樊煒靜，李遠(yuǎn)翔，盧慧敏，徐 烽，柳國斌

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海200032）

糖尿病潰瘍作為糖尿病較為常見的并發(fā)癥，是糖尿病患者致死致殘的主要原因之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球有超過3.5 億人患有2 型糖尿病，其中有大約20%的人會在有生之年發(fā)展為糖尿病潰瘍［1］。盡管越來越多的治療方法被發(fā)現(xiàn)和使用，但仍有近40%的患者的潰瘍不能在1 年內(nèi)愈合，有數(shù)據(jù)顯示超過10%的糖尿病潰瘍患者最終會面臨截肢［2，3］。因此，如何解決糖尿病潰瘍延期愈合的問題，已經(jīng)成為一個(gè)世界性的難題。

近年來，中醫(yī)藥作為一種安全且有效的治療方法，在糖尿病潰瘍的治療中得到了越來越多人的認(rèn)可。黃芪為豆科植物蒙古黃芪和膜莢黃芪的干燥根，味甘，性溫，歸肺、脾經(jīng)，有益氣升陽固表、托毒生肌排膿的作用；紫草為紫草科植物新疆紫草、紫草或內(nèi)蒙紫草的干燥根，味甘、咸、寒，歸心、肝經(jīng)，有涼血活血，解毒透毒的功效［4］?，F(xiàn)代研究證明黃芪中皂甙、蔗糖、多糖、多種氨基酸、葉酸及硒、鋅、銅等多種微量元素有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗應(yīng)激和較廣泛的抗菌作用［5，6］；紫草素對大腸桿菌、傷寒桿菌、痢疾桿菌、綠膿桿菌及金黃色葡萄球菌均有明顯抑制作用，其乙醚、水、乙醇提取物也有一定的抗炎作用［7］。

黃芪與紫草配伍，二者一溫一寒，攻補(bǔ)兼施，既能涼血活血，又能補(bǔ)足正氣，既能迫毒外出，又能及時(shí)生肌收口，對于糖尿病潰瘍這一類以正虛邪盛為主要病機(jī)特點(diǎn)的慢性消耗性疾病有較好治療效果。上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院將黃芪與紫草配伍，結(jié)合朱砂、冰片、阿膠、龍血竭，制成外用制劑紫朱軟膏，并使用紫朱軟膏治療糖尿病潰瘍，已經(jīng)證實(shí)有確切療效［8-10］。為深入研究黃芪-紫草藥治療糖尿病潰瘍的作用機(jī)制，本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對黃芪-紫草藥對的活性成分進(jìn)行篩選，對其作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，并通過GO 和KEGG 富集分析對有效成分在疾病效應(yīng)靶點(diǎn)中的可能作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測，以期為未來的實(shí)驗(yàn)研究提供更多思路。

1 材料與方法

1.1 黃芪-紫草藥對的主要活性化合物的篩選及作用靶點(diǎn)的確定

使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）［11］檢索黃芪和紫草的活性成分。檢索限定條件［12，13］：口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%；藥物類藥性（drug likeness，DL）≥0.18。并通過TCMSP 系統(tǒng)查找黃芪與紫草主要活性化合物的作用靶點(diǎn)，使用Perl 軟件（V5.26.3）在Uniprot 數(shù)據(jù)庫［14］（https：//uniprot.org/）中為活性化合物對應(yīng)關(guān)鍵靶點(diǎn)添加基因號及進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化命名。

1.2 糖尿病潰瘍疾病靶點(diǎn)的收集

使用人類孟德爾遺傳研究平臺OMIM（https：//www.omim.org/）和人類基因信息數(shù)據(jù)庫GeneCards（https：//www.genecards.org/），以“diabetic ulcer”為關(guān)鍵詞對糖尿病潰瘍的疾病相關(guān)靶標(biāo)進(jìn)行檢索。

1.3 藥物與疾病共同靶點(diǎn)篩選及互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用R 軟件（V3.6.3）篩選黃芪-紫草藥對與糖尿病潰瘍的疾病相關(guān)靶標(biāo)的交集，繪制Venn 圖，得到藥物與疾病共同靶點(diǎn)；將共同靶點(diǎn)輸入STRING平臺［15］（https：//string-db.org/），種屬限定為Homosapiens，獲取蛋白相互作用關(guān)系，構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）。

1.4 藥物-化合物-作用靶點(diǎn)-疾病作用網(wǎng)絡(luò)圖搭建

使用Cytoscape 3.7.2 軟件（http：//www.cytoscape.org/），將黃芪-紫草藥對中藥物、成分、靶點(diǎn)、通路之間的相互關(guān)系構(gòu)建可視化互作網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)圖中“Node”代表藥物、活性成分、靶點(diǎn)和疾病，“Edge”代表各個(gè)節(jié)點(diǎn)之間的聯(lián)系。

1.5 GO 分析和KEGG 通路富集分析

使用Bioconductor 生物信息軟件包（http：//www.bioconductor.org/）對核心靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO基因生物過程富集（gene ontology）［16］和KEGG 信號通路富集（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）［17］分析，其結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 黃芪-紫草藥對的主要活性化合物及作用靶點(diǎn)

通過篩選，共32 個(gè)主要活性成分被納入本次研究（表1）；通過TCMSP 檢索到黃芪-紫草藥對的作用靶點(diǎn)共1 394 個(gè)。使用Uniprot 數(shù)據(jù)庫篩選32 個(gè)主要活性成分的作用靶點(diǎn)的基因名并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，刪除無效和重復(fù)靶點(diǎn)后，最終獲取作用靶點(diǎn)98 個(gè)。

表1 主要成分及其參數(shù)Tab 1 Main constituents and their parameters

2.2 糖尿病潰瘍的疾病靶點(diǎn)

通過OMIM 獲取糖尿病潰瘍疾病靶點(diǎn)169 個(gè)，通過GeneCards 獲取糖尿病潰瘍疾病靶點(diǎn)4 491 個(gè)，整理后共收集到糖尿病潰瘍疾病靶點(diǎn)共4 585 個(gè)。

2.3 黃芪-紫草藥對治療糖尿病潰瘍共同靶點(diǎn)篩選及互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

共得到藥物與疾病共同作用靶點(diǎn)81 個(gè)（表2）；繪制Veen 圖（圖1）。通過PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，共得到77個(gè)節(jié)點(diǎn)和721 條邊（圖2）。對蛋白互作頻次最高的30 個(gè)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并繪制圖形（圖3），可以發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素-6（IL-6）、胱天蛋白酶3（CASP3）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGFA）、表皮生長因子受體（EGFR）和絲裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）等關(guān)聯(lián)程度較高，說明黃芪-紫草藥對的中藥成分與其有較高的結(jié)合活性，可作為其治療糖尿病潰瘍的潛在靶點(diǎn)。

圖1 韋恩圖Fig 1 Venn diagram

表2 共同作用靶點(diǎn)Tab 2 Common targets

圖2 PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig 2 PPI network

2.4 藥物-化合物-作用靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

圖3 蛋白頻次條形圖Fig 3 Bar graph of target protein frequency

使用cytoscape 構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共110 個(gè)節(jié)點(diǎn)（疾病1 個(gè)，藥物2 個(gè)，核心活性成分26 個(gè)，靶點(diǎn)81 個(gè)）和319 條線。結(jié)果顯示，槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、異鼠李素（isorhamnetin）、刺芒柄花素（formononetin）、谷甾醇（sitosterol）、常春藤皂甙元（hederagenin）等化合物在整個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著重要的作用，見圖4。

2.5 GO 基因生物過程富集分析和KEGG 信號通路富集分析

GO 富集分析共得到100 條生物過程，選擇P 值最小的20 條生物過程繪制柱狀圖（圖5a），其中核受體活性（nuclear receptor activity）、轉(zhuǎn)錄因子活性，直接配體調(diào)節(jié)的序列特異性DNA 結(jié)合（transcription factor activity，direct ligand regulated sequence-specific DNA binding）、類固醇激素受體活性（steroid hormone receptor activity）、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性，RNA 聚合酶Ⅱ特異性（DNA-binding transcription activator activity，RNA polymerase Ⅱ-specific）、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合（ubiquitin-like protein ligase binding）等生物過程中靶點(diǎn)較為集中。

KEGG 富集分析共得到116 條信號通路，選擇P 值最小的20 條信號通路繪制氣泡圖（圖5b），靶基因主要集中在Prostate cancer、Kaposi sarcoma - associated herpesvirus infection、Fluid shear stress and atherosclerosis、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications 等信號通路。見圖6。

圖4 藥物-化合物-作用靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖Fig 4 Drug-ingredient-target-disease network

圖5 GO 功能（a）與KEGG 通路（b）分析Fig 5 Analysis of GO function（a）and KEGG pathway（b）

圖6 KEGG 通路分析圖（AGE-RAGE 通路）Fig 6 KEGG pathway analysis（AGE-RAGE signaling pathway）

3 討論

本次研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法構(gòu)建了藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，對黃芪-紫草藥對治療糖尿病潰瘍的作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測，共得到32 個(gè)主要活性成分，81 個(gè)共同作用靶點(diǎn)，100條生物過程和116 條信號通路。

在篩選出的黃芪-紫草藥對的32 個(gè)活性成分中，槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、異鼠李素（isorhamnetin）、刺芒柄花素（formononetin）、谷甾醇（sitosterol）、常春藤皂甙元（hederagenin）等化合物在藥物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起著重要的作用，提示黃芪-紫草藥對可能通過這些有效活性成分對糖尿病潰瘍起治療作用，而既往的藥理學(xué)研究也在一定程度上對結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。槲皮素能夠提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能、影響細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的分泌，從而起到抗炎的作用［18］。山柰酚能夠極大抑制肥大細(xì)胞炎癥反應(yīng)，通過抑制IKKβ 的活化和IκBα 的磷酸化阻止NF-κB（p65）進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)而影響相關(guān)炎癥介質(zhì)的釋放；山柰酚也可以通過上調(diào)骨骼肌PI3KAKT-GLUT4 信號通路改善胰島素抵抗，起到降低血糖的作用［19-21］。異鼠李素可以通過激活Nrf2/ARE 信號通路、影響線粒體凋亡通路起到抗氧化、抗凋亡功能［22］。刺芒柄花素可以通過促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的釋放來增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫功能，也可以調(diào)節(jié)體內(nèi)的血脂代謝，抑制脂肪沉積，對血管病變起到預(yù)防和治療的作用［23，24］。谷甾醇和常春藤皂甙元也有明顯的抗菌抗炎作用，對金黃色葡萄球菌有很強(qiáng)的抑制作用，谷甾醇同時(shí)有較好的抗氧化作用［25，26］。未來的研究不僅可以聚焦在以上活性成分，對于網(wǎng)絡(luò)中其他的化合物如毛蕊異黃酮（calycosin）、華良姜素（Jaranol）等同樣是藥物的潛在作用成分，值得進(jìn)一步挖掘其藥理學(xué)作用。

在篩選出的黃芪-紫草藥對的81 個(gè)共同作用靶點(diǎn)中，作用較多的關(guān)鍵靶點(diǎn)有白細(xì)胞介素-6（IL-6）、胱天蛋白酶3（CASP3）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGFA）、表皮生長因子受體（EGFR）、絲裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）、雌激素受體1（ESR1）、細(xì)胞周期蛋白D1（CCND1）、ERBB2 等，主要以細(xì)胞因子、蛋白激酶等為主。靶點(diǎn)的作用主要集中在抑制炎癥反應(yīng)、抗細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管生成、免疫調(diào)節(jié)等，推測其可能是黃芪-紫草藥對發(fā)揮治療作用的主要途徑。白細(xì)胞介素-6（IL-6）是炎癥反應(yīng)的主要介質(zhì)之一，同時(shí)也與內(nèi)分泌關(guān)系密切，主要由單核-巨噬細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞和纖維母細(xì)胞合成，既往研究已經(jīng)證明其與糖尿病并發(fā)癥之間的密切關(guān)系［27］。血管內(nèi)皮生長因子（VEGFA）是PDGF/VEGF 生長因子家族的成員，在血管生成、血管發(fā)生和內(nèi)皮細(xì)胞生長中都發(fā)揮著重要的作用，可以通過ERK、PI3K/Akt 通路誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞遷移、抑制凋亡等［28，29］。團(tuán)隊(duì)前期的研究表明糖尿病潰瘍患者伴隨著血管內(nèi)皮生長因子的明顯降低，而黃芪-紫草藥對則可以通過增加血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)促進(jìn)糖尿病潰瘍的愈合。胱天蛋白酶3（CASP3）是細(xì)胞凋亡過程中最重要的終末裂解酶，也是重要的凋亡相關(guān)基因，同時(shí)參與炎癥信號通路［30］。表皮生長因子受體（EGFR）、ERBB2 均是表皮生長因子受體（HER）家族成員之一，對細(xì)胞的生長、增殖和分化等生理過程發(fā)揮重要的作用［31］。絲裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）又稱JNK1/SAPK1基因，功能涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等，不僅可以誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C 而啟動(dòng)死亡信號途徑和細(xì)胞凋亡，也可以參與TNFα 抑制脂肪細(xì)胞分化［32］。

通過GO 富集和KEGG 富集篩選出的黃芪-紫草藥對的100 條生物過程和116 條信號通路中，生物過程主要以核受體）、轉(zhuǎn)錄因子活性，直接配體調(diào)節(jié)的序列特異性DNA 結(jié)合、類固醇激素受體活性、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性，RNA 聚合酶Ⅱ特異性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合等為主。在靶點(diǎn)富集的前幾條通路中，基因數(shù)目主要集中在Prostate cancer、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Fluid shear stress and atherosclerosis、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、TNF signaling pathway 等信號通路。晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）/晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）信號通路在參與氧化應(yīng)激和過度炎癥反應(yīng)中起著重要作用，可以激活NADPH 氧化酶、蛋白激酶C 和MAPK 等多種信號，促進(jìn)多種動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因（RAGE、VCAM-1、VEGF）的表達(dá)。RAGE 與AGEs 結(jié)合后RAGE 活化，NF-κB mRNA 基因上調(diào)，NF-κBp65 有較強(qiáng)的促炎特性，可以導(dǎo)致IL-1、IL-6 和TNF-α 等多種炎癥介質(zhì)的釋放［33］。既往研究已經(jīng)證明AGEs-RAGE 信號通路在多種糖尿病并發(fā)癥中的重要作用，黃芪桂枝五物湯通過阻斷AGEs/RAGE/NF-κB 信號通路中組織細(xì)胞表面RAGE 的表達(dá)延緩糖尿病周圍神經(jīng)病變進(jìn)程；以黃芪為主藥的各類中藥復(fù)方可以通過調(diào)節(jié)AGEs-RAGE 介導(dǎo)的氧化應(yīng)激過程、降低AGEs 及RAGE的表達(dá)水平以起到防治糖尿病腎病的作用［34-37］。

本次研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對黃芪-紫草藥對治療糖尿病潰瘍的作用機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測，初步闡釋了其潛在的作用成分、作用靶點(diǎn)、關(guān)鍵生物學(xué)過程和關(guān)鍵通路，為未來進(jìn)一步的研究提供參考。