何 穎，夏星雅，魏嘉利，鄭 楓*

（1中國藥科大學(xué)藥物分析學(xué)教研室;2教育部藥品安全與預(yù)警重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210009）

遺傳毒性化合物由于其潛在的致突變性與致癌作用，引起了制藥行業(yè)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)的高度關(guān)注［1-2］。遺傳毒性由化合物與DNA或其他控制細(xì)胞凋亡的靶標(biāo)相互作用引起，包括了DNA加合物的誘導(dǎo)、鏈斷裂、點(diǎn)突變以及染色體的結(jié)構(gòu)和數(shù)值變化［3-5］。通常使用體內(nèi)嚙齒動(dòng)物致癌性試驗(yàn)準(zhǔn)確評(píng)估化合物的致癌性，對(duì)于沒有致癌性數(shù)據(jù)或支持性致癌數(shù)據(jù)的化合物，則采用基因毒性試驗(yàn)來預(yù)測致癌潛力［6-8］。自20世紀(jì)70年代以來，已經(jīng)開發(fā)了幾種基于細(xì)菌的生物測定法來評(píng)估化合物潛在的遺傳毒性以作為動(dòng)物試驗(yàn)的替代［9］。Ames試驗(yàn)是致突變性短期檢測最常用的方法之一，其原理基于監(jiān)測鼠沙門氏菌突變株中誘變劑引起的逆突變［8］。Ames試驗(yàn)具有易操作、成本低的優(yōu)點(diǎn)，但由于細(xì)菌檢測在藥物代謝、膜轉(zhuǎn)運(yùn)和DNA修復(fù)系統(tǒng)方面與真核生物存在差異，試驗(yàn)會(huì)產(chǎn)生大量假陽性與假陰性結(jié)果［10］。目前已經(jīng)開發(fā)幾種基于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的微核試驗(yàn)和彗星實(shí)驗(yàn)來代替動(dòng)物測試，但均存在評(píng)估成本過高和評(píng)估時(shí)間過長的不足［11］。因此，亟需發(fā)展一種成本更低、速度更快、信息可靠的遺傳毒性評(píng)估方法。

芽殖酵母釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一種代表性的單細(xì)胞真核生物，在遺傳毒性測試應(yīng)用方面具有多種優(yōu)勢。酵母細(xì)胞生長迅速、易于培養(yǎng)、遺傳背景簡單，使其成為優(yōu)良的生物傳感工具［12］。同時(shí)，作為真核生物，酵母與人類在許多代謝通路和蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)等方面高度保守［13］。當(dāng)遺傳毒性化合物引起酵母細(xì)胞DNA損傷時(shí)，細(xì)胞通過DNA損傷檢查點(diǎn)通路激活一系列蛋白激酶來進(jìn)行修復(fù)，相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平被上調(diào)，因此可以通過測量轉(zhuǎn)錄水平來評(píng)估DNA的損傷水平［14-15］。核糖核苷酸還原酶（ribonucleotide reduc?tase，RNR）是催化核糖核酸轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗鹾颂呛塑账徇^程的限速酶，在DNA的復(fù)制與修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用［16］。酵母細(xì)胞中存在4種亞單位的RNR（RNR1、RNR2、RNR3、RNR4），其中RNR2在正常狀態(tài)下表達(dá)水平很低，當(dāng)受到DNA損傷誘導(dǎo)后，蛋白表達(dá)增加十幾倍［17］。因此，將RNR2啟動(dòng)子（pRNR2）作為感應(yīng)元件與報(bào)告元件酵母增強(qiáng)綠色熒光蛋白（yeast enhanced green fluorescent pro?tein，yEGFP）基因相融合，構(gòu)建pRNR2調(diào)控的酵母重組載體（pRNR2-yEGFP），并將重組載體轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞中構(gòu)建細(xì)胞傳感器。當(dāng)遺傳毒性化合物作用于該重組酵母細(xì)胞傳感器時(shí)，能夠誘導(dǎo)pRNR2-yEGFP元件中的熒光報(bào)告基因的表達(dá)，通過測量熒光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)對(duì)化合物遺傳毒性的定量評(píng)估。

通過采用細(xì)胞壁合成與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)突變體改善酵母細(xì)胞滲透性，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)酵母細(xì)胞傳感器的檢測靈敏度與特異性的提高，敲除細(xì)胞壁合成基因erg6、cwp1和cwp2與膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因pdr5、snq2和yor1是提高酵母細(xì)胞傳感器檢測遺傳毒性靈敏度的有效方法［18-19］。酵母細(xì)胞具有較高的同源重組頻率和較短的同源片段長度需求，因此采用40 bp的同源臂的一步PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化能夠進(jìn)行目標(biāo)基因的敲除［20］。為了提高酵母細(xì)胞基因敲除的效率，需要設(shè)計(jì)更長的同源臂，而一步PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化法難以滿足，通常需要采取酶切、連接的方法構(gòu)建基因敲除組件［19］。本研究采用重疊PCR（overlap PCR）構(gòu)建pdr5與snq2基因敲除組件，設(shè)計(jì)的同源臂長度為600～700 bp，相較于傳統(tǒng)方法具有成本更低、操作簡便的優(yōu)點(diǎn)。構(gòu)建了pRNR2調(diào)控的基因突變型酵母細(xì)胞傳感器對(duì)遺傳毒性化合物進(jìn)行定量評(píng)估，并比較了不同基因突變對(duì)酵母細(xì)胞傳感器檢測準(zhǔn)確度與靈敏度的影響。

1材料

1.1 質(zhì)粒與菌株

酵母重組質(zhì)粒pRNR2-yEGFP由揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系李湘鳴教授贈(zèng)送；大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞（上海生工生物工程有限公司）；釀酒酵母BY4741、pESC-Leu質(zhì)粒、pESC-His質(zhì)粒（上海柯雷生物科技有限公司）。

1.2試劑

SD/-Ura、SD/-Leu、SD/-His、SD/-His-Leu、SD/-Ura-Leu、SD/-Ura-His、SD/-Ura-His-Leu培養(yǎng)基（上海艾禮生物科技有限公司）；PrimeSTAR Max DNA聚合酶（日本TaKaRa生物股份有限公司）；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、無毒核酸染料、TE緩沖液、TAE緩沖液（上海生工生物工程有限公司）；質(zhì)粒DNA小提試劑盒、膠回收/DNA純化試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）；DNA上樣緩沖液（南京翼飛雪生物科技有限公司）；甲磺酸甲酯（methyl meth?anesulfonate，MMS，98%，批號(hào)：EJ120007）、甲磺酸乙 酯（ethyl methanesulfonate，EMS，98%，批 號(hào)：DK190025）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；順鉑（65%）、4-硝基喹啉-N-氧化物（4-nitroquino?line-N-oxide，4NOQ，98%）、5-氟尿嘧啶（5-fluoroura?cil，5-FU，99%）、羥基脲（99%）、水楊酸（99.5%）、葡萄糖（99%）（上海麥克林生化科技有限公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.3儀器

專業(yè)型梯度PCR儀（德國耶拿公司）；Spectra?Max M2e多功能酶標(biāo)儀（美國分子儀器公司）；ECLIPSE Ti2-U型倒置熒光顯微鏡（日本尼康公司）；3500全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

2方 法

2.1 pdr5Δ∷LEU2與snq2Δ∷HIS3基因敲除組件的構(gòu)建

按常規(guī)玻璃珠法從釀酒酵母BY4741中提取基因組DNA后，采用overlap PCR構(gòu)建基因敲除組件，原理如圖1，研究中使用的引物見表1。首先PCR擴(kuò)增pdr5上游同源臂片段，設(shè)計(jì)引物q-1/q-2，PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒回收，命名為pdr5-1。同法擴(kuò)增pdr5下游同源臂片段，設(shè)計(jì)引物q-3/q-4，得到純化產(chǎn)物pdr5-2。以pESC-Leu質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增LEU2基因片段，設(shè)計(jì)引物q-5/q-6，得到純化產(chǎn)物L(fēng)EU2。

采用overlap PCR方法構(gòu)建pdr5Δ∷LEU2基因敲除組件。分別設(shè)計(jì)引物q-1/q-6與q-4/q-5，采用overlap PCR連接pdr5-1與LEU2片段以及pdr5-2與LEU2片段，分別得到純化產(chǎn)物pdr5-1-LEU2與pdr5-2-LEU2。設(shè)計(jì)引物q-7/q-8，采用overlap PCR連接pdr5-1-LEU2與pdr5-2-LEU2片段，得到純化產(chǎn)物pdr5Δ∷LEU2。

采用類似方法構(gòu)建snq2Δ∷HIS3基因敲除組件。首先設(shè)計(jì)引物q-9/q-10、q-11/q-12與q-13/q-14，分別擴(kuò)增得到snq2上下游同源臂snq2-1、snq2-2以及HIS3片段；設(shè)計(jì)引物q-9/q-14與q-12/q-13采用overlap PCR擴(kuò)增分別得到snq2-1-HIS3與snq2-2-HIS3片段；設(shè)計(jì)引物q-15/q-16，采用overlap PCR連接snq2-1-HIS3與snq2-2-HIS3片段，純化后得到snq2Δ∷HIS3。

Table1 PCRprimersused in thestudy

2.2 基因突變酵母細(xì)胞的構(gòu)建

采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將pdr5Δ∷LEU2與snq2Δ∷HIS3基因敲除組件分別轉(zhuǎn)入野生型酵母細(xì)胞BY4741，經(jīng)SD/-Leu與SD/-His平板篩選得到pdr5單基因突變與snq2單基因突變酵母細(xì)胞；再將snq2Δ∷HIS3基因敲除組件轉(zhuǎn)入snq2單基因突變酵母細(xì)胞，經(jīng)SD/-His-Leu平板篩選得到pdr5、snq2雙基因突變酵母細(xì)胞。采用玻璃珠法提取pdr5單基因突變、snq2單基因突變與pdr5、snq2雙基因突變酵母細(xì)胞的基因組DNA，分別設(shè)計(jì)引物q-7/q-8、q-15/q-16與q-7/q-8和q-15/q-16擴(kuò)增突變片段后進(jìn)行測序驗(yàn)證。

2.3 pRNR2調(diào)控的重組酵母細(xì)胞傳感器的建立

采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將pRNR2-yEGFP轉(zhuǎn)化于感受態(tài)酵母細(xì)胞BY4741，經(jīng)SD/-Ura、SD/-Ura-Leu、SD/-Ura-His、SD/-Ura-His-Leu平板篩選得到pRNR2調(diào)控的野生型、pdr5單基因突變、snq2單基因突變與pdr5、snq2雙基因突變酵母細(xì)胞傳感器。提取酵母細(xì)胞傳感器質(zhì)粒DNA，設(shè)計(jì)引物q-17/q-18擴(kuò)增質(zhì)粒片段進(jìn)行驗(yàn)證。

2.4 最大非細(xì)胞毒性濃度的確定

使用2%DMSO水溶液作為溶劑配制遺傳毒性化合物與陰性對(duì)照儲(chǔ)備液，并逐級(jí)稀釋至以下質(zhì)量濃度：MMS（10，30，60，80，100，180，250，300，400μg/mL）；EMS（50，100，200，400，800，1 000，1 300，1 500，2 000μg/mL）；順鉑（10，20，30，40，60，90，120，150，200μg/mL）；4NOQ（0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1，2，5μg/mL）；5-FU（0.01，0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1，2μg/mL）；羥基脲（100，200，400，500，800，1 200，1 500，2 000，2 500μg/mL）；水楊酸（0.1，0.5，1，2，5，10，15，30，50μg/mL）；葡萄糖（5，10，20，40，60，80，100，150，200μg/mL）。過夜培養(yǎng)4種酵母細(xì)胞單克隆，用新鮮的酵母培養(yǎng)液稀釋至A600為0.1。以底部透明的黑色微孔板為反應(yīng)載體，每孔中加入稀釋后酵母培養(yǎng)液190μL與測試化合物溶液或溶劑對(duì)照10μL，每種質(zhì)量濃度設(shè)置3個(gè)平行對(duì)照。微孔板置于30℃，220 r/min環(huán)境下培養(yǎng)24 h后，使用酶標(biāo)儀測量A600。最終測定時(shí)每孔中DMSO的濃度低于0.1%，對(duì)酵母細(xì)胞生長沒有明顯影響。

2.5 最佳暴露時(shí)間的確定

過夜培養(yǎng)4種酵母細(xì)胞單克隆，用新鮮的酵母培養(yǎng)液稀釋至A600為0.1。以底部透明的黑色微孔板為反應(yīng)載體，每孔中加入稀釋后酵母培養(yǎng)液190μL與MMS溶液10μL，質(zhì)量濃度為10，30，60，80，100，150，180，200，250μg/mL，每種濃度設(shè)置3個(gè)平行對(duì)照。微孔板置于30℃，220 r/min環(huán)境下培養(yǎng)，使用酶標(biāo)儀每間隔4小時(shí)測量A600與EGFP強(qiáng)度（激發(fā)光波長485 nm，發(fā)射光波長535 nm），持續(xù)時(shí)間20 h。

2.6 DNA損傷試劑暴露實(shí)驗(yàn)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)“2.4”與“2.5”項(xiàng)下確定測試化合物溶液的最大非細(xì)胞毒性濃度與細(xì)胞傳感器的最佳暴露時(shí)間，選用適宜濃度測試化合物溶液孵育4種酵母細(xì)胞傳感器適當(dāng)時(shí)間：MMS（10，30，60，100，150，200，250μg/mL）；EMS（50，100，300，600，1 000，1 300，1 500μg/mL）；順鉑（10，20，30，60，90，120，150μg/mL）；4NOQ（0.01，0.05，0.1，0.2，0.5，0.7，1μg/mL）；5-FU（0.01，0.05，0.1，0.15，0.2，0.3，0.4μg/mL）；羥基脲（100，200，400，800，1 000，1 200，1 500μg/mL）；水楊酸（1，2，5，10，15，20，30μg/mL）；葡萄糖（10，20，40，80，100，150，200μg/mL）。每種質(zhì)量濃度設(shè)置3個(gè)平行對(duì)照，其余操作同“2.5”項(xiàng)。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

在“2.4”項(xiàng)下中，采用Microsoft Excel 2013軟件計(jì)算測試化合物各濃度下4種酵母細(xì)胞傳感器A600均值，取3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。定義Ax/A0為暴露組A600與溶劑對(duì)照組A600的比值，設(shè)定Ax/A0小于90%為遺傳毒性數(shù)據(jù)的排斥閾值。

在“2.5”與“2.6”項(xiàng)中，通過扣除空白培養(yǎng)基校正EGFP與A600，采用Microsoft Excel 2013軟件計(jì)算4種酵母細(xì)胞傳感器的EGFP與A600的均值（n=3）。定義單位細(xì)胞的平均相對(duì)熒光強(qiáng)度AF（aver?age fluorescence）=EGFP/A600，取3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。定義熒光誘導(dǎo)倍數(shù)FI（fold induc?tion）為暴露組與溶劑對(duì)照組的單位細(xì)胞的平均相對(duì)熒光強(qiáng)度之比，則FI=AFtreated/AFuntreated。設(shè)定遺傳毒性閾值為1.5倍，即當(dāng)AF增加50%，且熒光強(qiáng)度隨劑量的增加表現(xiàn)出增長趨勢時(shí)，判斷化合物為遺傳毒性陽性，反之為陰性。采用Graphpad Prism 7.00軟件進(jìn)行制圖分析。

3結(jié) 果

3.1 pdr5Δ∷LEU2與snq2Δ∷HIS3基因敲除組件的構(gòu)建

采用overlap PCR方法構(gòu)建pdr5Δ∷LEU2與snq2Δ∷HIS3基因敲除組件，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2與圖3。結(jié)果顯示，pdr5Δ∷LEU2與snq2Δ∷HIS3基因敲除組件的堿基大小與預(yù)期一致，表明pdr5Δ∷LEU2與snq2Δ∷HIS3基因敲除組件構(gòu)建成功。

3.2 pRNR2調(diào)控的野生型、pdr5單基因突變、snq2單基因突變與pdr5、snq2雙基因突變酵母細(xì)胞傳感器的構(gòu)建

pdr5Δ∷LEU2與snq2Δ∷HIS3基因敲除組件轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞后，經(jīng)平板篩選得到的單克隆DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖4與圖5。結(jié)果顯示，擴(kuò)增出的酵母細(xì)胞基因突變片段的堿基大小與預(yù)期一致。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序并與GenBank序列比對(duì)，pdr5基因片段相似度為99.88%（3 289/3 293），間隙為0.12%（4/3 293）；snq2基因片段相似度為99.96%（2 542/2 543），間隙為0.04%（1/2 543），表明pdr5單基因突變、snq2單基因突變與pdr5、snq2雙基因突變酵母細(xì)胞構(gòu)建成功。

Figure 2 Gene knockout of pdr5Δ∷LEU2M:DNA markers;Lane 1-2:pdr5-1-LEU2(2 789 bp);Lane 3-4:pdr5-2-LEU2(2 817 bp);Lane5-9:pdr5Δ∷LEU2 geneknockout(3 304 bp)

Figure 3 Gene knockout of snq2Δ∷HIS3M:DNA markers;Lane 1-2:snq2-1-HIS3(1899 bp);Lane 3-4:snq2-2-HIS3(1 948 bp);Lane5-7:snq2Δ∷HIS3 gene knockout(2540 bp)

Figure 4 Mutant gene fragment of pdr5M:DNA markers;Lane 1-4:Single-gene mutation of pdr5(3 293 bp);Lane5-8:Double-genemutation of pdr5 and snq2(3 293 bp)

Figure 5 Mutant gene fragment of snq2M:DNA markers;Lane 1-4:Single-gene mutation of snq2(2 543 bp);Lane5-8:Double-genemutation of pdr5 and snq2(2 543 bp)

pRNR2-yEGFP重組載體轉(zhuǎn)入野生型、pdr5單基因突變、snq2單基因突變與pdr5、snq2雙基因突變4種酵母細(xì)胞，質(zhì)粒DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖6。結(jié)果顯示，擴(kuò)增出的質(zhì)粒DNA片段的堿基大小與預(yù)期一致，表明重組載體pRNR2-yEGFP已轉(zhuǎn)入4種酵母細(xì)胞，pRNR2調(diào)控的野生型、pdr5單基因突變、snq2單基因突變與pdr5、snq2雙基因突變酵母細(xì)胞傳感器構(gòu)建成功。

Figure6 Fragment of recombinant plasmid pRNR2-yEGFPM:DNA markers;Lane 1:Wild-type yeast cell sensor(1 493 bp);Lane 2:Yeast cell sensor of single-gene mutation of pdr5(1 493 bp);Lane 3:Yeast cell sensor of single-gene mutation of snq2(1 493 bp);Lane 4:Yeast cell sensor of double-gene mutation of pdr5 and snq2(1 493 bp)

3.3 化合物對(duì)酵母細(xì)胞傳感器的最大細(xì)胞毒性濃度的確定

應(yīng)用野生型、pdr5單基因突變、snq2單基因突變與pdr5、snq2雙基因突變酵母細(xì)胞傳感器對(duì)8種測試化合物進(jìn)行24 h生長抑制測試，4種細(xì)胞傳感器的Ax/A0結(jié)果見圖7。結(jié)果顯示，MMS、EMS、順鉑、4NOQ、5-FU、羥基脲與陰性對(duì)照水楊酸在高濃度下表現(xiàn)出抑制細(xì)胞生長的細(xì)胞毒性，陰性對(duì)照葡萄糖未表現(xiàn)出明顯細(xì)胞毒性。

3.4 MMS對(duì)酵母細(xì)胞傳感器最佳暴露時(shí)間的確定

經(jīng)“2.4”項(xiàng)確定MMS最大非細(xì)胞毒性濃度后，采用MMS進(jìn)行最佳暴露時(shí)間測試，野生型、pdr5單基因突變、snq2單基因突變與pdr5、snq2雙基因突變4種細(xì)胞傳感器結(jié)果見圖8。當(dāng)pRNR2調(diào)控的細(xì)胞傳感器與MMS作用時(shí)，F(xiàn)I值隨時(shí)間增加而逐漸增大，并于16 h時(shí)達(dá)到最大值，繼續(xù)暴露至20 h時(shí)下降，因此選擇16 h作為酵母細(xì)胞傳感器的暴露時(shí)間。

Figure 7 Cytotoxicity in yeast cells for tested compounds in 24 h(xˉ±s,n=3)A:MMS(methyl methanesulfonate);B:EMS(ethyl methanesulfonate);C:Cisplatin;D:4NOQ(4-nitroquinoline-N-oxide);E:5-FU(5-fluoroura?cil);F:Hydroxyurea;G:Salicylic acid;H:Glucose

Figure 8 Yeast cell sensors exposed to different concentrations of MMSsolution for 0,4,8,12,16,20 h(xˉ±s,n=3)

當(dāng)MMS質(zhì)量濃度最低為50μg/mL時(shí)，16 h暴露組細(xì)胞傳感器FI值超過1.5。pRNR2調(diào)控的野生型細(xì)胞傳感器暴露于MMS溶液下16 h的倒置熒光顯微鏡圖見圖9。與溶劑對(duì)照組（圖9-C）相比，50μg/mL MMS溶液組（圖9-D）的細(xì)胞傳感器表達(dá)出更亮的熒光。結(jié)果進(jìn)一步表明16 h為細(xì)胞傳感器適宜的暴露時(shí)間。

3.5 酵母生物傳感器暴露于測試化合物的熒光蛋白表達(dá)的量效關(guān)系

野生型、pdr5單基因突變、snq2單基因突變與pdr5、snq2雙基因突變4種酵母細(xì)胞傳感器暴露于系列濃度測試化合物16 h后，熒光蛋白表達(dá)的劑效關(guān)系見圖10。將本次研究中酵母細(xì)胞傳感器測試結(jié)果與已有報(bào)道的Ames試驗(yàn)、體外遺傳毒性試驗(yàn)與體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如表2所示。對(duì)于體內(nèi)外遺傳毒性數(shù)據(jù)呈陰性的兩種測試化合物水楊酸與葡萄糖，4種酵母細(xì)胞傳感器檢測結(jié)果均表現(xiàn)為遺傳毒性陰性；對(duì)于已有體內(nèi)外遺傳毒性數(shù)據(jù)的6種測試化合物，snq2單基因突變與pdr5、snq2雙基因突變細(xì)胞傳感器均檢測出陽性結(jié)果，測試準(zhǔn)確度100%，野生型與pdr5單基因突變細(xì)胞傳感器能檢測出4NOQ以外的其余五種測試化合物，測試準(zhǔn)確度87.5%。結(jié)果表明，pRNR2調(diào)控的細(xì)胞傳感器能夠用于遺傳毒性化合物檢測，且snq2單基因突變與pdr5、snq2雙基因突變細(xì)胞傳感器表現(xiàn)出更高的準(zhǔn)確度與特異性。

Figure 9 Wild-type cell sensor regulated by pRNR2 exposed to MMS solution for 16 hA:Bright-field image at 0μg/mL;B:Bright-field image at 50μg/mL;C:Inverted fluorescence microscope image at 0μg/mL;D:Inverted fluo?rescence microscope image at 50μg/mL

Figure10 Yeast cell sensorsexposured totested compoundsfor 16 h(xˉ±s,n=3)A:MMS(methyl methanesulfonate);B:EMS(ethyl methanesulfonate);C:Cisplatin;D:4NOQ(4-nitroquinoline-N-oxide);E:5-FU(5-fluorouracil);F:Hydroxyurea;G:Salicylic acid;H:Glucose

對(duì)于測試的6種遺傳毒性陽性模型化合物，pdr5、snq2雙基因突變細(xì)胞傳感器表現(xiàn)出明顯高于其他3種細(xì)胞傳感器的FI。在檢測靈敏度方面，雙基因突變細(xì)胞傳感器同樣表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。在測試6種遺傳毒性數(shù)據(jù)陽性化合物時(shí)，相較于其他3種細(xì)胞傳感器，雙基因突變細(xì)胞傳感器達(dá)到遺傳毒性閾值所需濃度降低了數(shù)倍。snq2單基因突變細(xì)胞傳感器相較于pdr5單基因突變細(xì)胞傳感器，在檢測4NOQ中表現(xiàn)出更高的準(zhǔn)確度；而在檢測5-FU方面，pdr5單基因突變細(xì)胞傳感器表現(xiàn)出更高的熒光響應(yīng)。野生型細(xì)胞傳感器在檢測靈敏度與熒光響應(yīng)強(qiáng)度方面并無突出表現(xiàn)。結(jié)果表明盡管snq2與pdr5高度同源，具有共同的反應(yīng)底物，但對(duì)于特異性底物表現(xiàn)出不同的響應(yīng)強(qiáng)度，snq2單基因突變細(xì)胞傳感器的檢測準(zhǔn)確度優(yōu)于pdr5單基因突變細(xì)胞傳感器，雙基因突變細(xì)胞傳感器在測試中表現(xiàn)出最佳的準(zhǔn)確度和靈敏度。

Table2 Genotoxicity of compoundstested by yeast cell sensorsand comparison with other tests

4討論

基于DNA損傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的酵母細(xì)胞傳感器進(jìn)行遺傳毒性測定具有成本低、樣品用量少、檢測迅速、準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于環(huán)境樣品與藥物化合物的遺傳毒性評(píng)估。通過敲除膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因或細(xì)胞壁合成基因增加酵母細(xì)胞滲透性已成為改善細(xì)胞傳感器檢測靈敏度的有效方法。本研究采用overlap PCR方法分別構(gòu)建pdr5與snq2基因敲除組件pdr5Δ∷LEU2與snq2Δ∷HIS3，設(shè)計(jì)的上下游同源臂長度為600～700 bp。將基因敲除組件與pRNR2-yEGFP重組質(zhì)粒通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞得到野生型、pdr5單基因突變、snq2單基因突變與pdr5、snq2雙基因突變酵母細(xì)胞傳感器，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果與基因測序結(jié)果驗(yàn)證了基因突變細(xì)胞傳感器構(gòu)建的成功。采用24 h酵母生長抑制試驗(yàn)測得各化合物最大非細(xì)胞毒性濃度，測試的6種遺傳毒性數(shù)據(jù)陽性化合物MMS、EMS、順鉑、4NOQ、5-FU、羥基脲與陰性化合物水楊酸都在一定濃度下表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，遺傳毒性數(shù)據(jù)陰性化合物葡萄糖在測試濃度范圍內(nèi)未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。4種酵母細(xì)胞傳感器暴露于系列濃度化合物16 h后，結(jié)果表明snq2單基因突變與pdr5、snq2雙基因突變細(xì)胞傳感器檢測準(zhǔn)確度為100%，高于野生型與pdr5單基因突變細(xì)胞傳感器（87.5%）。同一濃度下，雙基因突變細(xì)胞傳感器的熒光響應(yīng)顯著高于其他3種細(xì)胞傳感器，pdr5單基因突變細(xì)胞傳感器在5-FU檢測中表現(xiàn)出顯著高于野生型和snq2單基因突變細(xì)胞傳感器的熒光響應(yīng)。結(jié)果表明盡管snq2與pdr5高度同源，蛋白功能具有代償性，本研究發(fā)現(xiàn)snq2單基因突變細(xì)胞傳感器的檢測準(zhǔn)確度優(yōu)于pdr5單基因突變細(xì)胞傳感器，雙基因突變細(xì)胞傳感器檢測準(zhǔn)確度與靈敏度優(yōu)于單基因突變和野生型細(xì)胞傳感器。

綜上，本研究采用overlap PCR方法構(gòu)建組件對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行基因敲除，相較于一步PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化法基因敲除效率更高，相較于酶切連接構(gòu)建法具有成本更低、操作更簡便的優(yōu)勢。snq2單基因突變細(xì)胞傳感器的遺傳毒性檢測準(zhǔn)確度優(yōu)于pdr5單基因突變細(xì)胞傳感器，pdr5、snq2雙基因突變酵母細(xì)胞傳感器具有最佳的準(zhǔn)確度和靈敏度。因此，本實(shí)驗(yàn)為構(gòu)建高準(zhǔn)確度與靈敏度的酵母細(xì)胞傳感器提供了思路與方法，為酵母細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因pdr5與snq2的進(jìn)一步功能研究奠定了基礎(chǔ)。