)果表明香豆素、肉桂酸、肉桂醛與鄰甲氧基肉桂醛在不同產(chǎn)地肉桂中均穩(wěn)定存在且含量相對(duì)較高，具有明確的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性，是肉桂可能的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，反映出質(zhì)量標(biāo)志物的有效性、特有性和可測(cè)性的特征。結(jié)合前期預(yù)測(cè)結(jié)果推斷，中國(guó)廣東產(chǎn)地肉桂中肉桂酸、肉桂醛含量較高則長(zhǎng)于抗炎、降血糖、免疫調(diào)節(jié)作用、保護(hù)心肌細(xì)胞、抑制血小板聚集及抗菌作用；中國(guó)廣西產(chǎn)地肉桂大多含有肉桂醇，較廣東產(chǎn)地肉桂的抗菌作用更強(qiáng)；越南產(chǎn)地肉桂中香豆素、肉桂醇、鄰甲氧基肉桂醛含量最高則長(zhǎng)于抗菌、抗炎、抗氧化作用。為了更明確中國(guó)廣西、中國(guó)廣東、越南3個(gè)主產(chǎn)地肉桂存在差異性的原因，本研究結(jié)合主成分分析和OPLS-DA法進(jìn)一步篩選出2種差異性Q-Marker，分別為肉桂醛、香豆素。經(jīng)查閱可知，肉桂醛具有抗炎、降血糖、免疫調(diào)節(jié)作用，香豆素具有抗氧化、抗菌、抗癌等作用[20]，由此可推斷，中國(guó)廣西、中國(guó)廣東、越南3個(gè)主產(chǎn)地所產(chǎn)肉桂功效性差異，宜進(jìn)一步針對(duì)肉桂所含的肉桂醛、香豆素進(jìn)行藥效研究，探尋不同產(chǎn)地肉桂的功效差異機(jī)制，驗(yàn)證肉桂Q-Marker的預(yù)測(cè)結(jié)果。中藥的臨床應(yīng)用多以復(fù)方形式，本研究?jī)H初步對(duì)肉桂進(jìn)行Q-Marker預(yù)測(cè)，后期需以此為基礎(chǔ)結(jié)合相關(guān)復(fù)方，針對(duì)具體病癥進(jìn)行功效驗(yàn)證，以組方配伍規(guī)律，確定不同復(fù)方中肉桂的Q-Marker。

綜上所述，本研究建立了70批次不同產(chǎn)地肉桂藥材多種Q-Marker的HPLC QAMS含量測(cè)定方法，建立27批次不同產(chǎn)地肉桂藥材的指紋圖譜，通過(guò)聚類分析、主成分分析和OPLS-DA對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果顯示3個(gè)主產(chǎn)地的肉桂藥材的成分含量存在明顯差異，為后期深入研究肉桂的作用機(jī)制提供參考，有助于建立更全面的肉桂質(zhì)量控制體系，提高肉桂藥材的質(zhì)量控制水平。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì). 中華本草（第三冊(cè)） [M]. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1999: 34-42.

[2] 焦少珍. 世界桂皮生產(chǎn)、消費(fèi)和貿(mào)易格局分析 [J]. 世界農(nóng)業(yè), 2016(8): 124-129.

[3] 中國(guó)藥典 [S]. 一部. 2015: 137.

[4] Gao W, Wang R, Li D,. Comparison of fiveflowers by simultaneous determination of multi-components with single reference standard method and principal component analysis [J]., 2016, 117: 345-351.

[5] 閆丹, 江敏瑜, 王云紅, 等. 一測(cè)多評(píng)法在玄參藥材質(zhì)量控制中的應(yīng)用 [J]. 中草藥, 2018, 49(20): 4892-4898.

[6] 王妍妍, 施曉艷, 張?jiān)? 等. 一測(cè)多評(píng)法測(cè)定不同產(chǎn)地茯苓中4種三萜類成分的含量 [J]. 中草藥, 2018, 49(20): 4899-4904.

[7] 譚鵬, 許莉, 牛明, 等. 一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定補(bǔ)骨脂中16種化學(xué)成分的含量 [J]. 中草藥, 2019, 50(16): 3937-3946.

[8] 劉昌孝, 陳士林, 肖小河, 等. 中藥質(zhì)量標(biāo)志物(Q-Marker): 中藥產(chǎn)品質(zhì)量控制的新概念 [J]. 中草藥, 2016, 47(9): 1443-1457.

[9] 侯小濤, 郝二偉, 秦健峰, 等. 肉桂的化學(xué)成分、藥理作用及質(zhì)量標(biāo)志物(Q-marker)的預(yù)測(cè)分析 [J]. 中草藥, 2018, 49(1): 20-34.

[10] 王智民, 錢忠直, 張啟偉, 等.一測(cè)多評(píng)法建立的技術(shù)指南 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2011, 36(6): 657-658.

[11] 郭龍, 薛紫鯨, 劉愛(ài)朋, 等. 基于一測(cè)多評(píng)法的丹參酮提取物質(zhì)量控制 [J]. 中國(guó)現(xiàn)代中藥, 2019, 21(3): 357-364.

[12] 江華娟, 李敏敏, 何瑤, 等. 基于HPLC指紋圖譜和化學(xué)模式識(shí)別的經(jīng)典名方桃紅四物湯制備過(guò)程質(zhì)量評(píng)價(jià)研究 [J]. 中草藥, 2021, 52(4): 1000-1010.

[13] 徐男, 孫蓉, 李元媛, 等. 基于HPLC指紋圖譜、多成分定量結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地三棱藥材的質(zhì)量 [J]. 中草藥, 2019, 50(7): 1682-1689.

[14] 王智民, 高慧敏, 付雪濤, 等. “一測(cè)多評(píng)”法中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)模式方法學(xué)研究 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2006, 31(23): 1925-1928.

[15] Li S P, Zhao J, Yang B. Strategies for quality control of Chinese medicines [J]., 2011, 55(4): 802-809.

[16] Jiang Y, David B, Tu P F,. Recent analytical approaches in quality control of traditional Chinese medicines: A review [J]., 2010, 657(1): 9-18.

[17] 伍彩紅, 馮沖, 楊麗, 等. 一測(cè)多評(píng)法測(cè)定肉桂藥材中4種揮發(fā)油類成分 [J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2019, 54(5): 400-406.

[18] 秦昆明, 楊冰, 胡靜, 等. 一測(cè)多評(píng)法在中藥多組分質(zhì)量控制中的應(yīng)用現(xiàn)狀與思考 [J]. 中草藥, 2018, 49(3): 725-731.

[19] 張鐵軍, 白鋼, 陳常青, 等. 基于“五原則”的復(fù)方中藥質(zhì)量標(biāo)志物(Q-marker)研究路徑[J]. 中草藥, 2018, 49(1): 1-13.

[20] 楊陽(yáng). 肉桂酸和香豆素類衍生物的合成及其抗氧化性能的研究 [D]. 長(zhǎng)春: 吉林大學(xué), 2014.

Study on quality control ofbased on prediction of Q-Marker

CHEN Xiao-lu1, 2, GUO Zhen-wang2, DENG Jia-gang2, 3, 4, HAO Er-wei2, 3, 4, DU Zheng-cai2, 3, 4, LU Bing-da1, REN Xin1, HOU Xiao-tao1, 2, 3

1. School of Pharmacy, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China 2. Guangxi Key Laboratory of Efficacy Study on Chinese Materia Medica, Nanning 530200, China 3. Guangxi Collaborative Innovation Center of Functional Ingredients of Agricultural Residues, Nanning 530200, China 4. Guangxi Scientific Experimental Center of Traditional Chinese Medicine, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China

To establish a quantitative analysis ofbased on the prediction of quality marker (Q-Marker), and to analyze the quality differences offrom different areas by chemometrics.An HPLC method were developed for the determination of five quality markers including cinnamaldehyde, coumarin, cinnamyl alcohol, cinnamic acid, and-methoxy cinnamic aldehyde inin order to establish the fingerprints of. The quality of 27 batches ofwas evaluated by cluster analysis, principal component analysis, and other chemometrics methods.The relative correlation factors of cinnamyl alcohol, cinnamic acid, and-methoxy cinnamic aldehyde were 0.135 7, 0.211 5, and 1.592 7. The HPLC fingerprints and common patterns of 27 batches offrom different origins were established, and cluster analysis, principal component analysis and orthogonal partial least squares discriminant analysis were carried out. The results showed that 27 batches ofcan be clustered into five groups. Cinnamaldehyde and coumarin were the main symbolic components reflecting the difference among the three main producing areas. It was suggested that the content ofin Vietnam was different from that ofproduced in Guangdong and Guangxi Provinces of China.The established QAMS can accurately and easily determine the content of Q-Markers in. There are certain differences in the quality offrom different origins. It provides a more scientific and comprehensive basis for the quality control of.

Presl; Q-Marker; QAMS; chemometrics; coumarin; cinnamic alcohol; cinnamic acid;-methoxy cinnamaldehyde; cinnamaldehyde

R284

A

0253 - 2670(2021)09- 2707 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.09.021

2020-02-11

廣西科技基地和人才專項(xiàng)廣西中藥藥效研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)項(xiàng)目（17-259-20）；廣西科技基地和人才專項(xiàng)（桂科AD19110165）；農(nóng)作物廢棄物功能成分研究協(xié)同創(chuàng)新中心建設(shè)項(xiàng)目（CICAR2017-Y1）；廣西中醫(yī)藥大學(xué)一流學(xué)科建設(shè)子課題（2019XK103）；廣西中醫(yī)藥大學(xué)·一方制藥大學(xué)生科技創(chuàng)新課題項(xiàng)目（DXS2019058）

陳曉璐（1995—），女，碩士在讀，研究方向?yàn)橹兴幓钚猿煞旨百|(zhì)量控制研究。E-mail: 296649142@qq.com

侯小濤，博士生導(dǎo)師，教授，主要從事中藥活性成分與質(zhì)量控制研究。E-mail: xthou@126.com

[責(zé)任編輯 王文倩]