賴 慧 賴洪林 陳 立 任 維 楊思進(jìn) 趙福蘭

蟾酥在《藥性論》和《日華子本草》中被稱為“蟾蜍眉脂”和“蟾蜍眉酥”，由中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍耳后腺和皮膚腺的白色分泌液干燥而成[1]。屬特殊管理的28種有毒中藥之一[2]。據(jù)《中藥大辭典》記載，蟾酥“有毒，能破癮結(jié)，行水濕，化毒，殺蟲，定痛”。據(jù)《本草匯言》記載，“蟾酥，療疳積，消膨脹，解療毒之藥也”[3]。蟾酥藥理作用多，成分復(fù)雜，有很強(qiáng)的抗腫瘤活性[4]。有研究表明，蟾酥與索拉非尼聯(lián)合作用可引起人肝癌HepG2細(xì)胞S期周期阻滯[5]。蟾酥注射液是從中華大蟾蜍耳后腺分泌液中提取的水溶性藥物，主要含吲哚堿衍生物，包括蟾毒靈、華蟾毒配基和酯蟾毒配基等，現(xiàn)作為抗腫瘤輔助藥物[6, 7]。將蟾酥注射液聯(lián)合肝動脈內(nèi)插管化療栓塞術(shù)治療原發(fā)性中晚期肝癌，患者病程可明顯緩解[8]。曲金榮等[9]研究發(fā)現(xiàn)蟾酥注射液還能降低原發(fā)性肝癌引發(fā)的肝損害。但蟾酥注射液對于肝癌的凋亡誘導(dǎo)機(jī)制還不夠明確。因此本研究選取蟾酥注射液為研究對象，觀察其對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的生長抑制和凋亡誘導(dǎo)作用，為肝癌的臨床治療提供實驗依據(jù)。

材料與方法

1.材料：人肝癌SMMC-7721細(xì)胞由西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院腫瘤藥理實驗室惠贈。蟾酥注射液購自江蘇浦金藥業(yè)有限公司。胰酶細(xì)胞消化液、CCK-8試劑盒、活性氧檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒和Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司。RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：快速融化從液氮中取出的SMMC-7721細(xì)胞，離心后用完全培養(yǎng)基(含10 %胎牛血清，1%青鏈霉素)重懸，隨后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)7721細(xì)胞快要鋪滿培養(yǎng)瓶瓶底時，進(jìn)行細(xì)胞傳代。

3.CCK-8細(xì)胞增殖抑制實驗：將7721細(xì)胞以6×103/ml的密度接種于96孔板中，24h后，加入不同濃度的蟾酥注射液，每組設(shè)復(fù)孔3個。藥物作用24、48及72h后，加入CCK-8試劑，孵育30min后測定各孔吸光度(A)值，計算細(xì)胞增殖抑制率。該實驗重復(fù)3次。

4.ROS檢測實驗：將7721細(xì)胞制成密度為1×104/ml的懸液接種于6孔板中，細(xì)胞貼壁生長后，藥物處理48h，收集細(xì)胞，裝載DCFH-DA探針。培養(yǎng)箱中孵育20min后，用無血清培養(yǎng)基洗滌3次，流式細(xì)胞儀檢測各組ROS水平。該實驗重復(fù)3次。

5.線粒體膜電位熒光觀察實驗：將7721細(xì)胞以1×104/ml的密度接種于玻璃小皿中，細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的蟾酥注射液，藥物作用48h 后，進(jìn)行JC-1染色。染色時孵育20min。隨后用1×的JC-1染色緩沖液沖洗2次。置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。該實驗重復(fù)3次。

6.細(xì)胞凋亡率檢測實驗：將7721細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞密度為1×104/ml。24h后用不同濃度的蟾酥注射液處理48h，收集細(xì)胞，PBS清洗1遍，每孔再分別加入200μl nnexin V-FITC結(jié)合液，5μl PI染色液和2μl Annexin V-FITC染色液并混勻，避光染色20min(室溫)，流式細(xì)胞儀檢測其凋亡率。該實驗重復(fù)3次。

7.統(tǒng)計學(xué)方法：采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用One-wayANOVA單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.蟾酥注射液對SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制作用：不同濃度蟾酥注射液處理后的7721細(xì)胞增殖活性明顯受到抑制(表1)，與對照組比較，蟾酥注射液對7721細(xì)胞的抑制作用隨藥物濃度的增大而增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；同一濃度的蟾酥注射液對7721細(xì)胞的抑制作用隨藥物作用時間的延長而增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。蟾酥注射液作用7721細(xì)胞24、48及72h后，IC50分別為2.60±0.01、2.00±0.10和1.57±0.17μg/L。

表1 CCK-8法檢測蟾酥注射液對SMMC-7721細(xì)胞增殖抑制率的影響

2.SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)ROS水平：根據(jù)IC50結(jié)果，選取低、中、高濃度分別為1.0、2.5和5.0μg/L的蟾酥注射液作用于7721細(xì)胞48h，測得各組ROS熒光值變化(圖1)。熒光強(qiáng)度峰值逐漸右移，ROS水平以百分比(%)表示。7721細(xì)胞內(nèi)ROS水平隨蟾酥注射液濃度的增加而增加，與對照組(9.60%±2.80%)比較，1.0、2.5和5.0μg/L藥物處理組的ROS水平(66.35%±3.29%、82.92%±1.90%和85.17%±1.72%)均有明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測SMMC-7721細(xì)胞中ROS表達(dá)水平

3.SMMC-7721細(xì)胞線粒體膜電位變化：用不同濃度的蟾酥注射液分別處理7721細(xì)胞48h后，觀察到各組線粒體膜電位熒光變化隨藥物濃度的增加，綠色熒光逐漸增強(qiáng)，而紅色熒光逐漸減弱(圖2)。

圖2 熒光染色法檢測SMMC-7721細(xì)胞線粒體膜電位變化(JC-1染色，×200)

4.SMMC-7721細(xì)胞凋亡率：不同濃度蟾酥注射液作用7721細(xì)胞48h后，對照組7721細(xì)胞的總凋亡率為10.08%±0.70%，1.0μg/L蟾酥注射液組細(xì)胞總凋亡率為17.33%±3.20%，與對照組比較凋亡率增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖3)。2.5、5.0μg/L蟾酥注射液組細(xì)胞總凋亡率分別為25.60%±1.05%和35.76%±4.72%，與對照組比較，凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000，圖4)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測SMMC-7721細(xì)胞凋亡率

圖4 蟾酥注射液對SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響

討 論

原發(fā)性肝癌是目前我國第4常見的惡性腫瘤，在腫瘤致死病因中位列第2位，潛伏期長，病死率高，嚴(yán)重威脅人民的生命健康[10]。目前，西醫(yī)治療肝癌的主要方法是通過手術(shù)切除肝癌腫塊，但手術(shù)風(fēng)險大，很多患者無法耐受[11]。近年來，中醫(yī)藥的不斷發(fā)展，為肝癌的治療提供了新思路。中醫(yī)認(rèn)為癌毒是肝癌發(fā)生的關(guān)鍵，虞摶在《醫(yī)學(xué)正傳》中記載，“大毒之病，必用大毒之藥以攻之”，有研究者因而采取以毒攻毒法治療肝癌，臨床療效顯著[12]。蟾酥作為動物類毒性中藥之一，其制劑對肝癌的作用已成為研究的熱點。本研究體外實驗證實了蟾酥水提取物中藥制劑——蟾酥注射液對SMMC-7721細(xì)胞具有明顯抑制作用，且呈濃度和時間依賴性。

本研究中1.0、2.5和5.0μg/L的蟾酥注射液處理組細(xì)胞ROS水平與對照組比較均有明顯增加。生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)的ROS主要由細(xì)胞的線粒體氧化產(chǎn)生，其產(chǎn)生和清除之間保持動態(tài)平衡[13]。當(dāng)ROS積累過多時，線粒體滲透性轉(zhuǎn)運孔上的相應(yīng)敏感位點被氧化，進(jìn)而發(fā)生氧化性損傷[14]。有研究表明, 大量的ROS能夠啟動細(xì)胞的凋亡級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。本研究證實了蟾酥注射液可以增加ROS水平，可以推測這與7721細(xì)胞凋亡有關(guān)。

線粒體是細(xì)胞的能量代謝中心，但其DNA缺乏組蛋白的保護(hù)，易發(fā)生損傷。在受到ROS攻擊后易發(fā)生脂質(zhì)過氧化改變，導(dǎo)致膜通透性增加，釋放細(xì)胞色素C，激活凋亡蛋白caspase-3，引起細(xì)胞凋亡[16]。線粒體膜電位是膜兩側(cè)離子濃度不同而產(chǎn)生的跨膜電位差，是反映線粒體功能狀態(tài)的重要指標(biāo)[17]。細(xì)胞凋亡的早期通常伴隨線粒體膜電位下降[18]。本研究選擇的熒光探針JC-1在細(xì)胞線粒體膜電位較高時，會形成聚合物，發(fā)出紅色熒光，而膜電位較低時，則為單體，發(fā)出綠色熒光，因此觀察JC-1熒光顏色的變化可以確定線粒體膜電位的變化。本研究中，不同濃度的蟾酥注射液分別作用于7721細(xì)胞48h后，激光共聚焦顯微鏡觀察到隨藥物濃度的增加，綠色熒光越來越強(qiáng)，而紅色熒光越來越弱，可見，給藥組線粒體膜電位隨藥物濃度增加而下降，7721細(xì)胞線粒體損傷程度隨藥物濃度增加而越來越嚴(yán)重，這種變化與蟾酥注射液引起的ROS水平變化呈一定相關(guān)性，提示蟾酥注射液引起的7721細(xì)胞線粒體損傷，可能與線粒體受到高濃度ROS的氧化攻擊有關(guān)。本研究通過檢測7721細(xì)胞總凋亡率進(jìn)一步證實蟾酥注射液濃度越高，細(xì)胞總凋亡率越大，可以推測蟾酥注射液可損傷線粒體，使線粒體膜電位下降，誘導(dǎo)7721細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究驗證了蟾酥注射液可以抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)7721細(xì)胞凋亡，該凋亡可能與蟾酥注射液引起7721細(xì)胞ROS含量增加、進(jìn)而導(dǎo)致線粒體損傷、膜電位下降有關(guān)。本研究為蟾酥注射液對肝癌的臨床治療奠定了一定的實驗基礎(chǔ)，但相關(guān)研究結(jié)論并未通過體內(nèi)實驗予以證實，所以還有待于開展深入研究。