彭一凡，王增明，王榮榮，2，杜祎萌，高 翔，鄭愛萍*，張 慧**

（1軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，北京100850；2華北理工大學(xué)藥學(xué)院，唐山063210）

姜黃素（curcumin）是從姜黃中提取的一種多酚化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和抗菌等多種藥理活性，且迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)，在預(yù)防和治療多種疾病方面具有很大的潛力［1-6］。然而，姜黃素屬于BCSⅣ類藥物，在pH 5.0的緩沖液中飽和溶解度僅為11 ng/mL，其難溶性為阻礙生物利用度提高的限速步驟，嚴(yán)重制約了姜黃素的臨床應(yīng)用［7］。為了解決藥物難溶性問題，采取了各種策略來提高溶出度，包括使用增溶劑、助溶劑、絡(luò)合劑、成鹽和縮小粒徑等［8-17］，其中能減小藥物顆粒尺寸的納米晶技術(shù)由于其各種優(yōu)勢(shì)受到了制劑研究者的青睞［18］。

目前納米晶的制備技術(shù)主要分為Top-down技術(shù)、Bottom-up技術(shù)和二者聯(lián)用的組合技術(shù)，其中Top-down技術(shù)里的介質(zhì)研磨法由于操作簡單、易于擴(kuò)大生產(chǎn)且制得的納米晶粒徑分布窄等優(yōu)點(diǎn)，成為目前上市納米晶藥物最常用的制備方法［19-21］。本研究旨在利用介質(zhì)研磨技術(shù)制備穩(wěn)定的姜黃素納米晶混懸液，并經(jīng)過固化制成口服膠囊，以提高口服姜黃素的溶出度和生物利用度，充分發(fā)揮姜黃素在治療多種疾病上的藥理活性優(yōu)勢(shì)，為其臨床應(yīng)用提供理論支撐。

1材料

1.1 藥品與試劑

姜黃素（陜西億康龍生物技術(shù)有限公司）；微晶纖維素（MCC）丸芯（日本旭化成株式會(huì)社）；蔗糖（湖南九典宏陽制藥有限公司）；吐溫80（太倉制藥廠）；聚維酮K30（PVPK30）、羥丙基甲基纖維素E5（HPMC E5）（北京鳳禮精求醫(yī)藥股份有限公司）；十二烷基硫酸鈉（SDS，上海麥克林生化科技有限公司）；羥丙基纖維素-SL（HPC-SL，日本曹達(dá)株式會(huì)社）；β-葡萄糖醛酸苷酶（美國Sigma公司）；多庫酯鈉（Doss，東莞市東岳葡萄糖廠有限公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.2儀器

Nano-ZS90激光粒度儀、Mastersizer 2000粒度分析儀（英國Malvern公司）；ECM-AP 05研磨機(jī)（華爾寶機(jī)械有限公司）；RC806D溶出試驗(yàn)儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；UltiMate 3000高效液相色譜儀（美國Thermo公司）；LCMS-8060液相質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）；D8 Advance X射線粉末衍射儀（德國布魯克公司）；DSC 200F3差示掃描量熱儀（德國Netzsch公司）；JSM-7900F場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）；WBF-IG多功能流化床（重慶英格造粒包衣技術(shù)有限公司）；BT-25S電子分析天平（德國Sartorius公司）。

1.3動(dòng)物

SD大鼠，雄性，體重200～230 g，購自北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心，許可證號(hào)：SCXK（京）2018-0010。本文涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)軍事醫(yī)學(xué)研究院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，審查編號(hào)IACUC-DWZX-2020-639。

2方法

2.1 姜黃素納米晶膠囊的制備

采用介質(zhì)研磨技術(shù)制備納米晶混懸液中間體，并以蔗糖為固化保護(hù)劑，經(jīng)流化床底噴包衣得到載藥微丸后灌裝膠囊，制備過程主要包括納米晶混懸液的制備及固化兩部分。

2.1.1 納米晶混懸液的制備 參考上市納米晶藥物的處方，初步確定待篩選穩(wěn)定劑PVP K30、SDS、吐溫80、HPC-SL、HPMC-E5和Doss。稱取處方量的穩(wěn)定劑溶于水180 mL中獲得穩(wěn)定劑溶液，將姜黃素20 g均勻分散于穩(wěn)定劑溶液中，將上述混懸液轉(zhuǎn)移到研磨機(jī)中（填充0.3 mm氧化鋯珠），開啟研磨機(jī)將轉(zhuǎn)速緩慢升至3 000 r/min，研磨得到所需粒徑的納米晶混懸液。設(shè)計(jì)制備了不同處方的姜黃素納米晶混懸液，以得到的混懸液放置穩(wěn)定性為考察指標(biāo)篩選處方。

2.1.2 固化 姜黃素納米晶混懸液中加入與姜黃素等質(zhì)量的蔗糖，攪拌混合均勻，得到含蔗糖的納米晶混懸液。采用流化床底噴工藝將混懸液中的納米晶負(fù)載到MCC空白丸芯（0.5～0.7 mm）上，工藝參數(shù)如下：風(fēng)量30 m3/h，進(jìn)風(fēng)溫度80℃，物料溫度40～45℃，霧化壓力1.8×105Pa，混懸液泵速5 r/min?；鞈乙罕萌虢Y(jié)束后，流化床中繼續(xù)風(fēng)干20 min，收集納米晶載藥微丸并進(jìn)行膠囊灌裝。

2.2 納米晶的粒度和Zeta電位

取適量制得的姜黃素納米晶混懸液，以蒸餾水稀釋至合適濃度，采用粒度分析儀測(cè)定姜黃素納米晶的粒徑、多分散系數(shù)（PDI）以及Zeta電位，每個(gè)樣品進(jìn)行3次測(cè)量，計(jì)算平均值，并監(jiān)測(cè)混懸液在放置期間粒徑和電位的變化。

2.3 姜黃素含量測(cè)定

采用HPLC法測(cè)定姜黃素含量。色譜條件：色譜柱為Phenomenex Luna C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈-4%冰醋酸溶液（55∶45）；檢測(cè)波長430 nm；柱溫30℃；流速為1 mL/min；進(jìn)樣量10μL。姜黃素質(zhì)量濃度在50.0～150.0μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系，回歸方程為A=1.343 9c-2.289 5，r=1；進(jìn)樣精密度RSD為0.20%（n=6）；加樣回收率平均值（100.15±0.66）%（n=9），經(jīng)驗(yàn)證該方法滿足姜黃素含量測(cè)定要求。

2.4 納米晶載藥微丸的穩(wěn)定性

定期取膠囊中的載藥微丸于水中輕微振搖，觀察再分散前后狀態(tài)，并利用粒度分析儀考察固化前后納米晶粒度變化及固化后室溫放置穩(wěn)定性；按照“2.3”項(xiàng)下方法對(duì)室溫儲(chǔ)存的納米晶混懸液中間體和納米晶載藥微丸進(jìn)行姜黃素含量測(cè)定，考察室溫條件下的化學(xué)穩(wěn)定性。

2.5 微觀形態(tài)觀察

通過掃描電鏡（SEM）對(duì)納米晶混懸液和載藥微丸均進(jìn)行了形態(tài)學(xué)表征，取1滴稀釋后的不同粒徑姜黃素混懸液滴到SEM樣品臺(tái)上，自然晾干后鍍金進(jìn)行觀察；取少量載藥微丸樣本用碳導(dǎo)電膠帶粘貼在鋁樣本臺(tái)上，鍍膜儀鍍鉑金導(dǎo)電膜，場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡下對(duì)表面形態(tài)及切面進(jìn)行觀察。

2.6 體外溶出試驗(yàn)

利用槳法考察不同粒徑姜黃素混懸液、載藥微丸及膠囊的溶出特性。取含姜黃素90 mg的不同粒徑混懸液、微丸以及膠囊（置于沉降籃中），加入溶出介質(zhì)（1%SDS水溶液）900 mL中，轉(zhuǎn)速75 r/min，溫度為37℃。分別于5，10，15，20，30，45，60，90，120，180 min取樣10 mL，用0.22μm聚四氟乙烯（PTFE）濾膜過濾，取續(xù)濾液，HPLC法測(cè)定其中姜黃素濃度，計(jì)算累積溶出度并繪制溶出曲線。

2.7 X射線粉末衍射（XRPD）

取姜黃素原料藥、空白輔料（PVPK30、SDS）、物理混合物（姜黃素原料藥、PVPK30、SDS）、姜黃素納米晶混懸液凍干粉末，姜黃素納米晶混懸液真空干燥粉末各適量，進(jìn)行XRPD測(cè)定。工作條件為管電壓40 kV，管電流40 mA，掃描范圍3°～40°，掃描速度每步停0.1 s，步長0.02°。所得結(jié)果繪制XRPD曲線圖。

2.8 差示掃描量熱（DSC）試驗(yàn)

取姜黃素原料藥、空白輔料（PVPK30、SDS）、物理混合物（姜黃素原料藥、PVPK30、SDS）、姜黃素納米晶混懸液凍干粉末，姜黃素納米晶混懸液真空干燥粉末各適量于鋁坩堝中，蓋上扎孔，進(jìn)行測(cè)試。工作條件為氮?dú)饬魉?0 mL/min，以10℃/min的速度由28℃升至300℃，測(cè)得結(jié)果繪制DSC曲線圖。

2.9 藥代動(dòng)力學(xué)研究

因大鼠無法吞服膠囊，故將姜黃素納米晶膠囊于適量水中分散，短暫靜置后收集上層混懸液，棄去丸芯，得到納米晶膠囊分散液，并取樣稀釋，按“2.3”項(xiàng)下方法檢測(cè)分散液中姜黃素的濃度。將12只健康的雄性SD大鼠隨機(jī)分為兩組，分別灌胃給予姜黃素原料藥和姜黃素納米晶膠囊再分散混懸液，給藥前禁食12 h，自由飲水。按照劑量為200 mg/kg給藥后，于5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h大鼠眼眶采血0.5 mL，置于乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝管中13 000 r/min離心5 min，取上清液轉(zhuǎn)移至空白EP管中，于-20℃條件下保存。采用高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度。色譜質(zhì)譜條件：流動(dòng)相A相為水（含0.1%甲酸），B相為乙腈（含0.1%甲酸）；梯度洗脫：0～0.3 min，10%B；0.3～2.5 min，10%B→95%B；2.5～3.0 min，95%B；3.0～4.0 min，10%B；流速為0.7 mL/min；柱溫40℃；采用選擇性正離子對(duì)監(jiān)測(cè)模式（MRM）測(cè)定姜黃素（m/z369.3/177.1）的濃度，普萘洛爾作內(nèi)標(biāo)（m/z260.1/116.1），離子化方式為電噴霧離子源（ESI）。

取待測(cè)血漿樣本25μL，加入β-葡萄糖醛酸苷酶2.5μL混勻后37℃孵育1 h，再加內(nèi)標(biāo)工作液（50 ng/mL）100μL，混勻后于4℃、4 000 r/min離心10 min；取上清液70μL，加入50%乙腈210μL混勻后，于4℃、4 000 r/min離心2 min，取上清液進(jìn)樣分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 姜黃素納米混懸劑處方篩選

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)制備不同處方的姜黃素納米晶混懸液，以粒度的變化評(píng)價(jià)篩選處方，結(jié)果見表1。

比較不同處方納米晶混懸液的放置穩(wěn)定性，其中處方2、3、5能夠維持粒度穩(wěn)定，平均粒徑無顯著增長，證明PVPK30、SDS及吐溫80是良好的穩(wěn)定劑。在確保納米晶混懸液穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)選輔料用量少的處方，篩選出處方3和處方5，其在1個(gè)月時(shí)間內(nèi)的穩(wěn)定性見圖1和圖2。

Table1 Stabilizing effect of formulations with different types and dosages of stabilizers at the grinding speed of 3000 r/min

Figure 1 Stability of particle size(A),PDI(B)and Zeta potential(C)of formulation 3 nanocrystal suspension(xˉ±s,n=3)

Figure 2 Stability of particle size(A),PDI(B)and Zeta potential(C)of formulation 5 nanocrystal suspension(xˉ±s,n=3)

兩處方納米晶混懸液的粒徑、PDI、Zeta電位在一個(gè)月時(shí)間內(nèi)均無明顯變化，因此，所制備的納米晶混懸液符合中間體的穩(wěn)定性要求。

3.2 納米晶固化及穩(wěn)定性研究

為了方便貯存、運(yùn)輸、服用以及攜帶，同時(shí)解決姜黃素納米晶混懸液著色能力過強(qiáng)的問題，提高患者依從性，本研究對(duì)混懸液進(jìn)行了固化。在不加固化保護(hù)劑的情況下，納米晶上藥后發(fā)生聚集，為此本研究以廉價(jià)易得的蔗糖為兩種優(yōu)選處方的固化保護(hù)劑，在流化床中進(jìn)行底噴上藥，二者均能順利負(fù)載到微晶纖維素丸芯上。

將載藥微丸分散到水中進(jìn)行表征，結(jié)果表明，含有吐溫80的納米晶載藥微丸在水中時(shí)，藥物從丸芯上呈片狀脫落，無法恢復(fù)為上藥之前的納米晶狀態(tài)，這可能與吐溫80干燥后將納米晶結(jié)合成緊密的團(tuán)塊，不易被水復(fù)溶分散有關(guān)。含有PVP K30與SDS的納米晶載藥微丸在水中再分散效果良好，能迅速分散得到200 nm左右的姜黃素納米晶，其在135 d內(nèi)再分散穩(wěn)定性見圖3?？梢钥闯?，該處方納米晶混懸液固化后粒徑與PDI無顯著變化，且長期保持穩(wěn)定，利于儲(chǔ)存，故最終確定以PVPK30為立體保護(hù)劑，SDS為電荷保護(hù)劑，蔗糖為固化保護(hù)劑制備姜黃素納米晶載藥微丸。所得載藥微丸流動(dòng)性良好，可直接進(jìn)行膠囊灌裝。

Figure 3 Redispersion stability of nanocrystalline drug-loaded pellets beforeand after curing(xˉ±s,n=3)

穩(wěn)定性研究結(jié)果表明，納米晶混懸液室溫放置4個(gè)月時(shí)姜黃素含量為初始含量的（96.84±0.97）%（n=3）；制成納米晶載藥微丸后，4個(gè)月時(shí)姜黃素含量為最初的（99.53±0.42）%（n=3），均在初始含量的95%～105%之間，含量無顯著變化，說明將姜黃素納米晶混懸液制成載藥微丸后化學(xué)穩(wěn)定性良好。

3.3 微觀形態(tài)觀察

兩種優(yōu)選處方載藥微丸表面及切面形態(tài)見圖4?？擅黠@觀察到，含有PVPK30與SDS的納米晶載藥微丸表面更為圓整致密，而吐溫80作穩(wěn)定劑的微丸粗糙不規(guī)則，散粉較多。這可能與PVPK30具有黏合劑的特性有關(guān)，能將姜黃素納米晶較好地結(jié)合到一起，且易被水溶解而分散。而常溫下為液體的吐溫80干燥效果較差，上藥率較低，部分姜黃素以散粉形式殘留。故從上藥效果、再分散效果、表面形態(tài)等方面考慮，均為前者更優(yōu)。

Figure 4 SEM characterization of the appearance,surface and section(fromleft toright)of curcumin nanocrystallinedrug-loaded pelletsA:stabilizer:PVPK30 and SDS;B:stabilizer:Tween 80

按最優(yōu)處方（穩(wěn)定劑：PVPK30和SDS）制備了不同粒徑的姜黃素納米晶混懸液，粒度測(cè)定結(jié)果見表2，除未經(jīng)研磨的姜黃素混懸液外，其他混懸液中值粒徑分別約為2μm、750 nm、500 nm、200 nm，掃描電鏡圖像如圖5所示，姜黃素實(shí)際尺寸與粒徑儀測(cè)定結(jié)果基本相符，測(cè)定結(jié)果可靠，研磨所得顆粒呈不規(guī)則狀。

3.4 體外溶出試驗(yàn)

姜黃素在水中幾乎不溶，采用1%SDS溶液為溶出介質(zhì)，不同粒徑姜黃素顆粒、載藥微丸及膠囊體外釋放效果如圖6所示?？梢钥吹剑唇?jīng)研磨的姜黃素3 h累積釋放只有（74.29±2.39）%，未完全溶出，證明姜黃素原料藥溶出度低。隨著粒徑減小，姜黃素溶出速率顯著增加，原料藥、2μm、750 nm、500 nm的樣品5 min時(shí)累積溶出分別達(dá)到（16.24±0.54）%、（47.06±1.93）%、（79.23±1.04）%和（84.91±1.19）%，200 nm的姜黃素納米晶在5 min內(nèi)即可完全溶出，其累積溶出率為（100.98±3.92）%，說明將姜黃素粒徑減小到200 nm能極大地促進(jìn)體外釋放。載藥微丸和膠囊5 min累積溶出分別達(dá)到（93.79±4.80）%和（89.09±3.34）%，均大于85%，為快速溶出，與200 nm混懸液的溶出結(jié)果無顯著性差異。研究結(jié)果表明，與原料藥相比，制備的姜黃素納米晶膠囊能顯著提高藥物溶出度及溶出速率，促進(jìn)體外釋放，有利于體內(nèi)進(jìn)一步吸收。

Table 2 Results of particle size determination of curcumin granules with different particle sizes

Figure 5 SEM characterization of curcumin granules with different particle sizesA:API;B:2μm;C:750 nm;D:500 nm;E:200 nm

Figure 6 In vitro dissolution curves of capsules,drug-loaded pellets and suspensions with different particle sizes(xˉ±s,n=6)

3.5 XRPD與DSC分析

通過XRPD和DSC研究了姜黃素研磨前后的晶型，比較了兩種干燥方式對(duì)晶型的影響，XRPD分析結(jié)果見圖7，DSC分析結(jié)果見圖8。與物理混合物特征峰相比，納米晶干燥粉末的特征衍射峰位置基本沒有發(fā)生改變，而峰強(qiáng)度明顯減小，說明姜黃素一部分保持原晶型，另一部分轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定型。根據(jù)DSC曲線，姜黃素制備為納米晶后吸熱峰位置基本不變而強(qiáng)度變?nèi)?，分析結(jié)果與XRPD結(jié)果一致，且干燥方式對(duì)晶型影響不大。從XRPD和DSC的結(jié)果可以看出，用最優(yōu)處方制備納米晶的過程中，部分姜黃素轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定型，需要更少的能量來克服晶格力，這可能會(huì)是姜黃素納米晶的溶出提高的原因之一。

Figure 7 XRPD curves of API,stabilizer,physical mixture and nano?crystal samplesa:Curcumin;b:Stabilizer;c:Physical mixture;d:Nanocrystals(vacuum drying);e:Nanocrystals(freezedrying)

Figure 8 DSC curves of API,stabilizer,physical mixture and nano?crystal samplesa:Curcumin;b:Stabilizer;c:Physical mixture;d:Nanocrystals(vacuum drying);e:Nanocrystals(freezedrying)

3.6 藥代動(dòng)力學(xué)研究

姜黃素原料藥和姜黃素納米晶膠囊分散液藥時(shí)曲線如圖9所示。原料藥與納米晶制劑的AUC0-t分 別 為（1 115.02±398.38）μg/L?h和（10 359.41±3 396.04）μg/L?h，tmax分別為（9.35±11.42）h和（2.83±2.84）h，cmax分別為（134.61±126.57）μg/L和（1 168.57±533.64）μg/L，兩組生物利用度有顯著性差異（P＜0.05）。研究結(jié)果表明，納米晶制劑體內(nèi)吸收迅速，這跟體外溶出速率的增加是相符的；納米晶制劑AUC0-t和cmax分別是原料藥的9.3倍和8.68倍，證明將原料藥制成納米晶制劑后顯著提高了姜黃素的生物利用度。同時(shí)有研究表明，姜黃素通過膽汁進(jìn)入腸道后，原型藥物和代謝產(chǎn)物會(huì)經(jīng)腸道菌群水解后被重吸收，形成肝腸循環(huán)，這可以解釋納米晶組曲線出現(xiàn)的雙峰現(xiàn)象［22］。

Figure 9 Plasma concentration-time curves of nanocrystalline prepa?ration and API(xˉ±s,n=6)

4結(jié) 論

本研究采用納米晶技術(shù)提高溶出度，溶出速率以及體內(nèi)生物利用度，利用介質(zhì)研磨技術(shù)將姜黃素研磨至目標(biāo)粒徑，并固化為固體制劑便于口服，提高患者的依從性。

本研究制備了不同粒徑的姜黃素納米晶混懸液，比較其體外釋放效果，確定了減小姜黃素粒徑能有效改善姜黃素的溶出行為，研磨至200 nm的納米晶增溶效果優(yōu)異，定為目標(biāo)粒徑。為獲得穩(wěn)定的姜黃素納米晶混懸液，本研究通過改變穩(wěn)定劑的種類及用量，最終篩選得到了兩種處方的納米晶混懸液。通過流化床底噴技術(shù)進(jìn)行微丸上藥，比較兩處方載藥微丸的表面形態(tài)及再分散效果，發(fā)現(xiàn)以PVPK30和SDS為穩(wěn)定劑的納米晶混懸液，微丸上藥后表面形態(tài)更為致密圓整，且固化前后粒徑無顯著變化，穩(wěn)定性良好。制備的姜黃素納米晶膠囊顯著提高了體外溶出速率和溶出度。體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果證明，將姜黃素制成納米晶制劑后，其在大鼠體內(nèi)的生物利用度能夠達(dá)到原料藥的9.3倍，吸收速度和程度顯著提高。

本研究成功獲得了室溫下長期放置穩(wěn)定的姜黃素納米晶膠囊，極大地改善了其溶出度并提高了生物利用度，在難溶性藥物姜黃素的臨床應(yīng)用及產(chǎn)業(yè)化方面具有積極意義。該制劑相關(guān)藥效學(xué)等方面研究還有待進(jìn)一步深入開展。