葉鳳凌 賈利蓉 何 強(qiáng) 董 怡

(四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610065)

脂氧合酶(Lipoxygenase，EC1.13.11.12，LOX)是一種氧化還原酶，可專門催化具有順,順-1,4戊二烯結(jié)構(gòu)的多不飽和脂肪酸發(fā)生分子內(nèi)加氧產(chǎn)生脂肪酸氫過氧化物[1]，例如，植物源的LOX底物主要是植物油脂中廣泛存在的亞油酸和亞麻酸[2-3]。LOX對(duì)油脂的劣變具有一定促進(jìn)作用，可導(dǎo)致油脂和含油食品在貯藏和加工過程中氧化酸敗，降低產(chǎn)品營養(yǎng)和食用特性[4-5]。抑制脂氧合酶活性是延長油脂貨架期，維持油脂營養(yǎng)價(jià)值的重要途徑之一。已有研究證明，植物中提取得到的多酚類物質(zhì)可通過螯合或還原LOX活性部位的亞鐵離子，或與脂質(zhì)自由基發(fā)生反應(yīng)從而中斷脂質(zhì)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[3]，達(dá)到良好的油脂氧化抑制作用[6-8]。

LOX酶活的常見測定方法有分光光度法、氧電極法、量壓法、同位素標(biāo)記法、顯色法、染色法等，其中分光光度法最簡便、快速，能做到連續(xù)且精準(zhǔn)的測定[9]。分光光度法通過測定LOX催化底物反應(yīng)生成具有共軛二烯結(jié)構(gòu)的氫過氧化合物的吸光度值(A234)，計(jì)算共軛二烯生成量，推算出酶活大小[1]。該法已被廣泛用于作物中LOX酶活性的檢測[10-11]，且已有較多研究利用該法檢測從茶葉[12]、虎杖根[8]、藍(lán)莓葉[6]等植物中提取的多酚類物質(zhì)對(duì)LOX酶活的抑制作用。

植物多酚常具有鄰苯三酚或鄰苯二酚結(jié)構(gòu)，其酚羥基具有供氫能力和供電子能力[13]，使得多酚具有較強(qiáng)的抗氧化性以及清除自由基的能力[14]。常見的植物多酚如槲皮素[15-16](quercetin，QCT)、沒食子酸[17-18](gallic acid，GA)、兒茶素[19](catechins，C)和3,4-二羥基苯乙酸[20](3,4-dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC)等均具有抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗腫瘤等多種活性[21-22]。但多酚所在緩沖體系的溶劑及pH可影響多酚的活性[23]。多酚在酸性環(huán)境中較為穩(wěn)定而在堿性環(huán)境不穩(wěn)定，且堿性越強(qiáng)穩(wěn)定性越差[24]。多酚在堿性條件下易脫下鄰位酚羥基上的H離子(酸堿中和反應(yīng))發(fā)生自氧化反應(yīng)生成半醌和醌類物質(zhì)，從而影響其活性[25]。多酚自氧化反應(yīng)的中間產(chǎn)物在320 nm左右有特征吸收峰，隨著反應(yīng)程度加劇或反應(yīng)時(shí)間延長，中間產(chǎn)物被氧化轉(zhuǎn)變?yōu)榻K產(chǎn)物，終產(chǎn)物在440 nm左右出現(xiàn)特征吸收峰[26-27]。在已有的利用紫外分光光度法檢測多酚對(duì)LOX酶活抑制作用的研究中[6，12]，檢測時(shí)所選取的緩沖體系多為硼酸鹽體系，所選取的pH一般以LOX的最適pH為準(zhǔn)，對(duì)該緩沖鹽體系及pH條件是否對(duì)多酚活性造成影響未有深入探討。

為優(yōu)化紫外分光光度法檢測多酚抑制LOX酶活方法中的反應(yīng)體系，試驗(yàn)擬研究不同緩沖體系和pH對(duì)LOX酶活力的影響，并選用QCT、GA、C、DOPAC 4種常見多酚，研究在不同緩沖體系和pH條件下4種多酚的自氧化情況，旨在為緩沖體系和pH對(duì)多酚自氧化及多酚對(duì)LOX酶抑制機(jī)理的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

硼酸、十水合四硼酸鈉(硼砂)、二甲基亞砜(DMSO)：分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司；

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉：分析純，成都科龍化工試劑廠；

吐溫20、Tris：分析純，德國BioFroxx公司；

鹽酸：分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司；

亞油酸、槲皮素(QCT)、沒食子酸(GA)、兒茶素(C)、3,4-二羥基苯乙酸(DOPAC)：分析純，上海源葉生物公司；

脂氧合酶(LOX)：活性5萬U/mg，上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

多功能微孔板檢測儀：Synergy H1型，美國BioTek公司；

電子天平：SQP型，奧多利斯科學(xué)儀器有限公司；

超聲波清洗器：KQ5200D型，東莞科喬超聲設(shè)備有限公司；

雷磁臺(tái)式pH計(jì)：PHS-3E型，儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試劑的配制

(1) 緩沖液：用0.05 mol/L Na2B4O7溶液和0.2 mol/L H3BO4溶液混合調(diào)配得到pH分別為9.0，8.5，8.0，7.5，7.0的0.2 mol/L硼酸鹽緩沖液。用0.2 mol/L NaH2PO4溶液和0.2 mol/L Na2HPO4溶液混合調(diào)配得到pH分別為8.0，7.5，7.0，6.5，6.0的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液。向50 mL 0.4 mol/L Tris溶液中滴加濃鹽酸溶液調(diào)節(jié)至所需pH后用蒸餾水定容至100 mL，得到pH分別為9.0，8.5，8.0，7.5，7.0的0.2 mol/L Tris-HCl 緩沖液。

(2) 多酚溶液：用DMSO溶解多酚，分別配制成0.05，0.10，0.25，0.50，1.00，10.00 mmol/L的QCT溶液、GA溶液、C溶液、DOPAC溶液。

(3) LOX酶液：將100 mg脂氧合酶溶于pH 9.0的0.2 mol/L硼酸鹽緩沖液中，制得酶活約為2 500 U/mL的酶液。

(4) 底物溶液：參照吳桂玲等[6]的方法并略作修改。將0.125 mL Tween 20與5 mL pH 9.0的0.2 mol/L硼酸鹽緩沖液混合，邊搖邊加入0.135 mL亞油酸，混勻后邊搖邊加入1 mol/L NaOH溶液直至澄清，調(diào)節(jié)混合液pH至7.5，用pH 7.5的0.2 mol/L硼酸鹽緩沖液定容至500 mL。

1.2.2 pH、緩沖體系和多酚濃度對(duì)LOX酶活力的影響

參照吳桂玲等[12]的方法并略作修改。緩沖體系對(duì)LOX酶活力的影響：在96孔紫外酶標(biāo)板中加入酶液20 μL、不同pH的緩沖液190 μL，放入酶標(biāo)儀中在25 ℃下振蕩1 min(1 096 次/min，1 mm)后加入底物30 μL；多酚濃度對(duì)LOX酶活力的影響：在96孔紫外酶標(biāo)板中加入酶液20 μL、濃度分別為0.00，0.05，0.10，0.25，0.50，1.00 mmol/L 的多酚溶液5 μL，pH 7.5的硼酸鹽緩沖液185 μL，放入酶標(biāo)儀中在25 ℃下振蕩1 min(1 096 次/min，1 mm)后加入底物30 μL。加樣完成后立即在25 ℃下振板10 s(1 096 次/min，1 mm)，并測量在234 nm處的吸光度，每10 s掃描一次，10 min共掃描60次。以溶劑做空白，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。制作吸光度隨時(shí)間變化的曲線，在前5 min內(nèi)線性較好的區(qū)域中以234 nm處的吸光度值每分鐘增加0.001個(gè)單位定義為一個(gè)酶活單位。按式(1)計(jì)算酶活力。

(1)

式中：

X——酶活力，U；

A1——線性范圍內(nèi)第1次測得的吸光度；

An——線性范圍內(nèi)第n次測得的吸光度；

n——掃描檢測吸光度的次數(shù)。

1.2.3 緩沖體系和反應(yīng)時(shí)長對(duì)多酚自氧化的影響 參照賈紅玉等[27]的方法并略作修改。在25 ℃條件下，于96孔紫外酶標(biāo)板中添加5 μL多酚溶液與235 μL緩沖液，混合均勻后分別在0，60，120 min掃描280～500 nm處光譜(步長為2 nm)，以5 μL的DMSO與235 μL緩沖液混合作為空白對(duì)照。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 所有試驗(yàn)均平行3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。采用Origin 8.0軟件分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 緩沖條件對(duì)LOX酶活的影響

LOX存在多種同工酶，不同來源的LOX最適pH不同[1, 10]。植物來源的LOX所耐受的pH值一般在3～10，最適pH一般為6.0～9.0[28]，同工酶LOX-1的最適pH為9.0。通過測定不同緩沖體系、不同pH條件下LOX活性發(fā)現(xiàn)：在硼酸鹽緩沖體系中[圖1(a)]，酶活出現(xiàn)雙峰結(jié)構(gòu)(pH=7.5，pH≥9.0)，pH為9.0時(shí)酶活達(dá)38 U，在其他pH條件下酶活則在20～30，中性條件下酶活優(yōu)于其他兩組，與劉國夫等[11]的研究一致；在磷酸鹽體系中[圖1(b)]，酶活隨pH值升高而顯著上升(P<0.05)，而酸性條件下酶活低于10 U；在Tris-HCl緩沖體系中[圖1(c)]，堿性條件下酶活力均大于40 U，中性條件下酶活顯著低于堿性條件(P<0.05)。綜上可知，pH和緩沖體系對(duì)酶活具有一定影響。

酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)上同時(shí)具有氨基和羧基，環(huán)境pH的變化可以使其結(jié)構(gòu)變性而活性降低，導(dǎo)致其對(duì)環(huán)境pH極為敏感，且不同的離子也會(huì)對(duì)酶活造成一定影響[29]，因此在不同環(huán)境條件下LOX酶可顯示出不同的酶活力。堿性條件下，試驗(yàn)所用的LOX在Tris-HCl體系中酶活最高；中性條件下，則在硼酸鹽體系中酶活最高。

2.2 緩沖條件對(duì)多酚自氧化的影響

2.2.1 對(duì)QCT自氧化的影響 在硼酸鹽緩沖體系中(圖2)，QCT在中性條件下反應(yīng)120 min內(nèi)紫外光譜圖沒有較大變化，在堿性條件下于320 nm有明顯吸收峰。緩沖體系的pH越高、反應(yīng)時(shí)間越長，320 nm處峰越高，而382～400 nm及440～500 nm的峰下降，且382～400 nm 峰出現(xiàn)紅移。俞梅蘭等[30]研究認(rèn)為，382～400 nm 及440～500 nm為QCT自身的特征吸收峰，320 nm 處為其自氧化產(chǎn)物的特征吸收峰。因此，在堿性條件下QCT會(huì)發(fā)生自氧化反應(yīng)，隨著自氧化產(chǎn)物不斷積累，320 nm處吸收峰升高；而隨反應(yīng)時(shí)間延長，QCT不斷消耗導(dǎo)致自身特征吸收峰降低，與Zhou等[31]的研究結(jié)果相符。在堿性條件下，QCT的B環(huán)上的鄰二酚羥基對(duì)自氧化反應(yīng)敏感，可氧化形成具有半醌結(jié)構(gòu)的中間產(chǎn)物，并進(jìn)一步氧化成終產(chǎn)物槲皮素醌[30]。

QCT在磷酸鹽體系中(圖3)反應(yīng)0 min時(shí)，在370～385 nm處的峰隨著pH降低峰高不變但峰位藍(lán)移。堿性條件下，QCT在326 nm處出峰且堿性越強(qiáng)峰越高，反應(yīng)一段時(shí)間后峰下降，但QCT在pH為8.0的條件下320 nm 的峰明顯增長，表示在該條件下出現(xiàn)自氧化產(chǎn)物。因此，pH能顯著影響QCT穩(wěn)定性，進(jìn)而影響QCT的功能特性。榮家閔等[32]研究發(fā)現(xiàn)，pH為5～6時(shí)QCT對(duì)自由基的清除能力約為60%；隨著pH增加，其對(duì)自由基的清除能力急劇下降，在pH 9.0時(shí)清除率僅為10%。

QCT在中性和堿性Tris-HCl緩沖體系中(圖4)，反應(yīng)時(shí)間越長，360～410 nm處的峰下降越多；反應(yīng)60 min相較于反應(yīng)0 min在320 nm處峰值升高，且隨著pH越大而峰值升高越明顯；而反應(yīng)120 min后相較于反應(yīng)60 min，pH 9.0，8.5的曲線在320 nm的峰有所下降，pH 8.0，7.5的曲線在320 nm的峰上升，并在476 nm處出現(xiàn)新的吸收峰。推測該緩沖體系下320 nm處為QCT自氧化中間產(chǎn)物的特征吸收峰，476 nm處為QCT自氧化終產(chǎn)物的特征吸收峰。因此，QCT在堿性Tris-HCl緩沖體系中可發(fā)生自氧化，堿性弱的情況下自氧化中間產(chǎn)物堆積速率大于被消解的速率，表現(xiàn)為QCT自身特征吸收峰下降而中間產(chǎn)物特征吸收峰上升；當(dāng)堿性越強(qiáng)自氧化反應(yīng)越快，中間產(chǎn)物濃度大到一定程度之后促進(jìn)第二步氧化的發(fā)生，導(dǎo)致中間產(chǎn)物堆積速率小于被消解的速率，終產(chǎn)物累積同時(shí)中間產(chǎn)物含量下降，表現(xiàn)為QCT自身特征吸收峰及中間產(chǎn)物特征吸收峰下降，終產(chǎn)物特征吸收峰上升。

不同pH條件下的字母不同表示差異顯著(P<0.05)

綜上可知，QCT在堿性條件下發(fā)生自氧化，且堿性越強(qiáng)自氧化程度越高。在堿性條件下，QCT在磷酸鹽緩沖體系中的穩(wěn)定性最強(qiáng)，硼酸鹽緩沖體系次之，Tris-HCl緩沖體系最差。硼酸鹽可能與QCT的B環(huán)的酚羥基形成絡(luò)合物，因此硼酸鹽對(duì)QCT自氧化具有一定抑制作用[33]。

2.2.2 對(duì)GA自氧化的影響 在硼酸鹽緩沖體系中(圖5)，GA反應(yīng)0 min時(shí)各pH條件下紫外吸收曲線相似；反應(yīng)60 min后，pH 8.0～9.0條件下在340～360 nm出現(xiàn)吸收峰，且pH越高峰越高。在pH 9.0和pH 8.5條件，450 nm處亦有出峰。由此推測，340～360，450 nm處分別為GA自氧化中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物的特征吸收峰。在堿性較強(qiáng)的硼酸鹽緩沖體系中，在60 min內(nèi)有GA自氧化終產(chǎn)物積累，且中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物的累積隨反應(yīng)時(shí)間延長和pH升高而增多。在pH 7.5，7.0條件下，340～360 nm處也出現(xiàn)一個(gè)小峰，即在各堿性硼酸鹽緩沖體系中反應(yīng)120 min均發(fā)生自氧化。GA結(jié)構(gòu)中3個(gè)相鄰的芳香族羥基易氧化，GA可以被氧化成醌或羥基相關(guān)的衍生物[34]。吳雪釵等[35]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH值為7.0～10.0時(shí)，GA在50 ℃以上的條件下3 h內(nèi)可完全降解，可見GA在堿性和中性條件下不穩(wěn)定，與試驗(yàn)結(jié)論相符。

圖2 QCT在硼酸鹽緩沖體系中反應(yīng)不同時(shí)間自氧化產(chǎn)物的吸收光譜

圖3 QCT在磷酸鹽緩沖體系中反應(yīng)不同時(shí)間自氧化產(chǎn)物的吸收光譜

圖4 QCT在Tris-HCl緩沖體系中反應(yīng)不同時(shí)間自氧化產(chǎn)物的吸收光譜

在磷酸鹽緩沖體系中(圖6)，GA在堿性條件下反應(yīng)時(shí)間越長，340～360 nm處吸收峰越明顯，且在中性條件下反應(yīng)120 min時(shí)也發(fā)現(xiàn)吸收峰，而酸性條件下120 min 內(nèi)該處無吸收峰，說明GA在酸性條件下穩(wěn)定。堿性條件下反應(yīng)120 min在446 nm處有明顯吸收峰。由此可知，GA在堿性條件下60 min內(nèi)、中性條件下120 min內(nèi)，均可發(fā)生自氧化并出現(xiàn)自氧化中間產(chǎn)物堆積，而自氧化產(chǎn)生終產(chǎn)物的反應(yīng)需要較長的時(shí)間或需要有較多中間產(chǎn)物累積才能發(fā)生。

由圖7可知，GA在Tris-HCl緩沖體系中自氧化中間產(chǎn)物特征吸收峰為340 nm，終產(chǎn)物特征吸收峰在446 nm。在堿性條件下，GA反應(yīng)60 min就已在340，446 nm 處出現(xiàn)吸收峰，且隨pH升高、反應(yīng)時(shí)間延長峰值升高。由此可知，GA自氧化反應(yīng)對(duì)反應(yīng)時(shí)間和pH條件敏感，pH越高、反應(yīng)時(shí)間越長產(chǎn)生的中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物越多。中性條件下GA在反應(yīng)60 min內(nèi)尚未發(fā)生自氧化，而反應(yīng)120 min時(shí)已出現(xiàn)自氧化中間產(chǎn)物。

綜上可知，GA僅在堿性條件和中性條件(較長反應(yīng)時(shí)間下)發(fā)生自氧化反應(yīng)。在硼酸鹽緩沖體系中，60 min僅有輕微自氧化跡象，120 min時(shí)才明顯出現(xiàn)中間產(chǎn)物，且中性和弱堿性條件下自氧化不明顯；在堿性磷酸鹽緩沖體系中反應(yīng)60 min僅產(chǎn)生中間產(chǎn)物；在Tris-HCl緩沖體系中，反應(yīng)60 min就已出現(xiàn)中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物。相比之下，GA在硼酸鹽緩沖體系中的穩(wěn)定性最強(qiáng)，磷酸鹽緩沖體系次之，Tris-HCl緩沖體系最差。

2.2.3 對(duì)C自氧化的影響 圖8顯示，除pH 7.0及pH 7.5，C在硼酸鹽緩沖體系中反應(yīng)60 min時(shí)在328 nm處產(chǎn)生吸收峰，且峰高隨反應(yīng)時(shí)間和pH的增加而增加；反應(yīng)120 min后，除中性條件外均出現(xiàn)吸收峰且較60 min時(shí)有明顯升高。反應(yīng)60 min與120 min均在452 nm處產(chǎn)生非常小的吸收峰但差異不明顯。因此，在硼酸鹽緩沖體系中，C在堿性條件下容易自氧化產(chǎn)生中間產(chǎn)物，但終產(chǎn)物的生成較為緩慢。

圖5 GA在硼酸鹽緩沖體系中反應(yīng)不同時(shí)間自氧化產(chǎn)物的吸收光譜

圖6 GA在磷酸鹽緩沖體系中反應(yīng)不同時(shí)間自氧化產(chǎn)物的吸收光譜

如圖9所示，C在堿性磷酸鹽緩沖體系中反應(yīng)60 min 在430 nm處出峰，反應(yīng)時(shí)間越長峰越高，堿性條件下反應(yīng)60 min和120 min后，在320 nm處吸收峰均不高，說明在堿性磷酸鹽緩沖體系中反應(yīng)60 min后，C已經(jīng)發(fā)生了自氧化，且產(chǎn)生的中間產(chǎn)物被快速反應(yīng)掉形成了終產(chǎn)物。而在酸性磷酸鹽體系中，C未發(fā)生自氧化(120 min內(nèi))。C在酸性條件下具有較強(qiáng)抗氧化性，在偏堿性或C濃度較高的條件下容易發(fā)生自氧化[36]，且堿性越強(qiáng)自氧化速率越快[37]。

在Tris-HCl緩沖體系中(圖10)，C在反應(yīng)60 min后在320，430 nm處出現(xiàn)吸收峰，說明已經(jīng)發(fā)生自氧化并生成終產(chǎn)物；反應(yīng)120 min后，在320，430 nm的吸收峰明顯增高，說明反應(yīng)仍在不斷進(jìn)行。C由3個(gè)烴環(huán)組成，其中B環(huán)上的鄰二羥基具有強(qiáng)大的氫供應(yīng)能力，易在堿性條件下釋放氫，先反應(yīng)為半醌自由基中間態(tài)然后轉(zhuǎn)變?yōu)猷忰Y(jié)構(gòu)，C鄰醌還能與C發(fā)生聚合反應(yīng)[38]。

綜上可知，C在酸性和中性條件下不發(fā)生自氧化。在堿性硼酸鹽緩沖體系中僅出現(xiàn)中間產(chǎn)物；在磷酸鹽緩沖體系中反應(yīng)120 min出現(xiàn)終產(chǎn)物，中間產(chǎn)物不明顯；而在Tris-HCl緩沖體系中反應(yīng)60 min已有明顯自氧化現(xiàn)象。因此，C在硼酸鹽和磷酸鹽緩沖體系中穩(wěn)定性優(yōu)于Tris-HCl體系。

圖7 GA在Tris-HCl緩沖體系中反應(yīng)不同時(shí)間自氧化產(chǎn)物的吸收光譜

圖8 C在硼酸鹽緩沖體系中反應(yīng)不同時(shí)間自氧化產(chǎn)物的吸收光譜

圖9 C在磷酸鹽緩沖體系中反應(yīng)不同時(shí)間自氧化產(chǎn)物的吸收光譜

2.2.4 對(duì)DOPAC自氧化的影響 由圖11可知，DOPAC在硼酸鹽緩沖體系(pH 7.0～9.0)中具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，可保持120 min內(nèi)不發(fā)生自氧化。

在磷酸鹽緩沖體系中(圖12)，DOPAC在pH 8.0(60 min)與pH 7.5 (120 min)條件下于345 nm處出現(xiàn)吸收峰，推測此處為自氧化中間產(chǎn)物的特征吸收峰。其中pH 7.5條件下吸收峰非常小，說明該條件下DOPAC發(fā)生氧化的程度較小。

DOPAC在Tris-HCl體系(圖13)反應(yīng)60 min時(shí)，堿性條件下在346 nm處有吸收峰，且隨pH增大峰增高；隨著時(shí)間的延長，吸收峰持續(xù)升高，說明自氧化中間產(chǎn)物持續(xù)生成，但均未見自氧化終產(chǎn)物產(chǎn)生。

綜上可知，DOPAC在酸性和中性條件下均不發(fā)生自氧化，且在硼酸鹽緩沖體系中，120 min內(nèi)堿性條件下也未出現(xiàn)自氧化；在磷酸鹽緩沖體系中，在pH 8.0條件下反應(yīng)60 min已有自氧化跡象，在pH 7.5反應(yīng)120 min時(shí)出現(xiàn)了自氧化中間產(chǎn)物；在Tris-HCl緩沖體系中60 min出現(xiàn)中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物，且反應(yīng)時(shí)間越長，兩種產(chǎn)物量均增加，說明在該體系中自氧化易發(fā)生。因此，DOPAC在硼酸鹽緩沖體系中穩(wěn)定性優(yōu)于磷酸鹽和Tris-HCl體系。

圖10 C在Tris-HCl緩沖體系中反應(yīng)不同時(shí)間自氧化產(chǎn)物的吸收光譜

圖11 DOPAC在硼酸鹽緩沖體系中反應(yīng)不同時(shí)間自氧化產(chǎn)物的吸收光譜

圖12 DOPAC在磷酸鹽緩沖體系中反應(yīng)不同時(shí)間自氧化產(chǎn)物的吸收光譜

綜合以上可知，4種多酚在Tris-HCl緩沖體系中自氧化程度均較其他兩種緩沖體系更明顯，因此在探究利用紫外分光光度法檢測多酚對(duì)LOX酶活性的影響試驗(yàn)中，Tris-HCl緩沖體系不適用，而硼酸鹽體系稍優(yōu)于磷酸鹽體系。為保證多酚的抗氧化性，應(yīng)選用弱堿體系、中性或酸性體系，而為保證LOX酶的活性則應(yīng)選擇堿性條件，因此，選取pH 7.5的弱堿體系進(jìn)行后續(xù)研究。

2.3 多酚濃度對(duì)LOX酶活的影響

圖14顯示了不同濃度的4種多酚在pH 7.5的硼酸鹽緩沖體系中對(duì)LOX酶活性的影響。濃度為0.00～1.00 mmol/L 時(shí)，QCT、GA、C的LOX酶活出現(xiàn)先降后增的現(xiàn)象，其中QCT與GA在0.25 mmol/L、C在0.1 mmol/L 時(shí)抑制效果最好，且抑制效果為QCT>C>GA。說明多酚在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)LOX酶活具有抑制作用，與Cao等[39]的研究結(jié)果一致。但多酚濃度過高該抑制作用又會(huì)減弱，可能是由于多酚在高濃度條件下自氧化速率增加[30]。在0～1 mmol/L范圍內(nèi)DOPAC對(duì)LOX酶活性的抑制效果逐步增大，在濃度為1 mmol/L時(shí)其酶活抑制效果優(yōu)于0.10 mmol/L的C，但次于0.10 mmol/L 的QCT。具有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的酚類可通過該結(jié)構(gòu)鰲合介導(dǎo)脂質(zhì)發(fā)生過氧化的Cu2+、Fe2+從而發(fā)揮抗氧化作用，多酚自身則被氧化成為具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的苯醌類產(chǎn)物[40]。Fe2+為LOX的活性中心，被多酚螯合后LOX活性減弱。整體而言，QCT對(duì)LOX酶活的抑制效果最強(qiáng)，C次之，再次為GA，DOPAC為最差。

圖13 DOPAC在Tris-HCl緩沖體系中反應(yīng)不同時(shí)間自氧化產(chǎn)物的吸收光譜

不同濃度下的字母不同表示差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，pH和緩沖體系對(duì)脂氧合酶活性及4種多酚(槲皮素、沒食子酸、兒茶素、3,4-二羥基苯乙酸)自身結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性均有影響。4種多酚在不同緩沖體系的弱堿、中性或酸性條件下自氧化程度小，且pH越小自氧化程度越小，自身結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性越強(qiáng)，能夠更好地發(fā)揮自身功能特性。綜合來看，4種多酚在硼酸鹽體系中發(fā)生的自氧化程度最小，而Tris-HCl體系中自氧化程度最大。試驗(yàn)選用的脂氧合酶在堿性條件下活性較強(qiáng)，因此檢測多酚對(duì)脂氧合酶酶活影響時(shí)選擇弱堿性(pH 7.5)的硼酸鹽緩沖體系。因此，在研究多酚對(duì)脂氧合酶活性影響的研究中，應(yīng)對(duì)所選用脂氧合酶適用pH范圍進(jìn)行檢測，若其最適pH處于酸性范圍內(nèi)則可以選擇其最適pH作為緩沖pH條件，無需考慮多酚自氧化特性。

在pH 7.5的硼酸鹽緩沖液條件下，利用紫外分光光度法檢測多酚濃度對(duì)脂氧合酶酶活的影響發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，多酚濃度越大對(duì)脂氧合酶酶活的抑制作用越強(qiáng)，但濃度過高時(shí)則可能因多酚自氧化速率加快，導(dǎo)致對(duì)脂氧合酶酶活的抑制作用減弱。整體而言，槲皮素對(duì)脂氧合酶酶活的抑制效果最強(qiáng)，兒茶素次之，再次為沒食子酸，3,4-二羥基苯乙酸為最差。

研究主要對(duì)植物多酚的自氧化情況和植物多酚抑制脂氧合酶的效果進(jìn)行研究探討，后續(xù)研究可以從分子結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)層面對(duì)不同結(jié)構(gòu)的多酚對(duì)脂氧合酶抑制效果差異的機(jī)理原因進(jìn)行深入研究，也可探究多酚應(yīng)用于復(fù)雜體系(例如植物油、動(dòng)物肉等)中時(shí)對(duì)脂氧合酶的抑制效果。