溫 捷，薛 蓉，季 德，蘇聯(lián)麟，王巧晗，嚴(yán)國(guó)俊，陸兔林，毛春芹

指紋圖譜結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的瓜蔞飲片質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測(cè)分析

溫 捷，薛 蓉，季 德，蘇聯(lián)麟，王巧晗，嚴(yán)國(guó)俊，陸兔林*，毛春芹*

南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023

基于中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）的理論依據(jù)，結(jié)合指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)瓜蔞飲片Q-Marker進(jìn)行初步預(yù)測(cè)分析。建立瓜蔞飲片的指紋圖譜，對(duì)15批瓜蔞飲片進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，同時(shí)進(jìn)行主成分分析（PCA）及偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）；通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選瓜蔞飲片相關(guān)成分的靶點(diǎn)和通路，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，預(yù)測(cè)瓜蔞飲片的Q-Marker。建立了15批瓜蔞飲片的的指紋圖譜，相似度均大于0.900，經(jīng)PCA和PLS-DA顯示同一產(chǎn)地的瓜蔞飲片各自聚為一類，指認(rèn)的16、9、12號(hào)峰在區(qū)分不同產(chǎn)地瓜蔞飲片中起重要作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析表明，3,29-二苯甲?；鲜V仁三醇等成分是瓜蔞飲片發(fā)揮活性作用的有效成分，結(jié)合Q-Marker理念，進(jìn)一步明確3,29-二苯甲?；鲜V仁三醇可作為瓜蔞飲片潛在的Q-Marker。通過(guò)指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析預(yù)測(cè)了瓜蔞飲片的Q-Marker，為全面控制和評(píng)價(jià)瓜蔞飲片質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)，為瓜蔞飲片的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供理論參考。

瓜蔞飲片；質(zhì)量標(biāo)志物；指紋圖譜；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；3,29-二苯甲?；鲜V仁三醇

瓜蔞為葫蘆科植物栝樓Maxim.或雙邊栝樓Harms的干燥成熟果實(shí)。秋季果實(shí)成熟時(shí)，連果梗剪下，置通風(fēng)處陰干。瓜蔞作為一味常用中藥在我國(guó)大部分均有種植，主要分布在山東、安徽、山西、河北等地。瓜蔞性味甘、微苦，寒，歸肺、胃、大腸經(jīng)；具有清熱滌痰、寬胸散結(jié)、潤(rùn)燥滑腸的作用，主要用于肺熱晐嗽、痰濁黃稠、胸痹心痛、結(jié)胸痞滿、乳癰、肺癰、腸癰、大便秘結(jié)[1]?，F(xiàn)代研究表明，瓜蔞主要含三萜類、油脂、黃酮類、有機(jī)酸、氨基酸、甾醇類等生物活性成分，具有抗菌、抗腫瘤、抗炎、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、增加冠狀血流量、抑制血小板聚集、降低膽固醇等藥理活性[2-3]，是臨床配伍的常用中藥。

目前，瓜蔞的質(zhì)量控制多以外觀性狀和薄層鑒別為指標(biāo)，但僅靠性狀和薄層鑒別不能真正控制中藥的質(zhì)量，反映其所體現(xiàn)的整體療效。指紋圖譜在尚不清楚中藥整體化學(xué)成分的情況下，能從整體上全面、準(zhǔn)確地描述中藥材及其制劑的內(nèi)在質(zhì)量，可以提高中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的技術(shù)水平和科技含量[4-5]。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)及多途徑協(xié)同作用的特點(diǎn)，是中藥現(xiàn)代化研究難點(diǎn)和關(guān)鍵，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的出現(xiàn)為中藥走向現(xiàn)代化提供了新的前景。同時(shí)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整體性、系統(tǒng)性的特點(diǎn)與中醫(yī)藥整體觀和辨證論治的思想精髓不謀而合[6-7]。2016年，劉昌孝院士[8]提出了“中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）”，即在中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下，整合相關(guān)植物學(xué)科理論和現(xiàn)代化學(xué)生物學(xué)技術(shù)，最終實(shí)現(xiàn)建立全程質(zhì)量控制體系。本研究建立瓜蔞飲片HPLC指紋圖譜，運(yùn)用相似度評(píng)價(jià)分析、主成分分析（PCA）與偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）方法對(duì)收集的3個(gè)產(chǎn)地樣品進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)瓜蔞的Q-Marker，為全面控制和評(píng)價(jià)瓜蔞飲片質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)，為瓜蔞飲片的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供理論參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AD高效液相色譜儀，日本SHIMADZU公司；色譜柱Kromasil C18色譜柱（250 mm×4.6mm，5 μm）；MS-105D電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；KQ-500E數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；H1650-W型臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；FA1104N型電子天平，上海菁海儀器有限公司。

1.2 試藥

對(duì)照品3,29-二苯甲?；鲜V仁三醇（批號(hào) 111931-201804）、木犀草素（批號(hào)111520-201605）、蘆?。ㄅ?hào)YM0313SA14）、5-羥甲基糠醛（批號(hào)H1906143）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%。乙腈（色譜純，德國(guó)Merck公司），甲酸（色譜純，美國(guó)ACS恩科公司），水為娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純（山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司）。共收集來(lái)源于安徽省（S1～S5）、河北省（S6～S10）、山東?。⊿11～S15）3個(gè)產(chǎn)地15批瓜蔞飲片，由雷允上藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳建偉教授鑒定為葫蘆科植物雙邊栝樓Harms的干燥成熟果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 指紋圖譜色譜條件

島津LC-20AD HPLC Kromasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.05%甲酸（B），梯度洗脫：0～45 min，1%～10%A；45～75 min，10%～20%A；75～100 min，20%～35%A；100～123 min，35%～55%A；123～125 min，55%～64%A；125～155 min， 64%A；體積流量0.8 mL/min檢測(cè)波長(zhǎng)277 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取各對(duì)照品適量，加純甲醇配制成含5-羥甲基糠29.1 μg/mL、蘆丁25.5 μg/mL、木犀草素38.6 μg/mL、3,29-二苯甲酰基瓜蔞仁三醇35.7 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品粉末（過(guò)3號(hào)篩）約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失去質(zhì)量，搖勻，離心，取上清液，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取瓜蔞飲片樣品（S7）2.0 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄其指紋圖譜，以5-羥甲基糠醛作為參比峰，計(jì)算共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果顯示各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜2.47%，相對(duì)峰面積RSD＜2.69%，表明該儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取瓜蔞飲片樣品（S7）2.0 g各6份，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄其色譜圖，以5-羥甲基糠醛作為參比峰，計(jì)算共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)保留面積，結(jié)果顯示各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜1.15%，相對(duì)峰面積的RSD＜3.00%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別在0、6、12、24、48 h按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄其色譜圖，以5-羥甲基糠醛作為參比峰，計(jì)算共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果顯示共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜1.46%，相對(duì)峰面積的RSD＜3.00%，表明樣品在該條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 瓜蔞指紋圖譜的建立及共有峰的標(biāo)定

2.5.1 瓜蔞指紋圖譜的建立 取15批瓜蔞飲片，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣測(cè)定，并記錄色譜圖。將15批瓜蔞飲片的HPLC圖譜以AIA格式依次導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)研制的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012A）軟件。以S1號(hào)樣品的指紋圖譜作為參照譜，采用平均數(shù)法，時(shí)間窗為0.3，確定了18個(gè)共有峰，得到瓜蔞飲片指紋圖譜疊加圖，見圖1。

圖1 15批瓜蔞飲片指紋圖譜

2.5.2 指紋圖譜共有峰的標(biāo)定和相似度評(píng)價(jià) 通過(guò)對(duì)照品比對(duì)的方式，指認(rèn)了其中4個(gè)共有峰，分別為5-羥甲基糠醛（3號(hào)峰）、蘆?。?號(hào)峰）、木犀草素（12號(hào)峰）、3,29-二苯甲?；鲜V仁三醇（16號(hào)峰）。瓜蔞指紋圖譜共有模式圖及混合對(duì)照液的對(duì)照色譜圖見圖2。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012A）軟件對(duì)15批瓜蔞飲片樣品指紋圖譜的相似度進(jìn)行計(jì)算，瓜蔞飲片指紋圖譜相似度的范圍在0.910～0.997，分別是0.959、0.941、0.958、0.991、0.994、0.982、0.993、0.996、0.995、0.997、0.910、0.992、0.995、0.998、0.990，樣品相似度均大于0.900。

2.6 PCA

將15批瓜蔞飲片共有峰的相對(duì)峰面積作為變量，并導(dǎo)入SIMCA-P＋14.1軟件進(jìn)行分析處理。采用非監(jiān)督識(shí)別方法進(jìn)行PCA，觀察樣品間自然聚集，結(jié)果見圖3。PCA顯示不同產(chǎn)地的瓜蔞飲片沿PCI軸被明顯分為3部分，在主成分空間的分布上有特定區(qū)域，說(shuō)明不同產(chǎn)地的瓜蔞飲片化學(xué)成分存在著差異。

3-5-羥甲基糠醛 9-蘆丁 12-木犀草素 16-3, 29-二苯甲?；鲜V仁三醇

圖3 PCA得分圖

2.7 偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）

在PCA的基礎(chǔ)上，采用有監(jiān)督模式的PLS-DA進(jìn)一步分析不同產(chǎn)地瓜蔞飲片的差異性，樣本得分矩陣見圖4。模型解釋率參數(shù)2為0.959，預(yù)測(cè)能力參數(shù)2為0.922，均高于0.5，表明建立的數(shù)學(xué)模型穩(wěn)定且預(yù)測(cè)能力較強(qiáng)。由圖4可知，PLS-DA結(jié)果與PCA分析一致，3個(gè)產(chǎn)地各自聚為一類。安徽產(chǎn)地分布在第1、2象限，河北產(chǎn)地的分布在第4象限，山東產(chǎn)地的聚在第3、4象限，即3個(gè)產(chǎn)地的瓜蔞飲片明顯歸為3類，進(jìn)一步說(shuō)明不同產(chǎn)地的瓜蔞飲片在成分上存在著差異。

圖4 PLS-DA得分圖

為更好明確不同產(chǎn)地瓜蔞飲片差異的物質(zhì)，通過(guò)對(duì)PLS-DA模型中的變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）參數(shù)進(jìn)行分析，得到差異性標(biāo)記物的VIP得分圖，見圖5。篩選出貢獻(xiàn)較大的9個(gè)變量（VIP＞1），VIP值由大到小依次為16號(hào)峰（3,29-二苯甲?；鲜V仁三醇）、6號(hào)峰、11號(hào)峰、14號(hào)峰、9號(hào)峰（木犀草素）、7號(hào)峰、1號(hào)峰、8號(hào)峰、12號(hào)峰（蘆?。＿@些成分在區(qū)分不同產(chǎn)地瓜蔞飲片中起重要作用，是引起3個(gè)產(chǎn)地差異的主要標(biāo)志性成分。

2.8 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.8.1 數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php），PubChem Compound數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www. ncbi.nlm. nih.gov/pubmed/），Swiss Target Prediction服務(wù)器（http://new.swisstargetprediction.ch/），David 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/），京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www. genome.jp/kegg/），Cytoscape3.6.1軟件。

圖5 瓜蔞飲片的重要性變量圖

2.8.2 中藥靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，https://lsp.nwu.edu.cn/ tcmsp.php），對(duì)5-羥甲基糠醛、蘆丁、木犀草素、3,29-二苯甲酰基瓜蔞仁三醇進(jìn)行化合物檢索，獲取其靶點(diǎn)信息；通過(guò)PubChem Compound數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）進(jìn)行搜索，將得到的化合物SMILES結(jié)結(jié)構(gòu)輸入Swiss Target Prediction服務(wù)器（http://new.swisstargetprediction. ch/）進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，得到上述4個(gè)化合物的作用靶點(diǎn)，篩去重復(fù)靶點(diǎn)，最終得到與其有關(guān)的作用靶點(diǎn)共125個(gè)。

2.8.3 基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析 GO生物功能分析包括從生物功能上對(duì)基因產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化描述和注釋，通過(guò)GO富集分析可以獲得不同基因在哪些生物學(xué)功能上富集并發(fā)揮藥效作用。利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）對(duì)獲得的125個(gè)作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析。選取智人（Homo sapiens）物種的“Gene_Ontology”項(xiàng)，得到GO條目，包含106個(gè)生物過(guò)程（biological process，BP）條目，29個(gè)細(xì)胞組成（cellular component，CC）條目，以及30個(gè)分子功能（molecular function，MF）條目，分別占64.2%，17.6%，18.2%。設(shè)置-value值＜0.05，F(xiàn)DR＜0.05，選取組分排名前20的條目，得到圖6。

圖6 GO富集分析（前20條）

結(jié)果顯示以上靶點(diǎn)參與的生物過(guò)程包括一碳代謝過(guò)程、肽基絲氨酸磷酸化、端粒封端的正調(diào)控、蛋白激酶B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的正調(diào)控、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、肽基蘇氨酸磷酸化、血小板活化、端粒酶活性的正調(diào)控、柔紅霉素代謝過(guò)程、阿霉素代謝等過(guò)程，涉及紡錘體微管、中體、紡錘中區(qū)、胞質(zhì)溶膠等細(xì)胞，具有碳酸鹽脫水酶活性、三磷酸腺苷結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、鋅離子結(jié)合、類固醇結(jié)合、醛糖醇、NADP+1-氧化還原酶活性等分子功能。結(jié)果見表1。

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG_PATHWAY富集分析，富集到KEGG信號(hào)通路58條，通過(guò)設(shè)定-value＜0.01，其中排名前20的通路如圖7所示

表1 基因生物學(xué)過(guò)程

圖7 KEGG富集分析

2.8.4 KEGG通路富集分析 這些通路主要包括氮代謝、肺癌蛋白多糖、卵巢類固醇生成、孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、雌激素信號(hào)通路、腫瘤通路、血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附蛋白、非小細(xì)胞肺癌、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、酪氨酸激酶受體信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、前列腺癌、花生四烯酸代謝、膠質(zhì)瘤、叉形頭轉(zhuǎn)錄因子、膀胱癌、局灶性粘連、黑色素瘤、通路黑色素瘤、催乳素信號(hào)通路等。結(jié)果見表2。

2.8.5 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過(guò)將現(xiàn)有數(shù)據(jù)導(dǎo)入可視化網(wǎng)絡(luò)軟件，并且進(jìn)行多種運(yùn)算規(guī)則，在現(xiàn)有的相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行綜合篩選得到分析結(jié)果[9-10]。本研究將化合物成分、靶點(diǎn)、信號(hào)通路相互作用數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路圖”網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見圖8。根據(jù)Cytoscape3.7.1軟件對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析，以化合物、靶點(diǎn)蛋白、信號(hào)通路的連接度（Degree）為參考，發(fā)現(xiàn)3,29-二苯甲?；鲜V仁三醇、木犀草素、蘆丁的連接度相對(duì)較高，提示這些成分可能是瓜蔞飲片發(fā)揮藥效的活性物質(zhì)；靶點(diǎn)AKT1、PIK3R1、EGFR、IGF1R、PRKCA的連接度較高，可能是瓜蔞飲片發(fā)揮作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)；腫瘤通路（pathways in cancer）、肺癌蛋白多糖（proteoglycans in cancer）、神經(jīng)活性配體-受體相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction）、氮代謝（nitrogen metabolism）、黏著斑（focal adhesion）信號(hào)通路的連接度較大，均可能是瓜蔞飲片發(fā)揮作用的關(guān)鍵信號(hào)通路。文獻(xiàn)研究表明3,29-二苯甲?；鲜V仁三醇、木犀草素、蘆丁具有抗腫瘤、抗癌、抗炎及抗菌等作用[2,11-12]；AKT1、PIK3R1、EGFR、IGF1R、PRKCA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，體現(xiàn)在腫瘤基因的不穩(wěn)定性和腫瘤細(xì)胞的增殖、抗凋亡、分化、侵襲、藥物抵抗[13-17]等方面；腫瘤通路（pathways in cancer）、肺癌蛋白多糖（proteoglycans in cancer）、神經(jīng)活性配體-受體相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction）、氮代謝（nitrogen metabolism）、黏著斑（focal adhesion）信號(hào)通路是發(fā)揮治療癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心腦血管疾病關(guān)鍵的生物通路[18-22]。通過(guò)構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，說(shuō)明了瓜蔞不同成分對(duì)應(yīng)的不同靶點(diǎn)在不同的信號(hào)通路中發(fā)揮不同的作用，恰好符合中藥多成分、多靶點(diǎn)和多途徑協(xié)同作用的特點(diǎn)。

表2 核心靶點(diǎn)的Pathway富集分析

圖8 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

3 Q-Marker預(yù)測(cè)分析

本研究通過(guò)建立不同產(chǎn)地瓜蔞飲片的指紋圖譜，指認(rèn)其共有峰，對(duì)指認(rèn)出的成分進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，建立“成分-靶點(diǎn)-通路”的網(wǎng)絡(luò)圖。根據(jù)度值大小分析得到，木犀草素、蘆丁、3,29-二苯甲酰基瓜蔞仁三醇3個(gè)成分可能是瓜蔞發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)?；趧⒉⒃菏縖23-24]提出的中藥Q-Marker的“五原則”，對(duì)上述3個(gè)化合物進(jìn)行分析。3,29-二苯甲?；鲜V仁三醇是瓜蔞的特異性成分，而木犀草素和蘆丁在自然界廣泛存在[25]，不屬于瓜蔞的特異性成分。結(jié)合指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，3,29-二苯甲?；鲜V仁三醇作為瓜蔞的特有性三萜類物質(zhì)，可預(yù)測(cè)為瓜蔞的潛在Q-Marker[26]，后期可利用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)該化合物與核心靶點(diǎn)進(jìn)一步分析。

從生源途徑看，3,29-二苯甲?；鲜V仁三醇屬于三萜類化合物，是由焦磷酸金合歡脂（FPP）尾尾縮合生成的鯊烯通過(guò)不同的環(huán)化方式轉(zhuǎn)變而來(lái)，處于生源途徑的下游位置，具有較強(qiáng)的特異性[27]。木犀草素和蘆丁屬于黃酮類化合物，集中分布于被子植物中，其生物合成途徑是由莽草酸途徑和乙酸-丙二酸復(fù)合而成，在植物界分布較為廣泛，不符合質(zhì)量標(biāo)志物的“特有性”[23]。從傳統(tǒng)藥性來(lái)看，瓜蔞性寒，味甘、苦，歸肺、胃、大腸經(jīng)。文獻(xiàn)研究表明，三萜類化合物是寒性中藥發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[28]。從傳統(tǒng)功效來(lái)看，瓜蔞具有清熱滌痰、散結(jié)、潤(rùn)燥等作用，主要用于肺熱咳嗽、痰濁黃稠、結(jié)胸痞滿、乳癰、肺癰、腸癰等。結(jié)合現(xiàn)有研究，瓜蔞所含有的三萜類化合物具有抗腫瘤、抗菌、抗炎的功效[29]，這與瓜蔞的傳統(tǒng)功效不謀而合。從成分可測(cè)性來(lái)看，Zhao等[30]通過(guò)LC-MS/MS研究了3,29-二苯甲?；鲜V仁三醇在大鼠血漿中的藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程；馮果等[31]采用UPLC-MS/MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)3,29-二苯甲?；鲜V仁三醇在大鼠體內(nèi)不同臟器均有分布；劉金娜等[32]使用HPLC測(cè)定了瓜蔞中3,29-二苯甲酰基瓜蔞仁三醇的含量。因此，瓜蔞功效的物質(zhì)基礎(chǔ)與三萜類成分具有密切的相關(guān)性，很有可能是瓜蔞發(fā)揮主要藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，且能采用HPLC/UPLC等技術(shù)進(jìn)行定量定性分析，所以，3,29-二苯甲?；鲜V仁三醇可作為瓜蔞質(zhì)量標(biāo)志物的選擇。

4 討論

中藥質(zhì)量控制體系的不完善是影響中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)走向國(guó)際化的主要問(wèn)題之一，隨著國(guó)內(nèi)外科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，更多的檢測(cè)技術(shù)登上中醫(yī)藥的大舞臺(tái)，更加標(biāo)準(zhǔn)的、科學(xué)的、具有中醫(yī)藥理論指導(dǎo)的中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系也逐漸提上日程。秉著“傳承不泥古，創(chuàng)新不離宗，論證以求真”的精神，劉昌孝院士提出了中藥產(chǎn)品質(zhì)量控制的新概念——中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）。

瓜蔞作為一味臨床常用中藥，其清熱滌痰，寬胸散結(jié)等作用與瓜蔞的化學(xué)成分密不可分，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析表明指紋圖譜指認(rèn)的蘆丁、木犀草素和3, 29-二苯甲?；鲜V仁三醇通過(guò)控制腫瘤通路、肺癌蛋白多糖、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、氮代謝、黏著斑信號(hào)通路參與瓜蔞抗菌、抗腫瘤、抗炎、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、增加冠狀血流量、抑制血小板聚集、降低膽固醇等藥效活性，從而發(fā)揮治療癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心腦血管疾病的作用，與瓜蔞的現(xiàn)代研究一致[33-36]。瓜蔞性寒、微苦，歸肺經(jīng)，經(jīng)指紋圖譜指認(rèn)的蘆丁、木犀草素和3,29-二苯甲?；鲜V仁三醇分別是黃酮類與三萜類化合物，多味苦，常見于寒性中藥，通路中的肺癌蛋白多糖、非小細(xì)胞肺癌等信號(hào)通路等均與肺相關(guān)，體現(xiàn)了中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下四氣五味歸經(jīng)的統(tǒng)一。同時(shí)，通過(guò)對(duì)指紋圖譜指認(rèn)的多個(gè)成分進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，得到的瓜蔞不同成分對(duì)應(yīng)的不同靶點(diǎn)在不同的信號(hào)通路中發(fā)揮不同的作用，這恰好符合中藥多成分、多靶點(diǎn)和多途徑協(xié)同作用的特點(diǎn)，也體現(xiàn)了中醫(yī)藥理念的整體觀[24, 37]。

本研究以指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析為基礎(chǔ)，在劉昌孝院士Q-Marker理論的指導(dǎo)下，進(jìn)行瓜蔞質(zhì)量標(biāo)志物的預(yù)測(cè)分析。通過(guò)對(duì)15批瓜蔞飲片指紋圖譜進(jìn)行PCA和PLS-DA，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的瓜蔞飲片各自聚為一類，指認(rèn)的16號(hào)峰（3,29-二苯甲?；鲜V仁三醇）、12號(hào)峰（木犀草素）和9號(hào)峰（蘆?。┰趨^(qū)分不同產(chǎn)地瓜蔞飲片中起重要作用。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析篩選核心靶點(diǎn)和主要通路，得出木犀草素、蘆丁、3,29-二苯甲?；鲜V仁三醇3個(gè)成分可能是瓜蔞發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)?；谫|(zhì)量標(biāo)志物的核心，從生源途徑、傳統(tǒng)藥性、傳統(tǒng)功效以及成分可測(cè)性方面，進(jìn)一步明確3,29-二苯甲?；鲜V仁三醇可作為瓜蔞飲片潛在的Q-Marker。

中藥飲片是中藥配方顆粒、中藥湯劑、中成藥的物質(zhì)基礎(chǔ)，其質(zhì)量直接影響中藥產(chǎn)品的質(zhì)量與中醫(yī)臨床療[38]。瓜蔞飲片藥用價(jià)值高，被廣泛用于臨床。所以，建立全面的、有效的、科學(xué)的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法具有重大意義。本研究初步預(yù)測(cè)3,29-二苯甲?；鲜V仁三醇為瓜蔞的潛在Q-Marker，為后期深入研究瓜蔞飲片藥效機(jī)制提供參考，有助于建立和完善瓜蔞飲片的質(zhì)量控制體系，提高質(zhì)量控制水平。此外，通過(guò)對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)涉及的靶點(diǎn)和通路進(jìn)行分析，可為后續(xù)開展藥效研究、藥理機(jī)制研究提供新的思路，在中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下結(jié)合臨床，從整體推進(jìn)瓜蔞更深層次的研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國(guó)藥典 [S]. 一部. 2015: 173.

[2] 萬(wàn)麗娟, 盧金清, 許俊潔, 等. 瓜蔞子化學(xué)成分和藥理作用的研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)藥房, 2015, 26(31): 4440-4443.

[3] 劉明, 李慧, 李陳跟, 等. 瓜蔞化學(xué)成分及藥用價(jià)值的研究綜述 [J]. 阜陽(yáng)師范學(xué)院學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2018, 35(1): 23-26.

[4] 劉明, 李慧, 李陳跟, 等. 瓜蔞化學(xué)成分及藥用價(jià)值的研究綜述 [J]. 阜陽(yáng)師范學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2018, 35(1): 23-26.

[5] 黃萌萌, 王琪, 李曉琦, 等. 基于全-精細(xì)指紋圖譜與多元統(tǒng)計(jì)分析的梔子炒制前后差異評(píng)價(jià) [J]. 中草藥, 2020, 51(9): 2460-2466.

[6] 高寒, 徐偉, 張定航, 等. 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的刺五加總皂苷抗疲勞作用機(jī)制研究[J]. 中草藥, 2021, 52(2): 413-421.

[7] 王升啟. 中藥作用分子機(jī)制研究新策略 [J]. 中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志, 2019, 33(9): 647.

[8] 解靜, 高杉, 李琳, 等. 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥領(lǐng)域中的研究進(jìn)展與應(yīng)用策略 [J]. 中草藥, 2019, 50(10): 2257-2265.

[9] 劉昌孝. 從中藥資源-質(zhì)量-質(zhì)量標(biāo)志物認(rèn)識(shí)中藥產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展 [J]. 中草藥, 2016, 47(18): 3149-3154.

[10] 李泮霖, 蘇薇薇. 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥研究中的最新應(yīng)用進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2016, 47(16): 2938-2942.

[11] 鄭羅棋, 惠慧, 田港, 等. 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)吳茱萸致肝毒性機(jī)制研究 [J]. 中草藥, 2020, 51(2): 419-425.

[12] 徐建國(guó). 木犀草素對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷的作用及其機(jī)制研究 [D]. 南京: 南京大學(xué), 2016.

[13] 劉琳, 程偉. 槐花化學(xué)成分及現(xiàn)代藥理研究新進(jìn)展 [J]. 中醫(yī)藥信息, 2019, 36(4): 125-128.

[14] Hinz N, Jücker M. Distinct functions of AKT isoforms in breast cancer: A comprehensive review [J]., 2019, 17(1): 154.

[15] Yin K, Cui Y, Sun T,. Antagonistic effect of selenium on lead-induced neutrophil apoptosis in chickens via miR-16-5p targeting of PiK3R1 and IGF1R [J]., 2020, 246: 125794.

[16] Snell K I E, Ward D G, Gordon N S,. Exploring the roles of urinary HAI-1, EpCAM & EGFR in bladder cancer prognosis & risk stratification [J]., 2018, 9(38): 25244-25253.

[17] Kang J H, Toita R, Kim C W,. Protein kinase C (PKC) isozyme-specific substrates and their design [J]., 2012, 30(6): 1662-1672.

[18] 吳靜, 楊睿, 劉樹業(yè). 蛋白激酶C抑制劑的研究新進(jìn)展 [J]. 天津醫(yī)藥, 2016, 44(1): 114-117.

[19] Liu F, Chang L, Hu J L. Activating transcription factor 6 regulated cell growth, migration and inhibiteds cell apoptosis and autophagy via MAPK pathway in cervical cancer [J]., 2020, 139: 103120.

[20] 文恩, 黃思思, 彭杰, 等. 前列腺癌和非小細(xì)胞肺癌發(fā)生腦轉(zhuǎn)移差異的機(jī)制初步研究 [J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué), 2019, 27(12): 2065-2069.

[21] Espinoza-Sánchez N A, G?tte M. Role of cell surface proteoglycans in cancer immunotherapy [J]., 2020, 62: 48-67.

[22] 潘玲珍, 閆智勇, 左長(zhǎng)英, 等. 長(zhǎng)期使用地西泮對(duì)神經(jīng)活性配體受體相互作用信號(hào)通路的影響 [J]. 中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 42(5): 443-446.

[23] Kurmi K, Haigis M C. Nitrogen metabolism in cancer and immunity [J]., 2020, 30(5): 408-424.

[24] 劉昌孝. 基于中藥質(zhì)量標(biāo)志物的中藥質(zhì)量追溯系統(tǒng)建設(shè) [J]. 中草藥, 2017, 48(18): 3669-3676.

[25] 劉昌孝. 中藥質(zhì)量標(biāo)志物(Q-Marker)：提高中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及質(zhì)量控制理論和促進(jìn)中藥產(chǎn)業(yè)科學(xué)發(fā)展 [J]. 中草藥, 2019, 50(19): 4517-4518.

[26] Jeong D, Yi Y S, Sung G H,. Anti-inflammatory activities and mechanisms ofethanol extract [J]., 2014, 152(3): 487-496.

[27] 孫雨, 楊鈺涵, 王珺, 蔣海強(qiáng), 崔寧, 蘇本正, 于宗淵. 交泰丸的化學(xué)成分、藥理作用、臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展及質(zhì)量標(biāo)志物的預(yù)測(cè)分析[J/OL]. 中國(guó)中藥雜志:1-10[2020-05-26]. https://doi. org/10. 19540/j. cnki. cjcmm. 20200328. 201.

[28] 匡海學(xué). 中藥化學(xué)[M]. 北京: 中國(guó)中醫(yī)藥出版社, 2003.

[29] 陳慧, 孫慧, 楊秀艷, 等. 中藥寒熱平性質(zhì)與其化學(xué)成分類別相關(guān)性研究 [J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 18(7): 103-106.

[30] 劉金娜, 溫春秀, 劉銘, 等. 瓜蔞的化學(xué)成分和藥理活性研究進(jìn)展 [J]. 中藥材, 2013, 36(5): 843-848.

[31] Zhao C L, Zhang N, Chen B, et al. A rapid and sensitive LC-MS/MS method for quantification of 3, 29-dibenzoyl rarounitriol in rat plasma: Application to a pharmacokinetic study [J]., 2015, 29(8): 1229-1234.

[32] 馮果, 吳增光, 何新, 等. UPLC-MS/MS分析瓜蔞子中3, 29-二苯甲?；闃侨嗜荚诖笫篌w內(nèi)的組織分布情況 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2017, 23(21): 86-92.

[33] 劉金娜, 謝曉亮, 楊太新, 等. 果實(shí)熟度及加工方式對(duì)瓜蔞子中3, 29-二苯甲?；闃侨嗜嫉挠绊?[J]. 中藥材, 2014, 37(4): 581-583.

[34] Minh C V, Nhiem N X, Yen H T,. Chemical constituents ofand their cytotoxic activities [J]., 2015, 38(8): 1443-1448.

[35] Moon S S, Rahman A A, Kim J Y,. Hanultarin, a cytotoxic lignan as an inhibitor of actin cytoskeleton polymerization from the seeds of[J]., 2008, 16(15): 7264-7269.

[36] Lee E O, Lee J R, Kim K H,. The methylene chloride fraction ofinduces apoptosis in U937 cells through the mitochondrial pathway [J]., 2006, 29(1): 21-25.

[37] Ni L L, Zhu X W, Gong C Y,.fruits inhibit non-small cell lung cancer cell growth through mitotic cell-cycle arrest [J]., 2015, 43(2): 349-364.

[38] 陳春宇, 董漢玉, 紀(jì)瑞鋒, 等. 基于中醫(yī)藥理論的芳香類中藥防治新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)的作用探討 [J]. 中草藥, 2020, 51(11): 3051-3061.

[39] 董玲, 孫裕, 裴紋萱, 等. 基于全程質(zhì)量控制理念的中藥標(biāo)準(zhǔn)化體系研究思路探討 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2017, 42(23): 4481-4487.

Predictive analysis of quality markers ofdecoction pieces based on fingerprint and network pharmacology

WEN Jie, XUE Rong, JI De, SU Lian-lin, WANG Qiao-han, YAN Guo-jun, LU Tu-lin, MAO Chun-qin

College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

Based on the theoretical basis of quality marker (Q-Marker) of traditional Chinese medicine, combined with fingerprints and network pharmacology, the preliminary prediction analysis of the quality markers ofdecoction pieces was carried out.The similarity evaluation of 15 batches ofdecoction pieces was carried out using the similarity evaluation system software (2012A) of Chinese medicine chromatographic fingerprints; The principal component analysis and partial least squares discriminant analysis were performed at the same time. The targets and pathways of the relevant components ofdecoction pieces were screened by network pharmacology, and the “component-target-pathway” network diagram was constructed to predict the quality markers ofdecoction pieces.The fingerprints of 15 batches ofdecoction pieces were established, and their similarities were all greater than 0.900. Principal component analysis (PCA) and partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) showed that thedecoction pieces from the same place of origin were grouped together. The designated peak 16, peak 9 and peak 12 played an important role in distinguishing thedecoction pieces from different origins. Network pharmacological analysis showed that 3,29-dibenzoyl rarounitriol and other ingredients were the active ingredients ofdecoction pieces, combined with the core of the quality marker, it was further clarified 3,29-dibenzoyl rarounitriol can be used as a potential quality marker fordecoction pieces.The study predicts the quality markers ofdecoction pieces through fingerprint and network pharmacological analysis, provides a scientific basis for comprehensive control and evaluation of the quality ofdecoction pieces, and provides a theoretical reference for the further development and application ofdecoction pieces.

decoction pieces; quality marker (Q-Marker);fingerprint; network pharmacology; 3,29-dibenzoyl rarounitriol

R286

A

0253 - 2670(2021)09 - 2687 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.09.019

2020-11-09

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFC1707000）

溫 捷，女，在讀碩士，主要從事中藥炮制及中藥飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。Tel: 19805186486 E-mail: 1206264275@qq.com

陸兔林，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥炮制及中藥飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。Tel: (025)85811835 E-mail: lutuling2005@126.com

毛春芹，女，正高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事新藥研發(fā)及藥物制劑研究。E-mail: mcq63@163.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]