唐超莉 胡洪波 趙苑池 謝一嫏 周 翠 覃文辦 黃 鵬

(廣西崇左市人民醫(yī)院腫瘤科，崇左市 530021，電子郵箱:863272700@qq.com)

乳腺癌是女性最常見的上皮性惡性腫瘤，全世界每年約有140萬乳腺癌新發(fā)病例和45萬乳腺癌死亡病例[1]。鑒于乳腺癌的惡性生物學(xué)行為特征，最終多會出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。乳腺癌轉(zhuǎn)移具有器官選擇性，約75%的乳腺癌轉(zhuǎn)移患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移[2]。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移常引起頑固性骨痛、高鈣血癥、病理性骨折、肢體功能障礙等一系列骨相關(guān)事件，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，甚至導(dǎo)致死亡。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移分子機(jī)制至今尚未完全明確，目前常用的治療手段主要為姑息性治療，包括局部治療及系統(tǒng)性治療，但均不能延長患者的生存期，而預(yù)防性治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移會引起不必要的副作用，并且成本高。因此，深入研究乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)顯得尤為重要。趨化因子(C-X-C基序)受體4[chemokine(C-X-C motif) receptor 4，CXCR4]介導(dǎo)的趨化和轉(zhuǎn)移反應(yīng)已在各種實(shí)體癌癥中得到證實(shí)，提示CXCR4是一種趨化因子受體，常在乳腺、結(jié)腸和前列腺等器官的實(shí)體腫瘤中過度表達(dá)[3]。本研究觀察乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者乳腺組織中CXCR4基因及蛋白的表達(dá)水平，為研究乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的早期診斷和靶向治療提供相關(guān)理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 組織來源 收集2017 年 5月至 2019 年2 月在我院診治的100例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者(乳腺癌無骨轉(zhuǎn)移組)與100例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌骨轉(zhuǎn)移患者(乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組)的乳腺組織，均為女性，年齡 21～75(44.65±8.76)歲?；颊咝g(shù)前均未接受放化療，其手術(shù)切除標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋、固定后行蘇木精-伊紅染色，經(jīng)2位病理醫(yī)生按世界衛(wèi)生組織《乳腺病理組織學(xué)分類》(2003 新版)標(biāo)準(zhǔn)[4]讀片，確認(rèn)其浸潤性導(dǎo)管癌的病理類型，余下組織-80℃保存。收集同期在我院體檢的100健康女性的乳腺組織(正常對照組)，年齡23～74(45.75±8.41)歲。3組研究對象的年齡、絕經(jīng)情況等一般資料比較，以及乳腺癌無骨轉(zhuǎn)移組與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組患者乳腺癌組織學(xué)分級的比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書。

表1 3組研究對象一般資料的比較(n)

1.2 免疫組化 對3組研究對象的石蠟包埋塊進(jìn)行相應(yīng)處理：(1)選好各組研究對象組織切片，60℃恒溫箱過夜。(2)脫蠟脫水：將切片依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 中各10 min；再依次放入無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇、60%乙醇中各5 min。(3)沖洗：自來水沖洗5 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，3 min/次。(4)抗原修復(fù)：向壓力鍋中倒入適量pH值=6.0的酸鹽性修復(fù)液，修復(fù)液必須浸沒整張組織切片，調(diào)大火加熱至水沸騰，將已脫蠟水化的切片插入耐高溫的染色架中，放進(jìn)已煮沸的修復(fù)液中，蓋緊鍋蓋，扣好壓力鍋繼續(xù)加熱，從噴氣開始計(jì)時(shí)5 min后，將壓力鍋撤離熱源，放置5 min后，用自來水沖洗使之冷卻。(5)沖洗：取出切片，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3 min；再用配制好的0.9%過氧化氫沖洗15 min；再用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3 min。(6)封閉：每張切片滴加1滴動(dòng)物血清，37℃溫箱下孵育15 min。(7)加一抗:甩去動(dòng)物血清，每張切片滴加1滴CXCR4一抗(Abbkine公司，批號：ATSFE2501)， 37℃溫箱下孵育60 min。(8)加二抗：磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3 min。每張切片各滴加1滴二抗(福建邁新公司，批號：1901180014A)，37℃溫箱下孵育30 min。(9)加過氧化物酶：磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3 min。然后每張切片加1滴鏈霉菌抗生物-過氧化物酶溶液，37℃溫箱下孵育15 min。(10)顯色：磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3 min。然后每張切片加二氨基聯(lián)苯胺顯色劑，靜置1～3 min。自來水沖洗數(shù)分鐘。(11)染色：放入蘇木素中染色3 min后用自來水沖洗數(shù)分鐘。再快速過入鹽酸酒精，自來水沖洗數(shù)分鐘。(12)晾干切片，滴加樹脂，蓋上載玻片，于顯微鏡下觀察。計(jì)數(shù)4個(gè)不同高倍視野下的200個(gè)癌細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞染色情況計(jì)算陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。無陽性細(xì)胞數(shù)記為陰性(-)，陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)<25%記為弱陽性(+)，陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)25%～49%記為中等陽性(++)，陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)≥50%為強(qiáng)陽性(+++)。由兩名病理學(xué)醫(yī)師獨(dú)立評估，當(dāng)意見不一致時(shí)，由第三位病理學(xué)醫(yī)師介入，最終的決定是基于三分之二的病理學(xué)醫(yī)師同意評估。

1.3 PCR方法 采用逆轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測三組患者的CXCR4 mRNA表達(dá)情況。 分別取3組研究對象的乳腺組織約100 mg，加入1 mL的TRIzol溶液(Invitrogen公司)進(jìn)行勻漿，根據(jù)RNA說明書提取總RNA。取3 μg總RNA，根據(jù)M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(MBI Fermentas公司)說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；在美國MJR公司生產(chǎn)的定量PCR檢測儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。CXCR4上游引物：5′-ACTACACCGAGGAAATGGGCT-3′,下游引物：5′-CCCACAATGCCAGTTAAGAAGA -3′，預(yù)計(jì)產(chǎn)物長度為133 bp;β-肌動(dòng)蛋白基因上游引物：5′-GGTGACGAGGCCCAGAGCAAGAG-3′，下游引物：5′-CCCGGCCAGCCAGGTCCAG-3′， 預(yù)計(jì)產(chǎn)物長度為388 bp，以上引物均由上海生工生物有限公司設(shè)計(jì)。反應(yīng)體系為20 μL:cDNA為1 μL，CXCR4上下游引物各0.5 μL，RealMaster Mix(SYBR Green) (北京天根生物科技有限公司)為9 μL，ddH2O 9 μL。反應(yīng)條件為：94℃ 5 min，然后94℃ 30 s，62.2℃ 30 s，70℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。每份cDNA樣本均在相同反應(yīng)條件下進(jìn)行。由定量PCR儀采集熒光信號，電腦自動(dòng)分析熒光信號并將其轉(zhuǎn)換為CT值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出拷貝數(shù)。通過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行質(zhì)量控制,用內(nèi)參基因β-肌動(dòng)蛋白對mRNA含量的變異進(jìn)行較正。CXCR4精確含量=CXCR4 拷貝數(shù)/內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白拷貝數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組研究對象乳腺組織CXCR4陽性表達(dá)情況的比較 3組研究對象乳腺組織CXCR4陽性表達(dá)情況的比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者乳腺組織CXCR4的陽性表達(dá)最強(qiáng)，見表2及圖1～4。

2.2 乳腺癌陽性表達(dá)情況患者乳腺癌組織CXCR4的陽性表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系 乳腺癌組織CXCR4的陽性表達(dá)情況與糖類抗原153(carbohydrate antigen 153，CA153)、雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)、人類表皮生長因子2(human epidermal growth factor 2，HER-2)、腫瘤原發(fā)灶大小無關(guān)(均P>0.05)，而與細(xì)胞核增殖相關(guān)抗原(Ki-67)、腫瘤分期相關(guān)(均P<0.05)，見表3。

表2 3組研究對象乳腺組織CXCR4陽性表達(dá)情況的比較[n(%)]

表3 乳腺癌腫瘤組織CXCR4表達(dá)情況與患者臨床病理特征的關(guān)系(n)

2.3 3組研究對象乳腺組織CXCR4 mRNA相對表達(dá)量的比較 正常對照組、乳腺癌無骨轉(zhuǎn)移組、乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組患者乳腺組織的CXCR4 mRNA相對表達(dá)量分別為(0.63±0.21)、(1.15±0.24)、(2.44±0.27)，3組乳腺組織的CXCR4 mRNA相對表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1 492.153，P<0.001)，其中乳腺組織的CXCR4 mRNA相對表達(dá)量由高到低為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組>乳腺癌無骨轉(zhuǎn)移組>正常對照組(均P<0.05)。

3 討 論

乳腺癌是一種異質(zhì)性疾病，可表現(xiàn)出多種組織病理學(xué)和分子特征。CXCR4屬于特異性G蛋白-偶聯(lián)受體，是趨化因子基質(zhì)細(xì)胞衍生物-1的特異性受體，與配體具有較高的親和力。趨化因子(C-X-C基序)配體12[chemokine(C-X-C motif)ligand 12，CXCL12]是CXCR4的唯一配體，在多種癌癥中具有自分泌/旁分泌生長因子的作用。與CXCR4結(jié)合的CXCL12可啟動(dòng)各種信號通路，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄、介導(dǎo)細(xì)胞趨化、細(xì)胞存活和增殖的增加，而且與腫瘤細(xì)胞向區(qū)域和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力有關(guān)[5]。CXCR4在20多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并且與預(yù)后不良和侵襲性表型相關(guān)。在肝癌中，CXCR4表達(dá)與腫瘤大小、遠(yuǎn)處播散和患者預(yù)后不良有關(guān)[6]。在胃癌中，長鏈非編碼RNA HOTAIR表達(dá)增加，通過miRNA-126/CXCR4軸和下游信號通路促進(jìn)胃癌的增殖和轉(zhuǎn)移[7]。研究表明，CXCR4表達(dá)與腎細(xì)胞癌患者的腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤進(jìn)展和預(yù)后有關(guān),且CXCR4的表達(dá)與腎細(xì)胞癌患者病理分級、轉(zhuǎn)移狀態(tài)和總生存期顯著相關(guān)[8]。CXCR4蛋白在胰腺癌組織中呈高表達(dá)，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[9]。大多數(shù)乳腺癌患者CXCR4表達(dá)呈陽性,乳腺癌組織CXCR4表達(dá)強(qiáng)度與腋窩淋巴結(jié)受累呈指數(shù)關(guān)系，原發(fā)腫瘤大小、HER2(+)亞型、淋巴血管浸潤也與CXCR4陽性表達(dá)呈指數(shù)關(guān)系[10-11]。 Yang等[12]的研究表明，CXCR4或CXCR7基因的單次敲除可顯著降低三陰型乳腺癌細(xì)胞的增殖、生長、遷移和侵襲，延緩G1/S周期的轉(zhuǎn)化，而共敲除對這些生物學(xué)能力的抑制作用更顯著。Shanmugam等[13]的研究表明，過表達(dá)的CXCR4與乳腺癌患者癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移增加有關(guān)，也是預(yù)后不良的指標(biāo)之一。Liao等[14]的研究表明，CXCR4可促進(jìn)破骨細(xì)胞形成，在非小細(xì)胞癌骨轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。還有研究表明，CXCR4的高表達(dá)與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)，CXCR4陽性患者(13.1%)骨轉(zhuǎn)移發(fā)生率明顯高于CXCR4陰性患者(2.4%)[15-16]。

本研究結(jié)果顯示，3組研究對象乳腺組織CXCR4陽性表達(dá)情況比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者乳腺組織CXCR4的陽性表達(dá)情況最強(qiáng)，而且乳腺組織的CXCR4 mRNA的相對表達(dá)量由高到低為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組>乳腺癌無骨轉(zhuǎn)移組>正常對照組(均P<0.05)，與Cabioglu等[15]的研究結(jié)果一致，說明CXCR4基因可能成為一個(gè)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的基因治療靶點(diǎn)，其在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，可能與高表達(dá)CXCR4的腫瘤細(xì)胞遷移到富含CXCL12的骨髓環(huán)境相關(guān)。隨著腫瘤轉(zhuǎn)移的擴(kuò)散，CXCR4/CXCL12軸影響腫瘤進(jìn)展的其他方面，包括為骨髓中的腫瘤細(xì)胞提供一個(gè)保護(hù)性的生態(tài)位，并通過召集CXCR4陽性的促血管生成細(xì)胞支持缺氧驅(qū)動(dòng)的血管生成[17]。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織CXCR4的陽性表達(dá)情況與CA153、ER、PR、HER-2、腫瘤原發(fā)灶大小無關(guān)(均P>0.05)，而與Ki-67、腫瘤分期相關(guān)(均P<0.05)，與Pehlivan等[10]的研究結(jié)果有所不同，這可能與研究病例數(shù)不同有關(guān)。Ki-67是細(xì)胞增殖活躍的指標(biāo)，本研究結(jié)果顯示Ki-67陽性>14%的乳腺癌細(xì)胞中CXCR4表達(dá)陽性率更高，而且 CXCR4在惡性程度高、組織學(xué)分化差、腫瘤分期晚的乳腺癌組織中表達(dá)更高，說明CXR4可能成為評估乳腺癌預(yù)后的指標(biāo)。

綜上所述， CXCR4在乳腺癌組織中的表達(dá)升高，且在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者乳腺組織中的表達(dá)更高，其有可能成為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移治療的新靶點(diǎn)，為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移早期診斷及治療提供新的方向。