柳小莉，黃小英，張小飛, 3，王梁鳳，朱麗云，徐 杰，陳青垚，楊 明, *，王 芳*

基于GC-MS成分分析結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測當(dāng)歸揮發(fā)油質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）

柳小莉1，黃小英2，張小飛2, 3，王梁鳳2，朱麗云2，徐 杰2，陳青垚2，楊 明1, 2*，王 芳2*

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137 2. 江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004 3. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽 712000

預(yù)測當(dāng)歸揮發(fā)油質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker）。采用GC-MS檢測當(dāng)歸揮發(fā)油化學(xué)成分，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)、蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)、成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)、靶點(diǎn)-組織分布網(wǎng)絡(luò)預(yù)測當(dāng)歸揮發(fā)油Q-Marker，分子對接驗(yàn)證Q-Marker生物活性，查閱文獻(xiàn)佐證Q-Marker有效性。18批次當(dāng)歸揮發(fā)油GC-MS分析獲得了5個共有成分，以共有成分為Q-Marker候選成分做網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，預(yù)測藁本內(nèi)酯與丁烯基酞內(nèi)酯為當(dāng)歸揮發(fā)油Q-Marker，Q-Marker作用于核心靶點(diǎn)PIK3R1、CHRM1、CHRM2、SRC、CREBBP，通過重要通路肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)，分布于大腦皮層、膽囊、平滑肌、前列腺、膀胱、扁桃體、基底神經(jīng)節(jié)及海馬中發(fā)揮藥理作用；分子對接中藁本內(nèi)酯、丁烯基酞內(nèi)酯與核心靶點(diǎn)有較好的結(jié)合能力，體現(xiàn)當(dāng)歸揮發(fā)油Q-Marker較好的生物活性，文獻(xiàn)佐證了Q-Marker有效性。預(yù)測的Q-Marker為當(dāng)歸揮發(fā)油質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立及當(dāng)歸揮發(fā)油質(zhì)量評價奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

當(dāng)歸揮發(fā)油；質(zhì)量標(biāo)志物；GC-MS；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對接；丁烯基酞內(nèi)酯；藁本內(nèi)酯

當(dāng)歸為傘形科當(dāng)歸屬植物當(dāng)歸(Oliv.) Diels的干燥根，秋末采挖，性甘、辛、溫，歸肝、心、脾經(jīng)，有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便的功效[1]。中藥材天地網(wǎng)大數(shù)據(jù)中心平臺分析，甘肅省、云南省及青海省為當(dāng)歸主產(chǎn)地。當(dāng)歸化學(xué)成分由揮發(fā)油和非揮發(fā)油組成，其中當(dāng)歸揮發(fā)油為次生代謝物，常以水蒸氣蒸餾法提取[2]，具有易揮發(fā)及促皮膚滲透的特點(diǎn)[3]，在心血管系統(tǒng)、腦及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸道系統(tǒng)、鎮(zhèn)痛抗炎等[4-9]方面有較好的藥理作用，以吸嗅或皮膚給藥途徑應(yīng)用于芳香療法中。當(dāng)歸揮發(fā)油與其主要活性成分藁本內(nèi)酯在心腦血管系統(tǒng)[10]有較強(qiáng)的藥理作用；根據(jù)《中國心血管健康與疾病報(bào)告2019》，中國心血管疾病死亡率居于首位[11]；鑒于揮發(fā)油芳香走串，可快速發(fā)揮療效的特點(diǎn)會使當(dāng)歸揮發(fā)油在心血管疾病應(yīng)用中有潛在優(yōu)勢。

當(dāng)歸揮發(fā)油質(zhì)量是保障藥效及安全應(yīng)用的基礎(chǔ)?，F(xiàn)階段當(dāng)歸揮發(fā)油缺乏質(zhì)量相關(guān)研究，本研究預(yù)測當(dāng)歸揮發(fā)油質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q- Marker），以期為當(dāng)歸揮發(fā)油質(zhì)量評價奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。當(dāng)歸揮發(fā)油提取后，GC-MS分析揮發(fā)油化學(xué)成分，以找出共有成分；數(shù)據(jù)庫中查找共有成分作用靶點(diǎn)，構(gòu)建和分析成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)、蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)、靶點(diǎn)-組織網(wǎng)絡(luò)、成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，并對基因本體（gene ontology，GO）與京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，逐次獲得與多靶點(diǎn)-多通路-多組織關(guān)系中最密切的成分為當(dāng)歸揮發(fā)油Q-Marker[12]；最后，通過分子對接技術(shù)，將核心靶點(diǎn)匹配的最佳化合物作為對照組，將對照組和Q-Marker分別與核心靶點(diǎn)的結(jié)合能力進(jìn)行比較，驗(yàn)證Q-Marker的生物活性；查閱文獻(xiàn)，佐證Q-Marker的有效性。

1 材料

1.1 儀器

7890A/5975C型GC-MS儀器，美國安捷倫公司；SXKW型數(shù)顯控溫電熱套，北京市永光明儀器股份有限公司；TB-214型電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；800Y高速多功能粉碎機(jī)，永康市鉑歐五金制品有限公司。

1.2 試藥

無水乙醇（批號19060102）、無水硫酸鈉（批號1804081）均購自西隴科學(xué)股份有限公司；當(dāng)歸藥材購自成都慧鋤科技有限公司，分別為云南省6批次（S1曲靖富源、S2大理洱源、S3迪慶香格里拉、S4迪慶開屏、S5曲靖會澤、S6大理鶴慶），甘肅省6批次（S7渭源會川、S8岷縣西寨、S9隴南宕昌、S10岷縣岷陽、S11隴南成縣、S12渭源彭峰），青海省6批次（S13西寧大通、S14海東互助、S15西寧湟中、S16西寧湟源、S17海東民和、S18海東樂都），共18批次藥材，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)葛菲教授鑒定為傘形科植物當(dāng)歸(Oliv.) Diels.的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 當(dāng)歸揮發(fā)油提取

課題組前期對提取工藝優(yōu)化后當(dāng)歸揮發(fā)油提取率達(dá)到0.7%，實(shí)驗(yàn)按照優(yōu)化工藝提取揮發(fā)油：當(dāng)歸藥材（S1～S18）粉碎為粗粉；分別稱取300 g當(dāng)歸粗粉，裝入5 L圓底燒瓶中，加入3000 mL水，浸泡2 h后開始提取，提取時間9 h[13]；收集索氏提取器中當(dāng)歸揮發(fā)油，加入適量無水硫酸鈉，靜置12 h；移取當(dāng)歸揮發(fā)油，依次按產(chǎn)地對應(yīng)標(biāo)記為S1～S18，裝入棕色玻璃瓶中，陰涼柜4 ℃保存。

2.2 當(dāng)歸揮發(fā)油GC-MS分析

2.2.1 制樣方法 移取當(dāng)歸揮發(fā)油10 μL，無水乙醇定容至10 mL量瓶中，搖勻后加適量無水硫酸鈉，0.22 μm有機(jī)濾膜濾過，取續(xù)濾液于進(jìn)樣瓶中，即得當(dāng)歸揮發(fā)油樣品溶液。

2.2.2 檢測條件[13]安捷倫HP-5 MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）色譜柱；進(jìn)樣口溫度250 ℃；進(jìn)樣量1 μL，分流比40∶1；體積流量1 mL/min；程序升溫：80 ℃保持0 min，3 ℃/min升溫至167 ℃，保持2.5 min，2 ℃/min升溫至202 ℃，保持0 min，4 ℃/min升溫至260 ℃，保持2 min；質(zhì)譜采用EI離子源，離子源溫度230 ℃，電離能量70 eV，掃描范圍為全掃描，四級桿溫度150 ℃，溶劑延遲時間3 min。

2.2.3 方法學(xué)考察

（1）精密度試驗(yàn)：取當(dāng)歸揮發(fā)油樣品（S10），按“2.2.1”項(xiàng)下制樣方法制備供試品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下檢測條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄藁本內(nèi)酯峰面積。藁本內(nèi)酯峰面積RSD為0.05%，表明儀器精密度良好。

（2）重復(fù)性試驗(yàn)：取當(dāng)歸揮發(fā)油樣品（S10），按“2.2.1”項(xiàng)下制樣方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測，記錄藁本內(nèi)酯峰面積。藁本內(nèi)酯峰面積RSD為0.07%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

（3）穩(wěn)定性試驗(yàn)：取當(dāng)歸揮發(fā)油樣品（S10），按“2.2.1”項(xiàng)下制樣方法制備供試品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下條件分別于0、4、8、12、24、48 h進(jìn)行檢測，記錄藁本內(nèi)酯峰面積。藁本內(nèi)酯峰面積RSD為0.09%，結(jié)果表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 化學(xué)成分分析 當(dāng)歸揮發(fā)油樣品S1～S18按照“2.2.1”項(xiàng)下制樣方法制備樣品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下檢測條件獲得18批次當(dāng)歸揮發(fā)油總離子流圖（圖1）。

根據(jù)安捷倫7890A/5975C氣相色譜質(zhì)譜儀中數(shù)據(jù)庫NIST14.L檢索，分析各批次當(dāng)歸揮發(fā)油化學(xué)成分信息，得到當(dāng)歸揮發(fā)油5個共有成分（圖2），共有成分信息見表1。共有成分相對含量總和達(dá)95%，表明這5個成分在當(dāng)歸揮發(fā)油中有代表性，將共有成分作為Q-Marker的候選成分。

圖1 當(dāng)歸揮發(fā)油GC-MS總離子流圖

1-反式β-羅勒烯 2-對乙烯基愈瘡木酚 3-β-甜沒藥烯 4-丁烯基酞內(nèi)酯 5-藁本內(nèi)酯

表1 共有成分信息

2.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.3.1 候選化合物靶點(diǎn)預(yù)測 共有成分作為Q-Marker候選化合物，通過檢索數(shù)據(jù)庫TCMSP[14]及SwissTargetPrediction[15]，查找候選化合物作用靶點(diǎn)；靶點(diǎn)合并，除去重復(fù)值，UniProt數(shù)據(jù)庫[16]規(guī)范靶點(diǎn)基因名，得到與5個化合物相關(guān)的112個靶點(diǎn)。將化合物與靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1軟件中構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3（V形節(jié)點(diǎn)代表化合物，圓形節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)大小代表度值大?。?；其中化合物丁烯基酞內(nèi)酯（3-butylidene-1(3)- isobenzofuranone）、藁本內(nèi)酯（-ligustilide）與對乙烯基愈瘡木酚（2-methoxy-4-vinylphenol）的度值別為68、59、41，這3個成分對應(yīng)的靶點(diǎn)更多，影響更大。

圖3 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3.2 蛋白與蛋白互作（protein-protein interaction network，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析 將112個靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING[17]數(shù)據(jù)庫中，限定物種為“人”，設(shè)置蛋白交互參數(shù)評分值大于0.9，去掉網(wǎng)絡(luò)中單一節(jié)點(diǎn)，其他參數(shù)不變，結(jié)果保存成tsv格式，保留文件中節(jié)點(diǎn)和結(jié)合率評分信息，導(dǎo)入Cytoscape3.2.1構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖4（節(jié)點(diǎn)大小代表度值大?。贿x取網(wǎng)絡(luò)中度值（degree）大于中位數(shù)且大于9的靶點(diǎn)作為關(guān)鍵靶點(diǎn)，獲得7個關(guān)鍵靶點(diǎn)，分別為磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase regulatory subunit alpha，PIK3R1，degree 16）、趨化因子受體5型CCR5（C-C chemokine receptor type 5，degree 13）、激活肽片段2（Activation peptide fragment 2，F(xiàn)2，degree 11）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶（proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src，SRC，degree 11）、毒蕈堿乙酰膽堿受體M1（muscarinic acetylcholine receptor M1，CHRM1，degree 10）、CHRM2（degree 10）、CREB結(jié)合蛋白（CREB-binding protein，CREBBP，degree 10）。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.3.3 GO與KEGG富集分析 運(yùn)用R語言（clusterProfiler）對7個關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，包括生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細(xì)胞組成（cellular component，CC）及KEGG通路富集分析。GO分析結(jié)果共獲得435個條目，其中BP 353，MF 53，CC 29，以＜0.05及偽發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05對GO條目進(jìn)行篩選，結(jié)果見表2；生物過程為脂質(zhì)激酶活性的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)向細(xì)胞核定位的正調(diào)控、細(xì)胞蛋白質(zhì)定位的正調(diào)控等；分子功能為胰島素受體結(jié)合、乙酰膽堿受體活性、磷脂酰肌醇磷脂酶C活性等；細(xì)胞組成為膽堿能突觸。

KEGG分析獲得42條通路，對＜0.05的通路進(jìn)行篩選，結(jié)果見表3；前8條通路為肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、病毒致癌作用、cAMP信號通路等，說明篩選出的7個關(guān)鍵靶點(diǎn)可能通過這些通路達(dá)到干預(yù)或治療疾病的目的。

表2 GO功能富集結(jié)果

表3 KEGG信號通路結(jié)果

2.3.4 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將3個重要成分、7個關(guān)鍵靶點(diǎn)、8條通路，在Cytoscape 3.2.1軟件中構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，見圖5（藍(lán)色V形節(jié)點(diǎn)代表化學(xué)成分、綠色圓形節(jié)點(diǎn)代表關(guān)鍵靶點(diǎn)、藍(lán)綠色方形節(jié)點(diǎn)代表通路，節(jié)點(diǎn)大小代表度值大?。?/p>

以成分、靶點(diǎn)、通路的連接度（degree）為參考值，得出藁本內(nèi)酯（degree 6）和丁烯基酞內(nèi)酯（degree 5）有較高的連接度，因此將藁本內(nèi)酯與丁烯基酞內(nèi)酯作為當(dāng)歸揮發(fā)油的Q-Marker。7個關(guān)鍵靶點(diǎn)中PIK3R1（degree 9）、CHRM1（degree 7）、CHRM2（degree 7）、SRC（degree 6）、CREBBP（degree 5）連接度較高，表明這5個靶點(diǎn)的作用尤為重要，為核心靶點(diǎn)；8條通路中肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)（regulation of actin cytoskeleton）的度值為5為最大值，是最為重要的通路。

圖5 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

2.3.5 核心靶點(diǎn)組織分布 由The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫[18]查找5個核心靶點(diǎn)PIK3R1、CHRM1、CHRM2、SRC、CREBBP的組織分布數(shù)據(jù)，下載tsv格式文件，共獲得305條組織（tisssue）數(shù)據(jù)，對數(shù)據(jù)中表達(dá)量大于10的組織進(jìn)行分析，篩選出147條數(shù)據(jù)；應(yīng)用Cytoscape 3.2.1軟件構(gòu)建靶點(diǎn)-組織網(wǎng)絡(luò)圖，見圖6（綠色圓形節(jié)點(diǎn)代表核心靶點(diǎn)、棕色菱形節(jié)點(diǎn)代表人體組織或器官，節(jié)點(diǎn)大小代表度值大小）。靶點(diǎn)-組織網(wǎng)絡(luò)中，CREBBP與53個組織相連接，PIK3R1與50個組織相連接，SRC與32個組織相連接，CHRM1與7個組織相連接，CHRM2與5個組織相連接；選取度值最大的組織，分別為大腦皮層（cerebral cortex）、膽囊（gallbladder）、平滑?。╯mooth muscle）、前列腺（prostate）、膀胱（urinary bladder）、扁桃體（amygdala）、基底神經(jīng)節(jié)（basal ganglia）、海馬（hippocampal formation），結(jié)合The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫中表達(dá)量值，計(jì)算核心靶點(diǎn)在各組織的表達(dá)量，見表4。

圖6 靶點(diǎn)-組織網(wǎng)絡(luò)圖

靶點(diǎn)PIK3R1、CHRM1、CHRM2、SRC、CREBBP在大腦皮層、膽囊、平滑肌、前列腺、膀胱、扁桃體、基底神經(jīng)節(jié)及海馬這8個組織中，表達(dá)量平均值都在15以上，其中大腦皮層的表達(dá)量最高，平均值為29.95。

2.4 分子對接分析

2.4.1 受體與配體結(jié)構(gòu)獲取 Q-Marker藁本內(nèi)酯與丁烯基酞內(nèi)酯為配體，在PubChem數(shù)據(jù)庫[19]下載3D結(jié)構(gòu)sdf格式文件；核心靶點(diǎn)PIK3R1、CHRM1、CHRM2、SRC、CREBBP為受體，在RSCB PDB數(shù)據(jù)庫[20]中物種選擇“人”，選擇分辨率高的3D結(jié)構(gòu)，下載pdb格式文件；將RSCB PDB數(shù)據(jù)庫各靶點(diǎn)對應(yīng)的配體（unique ligand）作為對照化合物[21]，結(jié)果見表5，下載對照化合物3D結(jié)構(gòu)sdf格式文件。Openbabel 3.1.1軟件轉(zhuǎn)換化合物格式。

表4 核心靶點(diǎn)組織分布與表達(dá)量

2.4.2 分子對接與可視化 AutoDockTools1.5.6軟件對受體和配體進(jìn)行去水、加氫、加電荷處理，并獲得最佳活性位點(diǎn)，在AutoDock-vina1.1.2中輸入命令符進(jìn)行分子對接計(jì)算，得到配體與受體的結(jié)合能，結(jié)果見表6。結(jié)合能越小對接效果越好，配體越容易與受體結(jié)合。Pymol2.4.0軟件進(jìn)行分子對接可視化處理；Q-Marker與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合位置見圖7（圖中依次呈現(xiàn)出球狀、條狀與結(jié)合點(diǎn)位置）。藁本內(nèi)酯與丁烯基酞內(nèi)酯化學(xué)結(jié)構(gòu)相似、相對分子質(zhì)量相近，兩者經(jīng)配體處理后，獲得的最優(yōu)結(jié)構(gòu)與蛋白結(jié)合能力一致，因此，可視化中僅展示藁本內(nèi)酯（-ligustilide）的分子對接圖。

表5 靶點(diǎn)-對照化合物信息

表6 AutoDock vina計(jì)算結(jié)果

圖7 藁本內(nèi)酯與靶點(diǎn)分子對接圖

Q-Marker藁本內(nèi)酯、丁烯基酞內(nèi)酯與PIK3R1、CHRM1結(jié)合能分別為26.371、25.115 kJ/mol（?6.3、?6.0 kcal/mol），比對照化合物丙三醇的值更??；相對于丙三醇，Q-Marker與PIK3R1、CHRM1的結(jié)合能力更好。藁本內(nèi)酯、丁烯基酞內(nèi)酯及甲基東莨菪堿在靶點(diǎn)CHRM2上結(jié)合能都為25.115 kJ/mol（?6.0 kcal/mol），這3個化合物與CHRM2的結(jié)合能力一致。藁本內(nèi)酯、丁烯基酞內(nèi)酯與SRC、CREBBP的結(jié)合能分別為20.092、21.348 kJ/mol（?4.8、?5.1 kcal/mol），比對照化合物磷酸核糖與2O4的結(jié)合能大，Q-Marker與SRC、CREBBP的結(jié)合能力弱于磷酸核糖與2O4。一般而言，結(jié)合能affinity值小于16.743 kJ/mol（?4.0 kcal/mol）時，表明配體有較強(qiáng)的生物活性[22]。與對照組比較以及affinity值分析，Q-Marker藁本內(nèi)酯、丁烯基酞內(nèi)酯在核心靶點(diǎn)上都有較好的結(jié)合能力，表明預(yù)測的當(dāng)歸揮發(fā)油Q-Marker有較好的生物活性。

2.4.3 Q-Marker有效性佐證 預(yù)測的Q-Marker良好的生物活性通過分子對接技術(shù)得以驗(yàn)證，有效性通過文獻(xiàn)佐證。從文獻(xiàn)中歸納后當(dāng)歸揮發(fā)油Q- Marker藥效組織、作用及應(yīng)用見表7。文獻(xiàn)中，藁本內(nèi)酯與丁烯基酞內(nèi)酯在大腦、平滑肌、前列腺、膀胱、海馬、結(jié)直腸發(fā)揮作用，與預(yù)測的組織分布（大腦皮層、膽囊、平滑肌、前列腺、膀胱、扁桃體、基底神經(jīng)節(jié)及海馬）基本一致，應(yīng)用于心腦血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸道系統(tǒng)，發(fā)揮著不同程度的藥效作用。

核心靶點(diǎn)PIK3R1為磷脂酰肌醇3-激酶，對胰島素的代謝有重要作用，它與癌癥、免疫缺陷與發(fā)育障礙有關(guān)[37]。CHRM1與CHRM2為毒蕈堿乙酰膽堿受體，是與精神障礙有關(guān)的基因；CHRM1有乙酰膽堿受體興奮作用，能影響睡眠的快速眼球運(yùn)動期[38]，與遲發(fā)性運(yùn)動障礙相關(guān)；CHRM2有乙酰膽堿受體抑制作用，與多種神經(jīng)精神疾?。òㄗd妄、癡呆、抑郁、精神分裂癥）有關(guān)[39]。SRC為原癌基因酪氨酸蛋白激酶，被鑒定為癌基因[40]。CREBBP為CREB結(jié)合蛋白，是對造血非常重要的腫瘤抑制基因，可以維持身體正常的造血功能[41]。核心靶點(diǎn)相應(yīng)的作用，與當(dāng)歸Q-Marker免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)、抑制相關(guān)酶活性、抗腫瘤作用等相關(guān)。

表7 Q-Marker文獻(xiàn)信息

Q-Marker最重要的通路肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)（regulation of actin cytoskeleton），對多功能的、普遍存在的細(xì)胞骨架蛋白有調(diào)節(jié)作用，用于神經(jīng)元的建立和維持[42]。此外，肌動蛋白細(xì)胞骨架可以改變突觸和神經(jīng)元形態(tài)中神經(jīng)遞質(zhì)受體的水平，能夠在杏仁核中介導(dǎo)學(xué)習(xí)和記憶的形成[43]。肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)作用與Q-Marker神經(jīng)保護(hù)作用相關(guān)。

3 討論

當(dāng)歸藥材采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，GC-MS方法分析18批次當(dāng)歸揮發(fā)油化學(xué)成分，獲得5個共有成分，分別為反式β-羅勒烯、對乙烯基愈瘡木酚、β-甜沒藥烯、丁烯基酞內(nèi)酯、藁本內(nèi)酯。以共有成分作為Q-Marker獲選成分，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測藁本內(nèi)酯和丁烯基酞內(nèi)酯為當(dāng)歸揮發(fā)油Q-Marker。Q-Marker藁本內(nèi)酯，別名東當(dāng)歸酞內(nèi)酯，對心腦血管系統(tǒng)有較強(qiáng)的藥理作用[44]；丁烯基酞內(nèi)酯為3-亞丁基-1(3)-異苯并呋喃酮的別名，有解痙、平喘、抗驚厥、鎮(zhèn)痛等作用[45]。

核心靶點(diǎn)PIK3R1、CHRM1、CHRM2、SRC、CREBBP與當(dāng)歸Q-Marker免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)、抑制相關(guān)酶活性、抗腫瘤作用等相關(guān)。最主要的通路肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)與Q-Marker神經(jīng)保護(hù)作用相關(guān)?；虮倔w富集分析中生物過程主要涉及脂質(zhì)激酶活性的調(diào)節(jié)，蛋白質(zhì)向細(xì)胞核定位的正調(diào)控等；分子功能涉及胰島素受體結(jié)合，乙酰膽堿受體活性等；細(xì)胞組成主要為膽堿能突觸。核心靶點(diǎn)主要分布于大腦皮層、膽囊、平滑肌、前列腺、膀胱、扁桃體、基底神經(jīng)節(jié)及海馬中，并有較高的表達(dá)量，其中大腦皮層尤為顯著；文獻(xiàn)報(bào)道揮發(fā)油多作用于大腦皮層與海馬中[46-50]。分子對接驗(yàn)證了Q-Marker與核心靶點(diǎn)有較好的結(jié)合能力，理論上證實(shí)了Q-Marker較好的生物活性。通過文獻(xiàn)佐證，Q-Marker在大腦、平滑肌、前列腺、膀胱、海馬、結(jié)直腸發(fā)揮作用，與核心靶點(diǎn)組織分布基本一致；核心靶點(diǎn)、通路、Q-Marker存在緊密的相關(guān)性。

當(dāng)前中藥揮發(fā)油缺乏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)量問題嚴(yán)峻，存在安全隱患；Q-Marker為中藥揮發(fā)油的質(zhì)量評價、質(zhì)量控制等研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。本文預(yù)測當(dāng)歸揮發(fā)油Q-Marker為藁本內(nèi)酯與丁烯基酞內(nèi)酯，同時闡明了Q-Marker的作用機(jī)制，并從理論上驗(yàn)證了Q-Marker的生物活性，為當(dāng)歸揮發(fā)油質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立及當(dāng)歸揮發(fā)油質(zhì)量奠定評價指標(biāo)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Q-Marker prediction of volatile oil ofbased on GC-MS analysis combined with network pharmacology

LIU Xiao-li1, HUANG Xiao-ying2, ZHANG Xiao-fei2, 3, WANG Liang-feng2, ZHU Li-yun2, XU Jie2, CHEN Qing-yao2, YANG Ming1, 2, WANG Fang2

1. College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. Key Laboratory of Modern Preparation of TCM, Ministry of Education, Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, China 3. College of Pharmacy, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712000, China

To predict the quality marker (Q-Marker) of the volatile oil of Danggui (, ASR).GC-MS was applied to detect chemical components of volatile oil of ASR. Network pharmacology was used to construct component-target network, protein-protein interaction network, component-target-pathway network and target-tissue network, so as to predict the Q-Marker. Molecular docking was used to verify the biological activity and literature was consulted to confirm the effectiveness of Q-Marker.Five common components were obtained from 18 batches of volatile oil of ASRin GC-MS analysis. Further network pharmacology analysis of the common components showed that-ligustilide and 3-butylidene-1(3)- isobenzofuranone were predicted as Q-Marker. Q-Marker played pharmacological effect through acting on core targets PIK3R1, CHRM1, CHRM2, SRC, CREBBP, which were distributed in cerebral cortex, gallbladder, smooth muscle, prostate, urinary bladder, amygdala, basal ganglia, and hippocampal formation through one important pathway of regulation of actin cytoskeleton. The Q-Marker of volatile oil of ASR had a good binding ability with the core target, reflecting the good biological activity, which was confirmed by the literature.The predicted Q-Marker can provide the material foundation for the establishment of quality standard and the quality evaluation of volatile oil of ASR.

volatile oil of; Q-Marker; GC-MS; network pharmacology; molecular docking; 3-butylidene- 1(3)-isobenzofuranone;-ligustilide

R283.6

A

0253 - 2670(2021)09 - 2696 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.09.020

2021-03-03

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81703720）；江西省重大科技研發(fā)專項(xiàng)（20194ABC28009）

柳小莉（1988—），女，博士研究生，研究方向?yàn)橹兴幹苿┬鹿に嚒⑿录夹g(shù)研究。

楊 明，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥制劑新工藝、新技術(shù)研究。Tel: (0791)87119032 E-mail: mingyang26@126.com

王 芳，女，博士，副教授，主要從事中藥制劑學(xué)研究。Tel: (0791)87118645 E-mail: cat689apple@ 163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]