尤思涵， 都 帥， 周忠義， 格根圖， 宛 濤， 賈玉山*

(1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019； 2. 浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院， 飼料科學(xué)研究所， 浙江 杭州，310058； 3. 內(nèi)蒙古牙克石市草原站, 內(nèi)蒙古 牙克石 022150)

高丹草(Sorghumbicolor×Sorghumsudanense)為一年生禾本科牧草，雜種優(yōu)勢突出，分蘗能力強，適應(yīng)性強，產(chǎn)量高且具有良好的適口性和飼用價值[1]。目前，刈割后直接飼喂是高丹草的主要利用方式，但直接飼喂飼用周期短，易造成大量浪費，而調(diào)制青貯能有效保存其營養(yǎng)物質(zhì)并延長使用時間[2]。黑麥草(LoliumperenneL.)為一年生或多年生禾本科牧草，生長快、分蘗多，飼用價值高，各種家畜均喜采食[3]。黑麥草產(chǎn)量較高，在滿足家畜生產(chǎn)需求的同時仍有部分剩余可以利用。由于黑麥草本身特性和氣候條件等原因，調(diào)制青貯成為黑麥草的最佳利用方式之一[4]。但黑麥草刈割后水分含量較高(>80%)，直接青貯不易成功，采取萎蔫處理在降低水分含量的同時還會造成營養(yǎng)物質(zhì)大量流失，進而降低青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)。青貯利用乳酸菌在厭氧條件下發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，降低pH值，抑制不良微生物生長，使飼草中營養(yǎng)物質(zhì)得以保存，是飼草保存的重要方式。混合青貯可以綜合兩種或多種牧草的優(yōu)良特性，既能克服單獨青貯牧草的缺點，又能提高飼用價值，已作為改善飼草營養(yǎng)品質(zhì)和提高飼用價值的有效手段被廣泛應(yīng)用[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)苜蓿、花生秧及黑麥草等牧草本身特性(如蛋白質(zhì)含量高、附著乳酸菌數(shù)量少及發(fā)酵能力較弱等)會導(dǎo)致青貯難以成功[7]，蕎麥與全株玉米、花生秧與全株玉米混合青貯時，水分含量適中，可利用碳水化合物含量較高，為乳酸菌發(fā)酵提供了優(yōu)良底物，促進了發(fā)酵，提高了青貯發(fā)酵品質(zhì)[8-9]。此外，飼用大豆與全株玉米/高粱、苜蓿與玉米秸稈、多年生黑麥草與青稞秸稈混合青貯與單獨青貯相比，不僅改善了發(fā)酵品質(zhì)，還提高了營養(yǎng)品質(zhì)和飼用價值[5,10-11]。

目前，關(guān)于混合青貯已有諸多研究，但通過混合青貯解決高丹草單獨青貯蛋白質(zhì)含量較低和黑麥草單獨青貯水分含量較高的問題未見相關(guān)報道。本研究將高丹草與黑麥草進行混合青貯，分析混合比例對青貯飼料營養(yǎng)成分、發(fā)酵品質(zhì)、微生物數(shù)量和營養(yǎng)物質(zhì)體外消化率的影響，通過混合青貯篩選適宜比例，改善青貯發(fā)酵品質(zhì)，為高丹草和黑麥草混合青貯提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

高丹草(‘冀草一號’)和黑麥草(‘綠色精神’)來自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草試驗基地，高丹草收獲期為臘熟期，黑麥草為第5茬孕穗期。兩種青貯原料營養(yǎng)成分及微生物組成如表1所示。

表1 青貯原料營養(yǎng)成分和微生物數(shù)量

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，設(shè)置5個處理組，高丹草和黑麥草鮮物質(zhì)比例分別為10∶0，7∶3，5∶5，3∶7和0∶10(A，B，C，D，E)。高丹草和黑麥草切短至1～2 cm，按比例充分混合均勻后裝填至聚乙烯青貯袋，每袋150 g，用真空封口機密封，室溫下避光存放，每種處理5包。

1.3 測定指標(biāo)及方法

青貯60 d時開袋測定常規(guī)營養(yǎng)成分、發(fā)酵品質(zhì)、主要微生物數(shù)量和營養(yǎng)物質(zhì)體外發(fā)酵特性。

1.3.1常規(guī)營養(yǎng)成分測定 干物質(zhì)(Dry matter,DM)采用烘干法測定?？扇苄蕴妓衔?Water-soluble carbohydrates,WSC)采用蒽酮比色法測定[12]。粗蛋白質(zhì)(Crude protein,CP)使用FOSS Kjeltec8400全自動凱氏定氮儀測定。酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber,ADF)和中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber,NDF)使用Ankom 220型纖維分析系統(tǒng)進行測定[13]。

1.3.2發(fā)酵品質(zhì)測定 青貯樣品浸提液pH值使用酸度計測定。使用高效液相色譜測定乳酸(Lactic acid,LA)、乙酸(Acetic acid,AA)、丙酸(Propionic acid,PA)和丁酸(Butyric acid,BA)含量，并計算乳酸/乙酸(LA/AA)。氨態(tài)氮(Ammonia nitrogen,NH3-N)含量采用苯酚-次氯酸比色法測定[14]。

1.3.3微生物數(shù)量及多樣性測定 10 g青貯樣品和90 mL無菌水用勻質(zhì)拍打器拍打2 min，稀釋梯度分別為10-1，10-2，10-3，10-4和10-5，采用平板計數(shù)法計算微生物數(shù)量[15]。乳酸菌在乳酸菌固體(De Man,Rogosa and Sharpe，MRS)培養(yǎng)基30℃厭氧培養(yǎng)48 h計數(shù)；酵母菌和霉菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar，PDA)培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)72 h計數(shù)；大腸菌群在大腸菌群液體顯色(Blue Light Broth Agar，BLB)培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)48 h計數(shù)；一般好氧性細(xì)菌在營養(yǎng)瓊脂(Nutrient Agar，NA)培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)48 h計數(shù)。

1.3.4營養(yǎng)物質(zhì)體外消化率的測定 采用一級離體消化試驗法，人工瘤胃培養(yǎng)液的配制參照Tilley等的方法[16]。選取3只體重接近且安裝永久性瘤胃瘺管的內(nèi)蒙古半細(xì)毛羊成年羯羊，用于瘤胃內(nèi)容物的采集，基礎(chǔ)日糧精料和青干草分別為70%和30%，自由飲水，單籠飼養(yǎng)。使用ANKOM Daisy Incubator儀器進行體外消化試驗，干物質(zhì)體外消化率(Invitrodry matter digestibility,IVDMD)和中性洗滌纖維體外消化率(Invitroneutral detergent fiber digestibility,IVNDFD)計算公式如下[17]：

IVDMD%=[(M1—M2)/M1]×100

式中：M1為放入發(fā)酵玻璃罐培養(yǎng)底物的DM質(zhì)量；M2為發(fā)酵殘渣DM質(zhì)量；

IVNDFD(%)=[(NDF1×M1—NDF2×M2)/NDF1×M1]×100

式中：NDF1為發(fā)酵前樣品NDF含量；NDF2為發(fā)酵后殘渣中NDF含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)利用Excel 2007進行初步整理；利用SigmaPlot 12.5進行相關(guān)圖表的繪制；利用SAS 9.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，P<0.05作為差異顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高丹草與黑麥草混合青貯對營養(yǎng)品質(zhì)的影響

高丹草與黑麥草混合青貯對營養(yǎng)成分的影響如表2所示。本研究中，ADF和NDF含量在青貯60 d時均隨黑麥草比例的增加而呈下降趨勢;C，D，E組ADF含量顯著低于A和B組(P<0.05)；NDF含量同樣表現(xiàn)出下降趨勢，且各處理組間差異顯著(P<0.05)。青貯飼料中CP含量隨著黑麥草比例的增加呈上升趨勢，各處理組間差異顯著(P<0.05)。在混合青貯中，D組ADF和NDF含量顯著低于B和C組(P<0.05)，而CP含量顯著高于B和C組(P<0.05)。因此，從營養(yǎng)成分的角度考慮，D組在混合青貯中效果較好。

表2 高丹草與黑麥草混合比例青貯對常規(guī)營養(yǎng)成分的影響

2.2 高丹草與黑麥草混合青貯對發(fā)酵品質(zhì)的影響

高丹草與黑麥草混合青貯對發(fā)酵品質(zhì)的影響如表3所示。隨著黑麥草比例的增加，青貯飼料中DM含量顯著下降(P<0.05)。pH值是反應(yīng)青貯發(fā)酵品質(zhì)的一項關(guān)鍵指標(biāo)。青貯60 d時，高丹草和黑麥草單獨青貯pH值均為4.40，顯著高于混合青貯(P<0.05)；B，C，D組pH值無顯著差異?；旌锨噘A改變了單種牧草原料中乳酸菌的種類和數(shù)量，導(dǎo)致混合后青貯pH值顯著降低(P<0.05)。LA含量隨著黑麥草所占比例的增加呈上升趨勢，D組中LA含量達到最大值，顯著高于A,B,C組(P<0.05)，但與黑麥草單獨青貯相比差異不顯著；E組AA含量最低，C組含量最高，差異顯著(P<0.05)；E組LA/AA顯著高于其他各處理(P<0.05)，A組LA/AA最低；C和D組PA含量顯著高于其他處理(P<0.05)，但兩組間無顯著差異；A組NH3-N含量最高，E組最低，各處理差異顯著(P<0.05)。在混合青貯組合中，D組LA含量和LA/AA顯著高于B和C組(P<0.05)，而NH3-N含量顯著低于B和C組(P<0.05)，表明D組發(fā)酵效果較好，蛋白質(zhì)降解少。

表3 高丹草與黑麥草混合比例青貯對發(fā)酵品質(zhì)的影響

2.3 高丹草與黑麥草混合青貯對微生物數(shù)量的影響

高丹草與黑麥草混合青貯對微生物數(shù)量的影響如表4所示。青貯60 d時，B，C，D組乳酸菌數(shù)量顯著高于A和E組(P<0.05)，其中A組乳酸菌數(shù)量最少，顯著低于其他各組(P<0.05)。在酵母菌和一般好氧性細(xì)菌數(shù)量方面，A組數(shù)量顯著低于其他各處理(P<0.05)，B和D組酵母菌數(shù)量較高，E組一般好氧性細(xì)菌數(shù)量較高。大腸菌群和霉菌在青貯60 d時均未被檢測到。

表4 高丹草與黑麥草混合比例青貯對微生物數(shù)量的影響

2.4 高丹草與黑麥草混合青貯對體外發(fā)酵特性的影響

本研究中，隨著高丹草比例的減少和黑麥草比例的增加，混合青貯飼料IVDMD和IVNDFD呈上升趨勢。高丹草單獨青貯時IVDMD和IVNDFD最低，黑麥草單獨青貯時IVDMD和IVNDFD最高，A和E2組IVDMD和IVNDFD差異顯著(P<0.05)；B，C，D組混合青貯IVDMD和IVNDFD顯著高于高丹草單獨青貯(P<0.05)，顯著低于黑麥草單獨青貯(P<0.05)。在混合青貯組合中，D組IVDMD顯著高于B和C組(P<0.05)，但3組間IVNDFD無顯著差異。

圖1 高丹草與黑麥草混合青貯對體外發(fā)酵特性的影響

3 討論

3.1 高丹草與黑麥草混合青貯對營養(yǎng)品質(zhì)的影響

營養(yǎng)成分是反映飼草飼用價值的重要指標(biāo)。NDF是目前反映纖維質(zhì)量的最有效指標(biāo)，其含量是估測家畜日糧精粗比的重要評判標(biāo)準(zhǔn)；ADF是飼料能量的關(guān)鍵指示，其含量越低，青貯飼料飼用價值越高[18]。本研究中，隨著黑麥草所占比例的增加，CP含量呈上升趨勢，ADF和NDF含量呈下降趨勢?；旌锨噘A中，D組CP含量最高，ADF和NDF含量最低，表明D組營養(yǎng)品質(zhì)較好。混合青貯改變了營養(yǎng)物質(zhì)的比例可能是造成這一結(jié)果的主要原因[19]。如苜蓿和玉米秸稈混合青貯時隨著苜蓿添加水平的增加，CP含量呈上升趨勢，ADF和NDF含量呈下降趨勢[10]；將桑葉與玉米秸稈混合青貯后發(fā)現(xiàn)，混貯中桑葉比例的增加提高了CP含量，降低了ADF和NDF含量[20]?；旌锨噘A可以實現(xiàn)資源優(yōu)勢互補，使?fàn)I養(yǎng)更加均衡，改善青貯飼料營養(yǎng)品質(zhì)，也可作為改善高丹草與黑麥草青貯品質(zhì)的有效手段。本研究中，高丹草與黑麥草混合青貯3∶7條件下營養(yǎng)品質(zhì)最佳。

3.2 高丹草與黑麥草混合青貯對發(fā)酵品質(zhì)的影響

本研究中，與高丹草單獨青貯相比，混合青貯降低了青貯中干物質(zhì)含量，即提高了水分含量；與黑麥草單獨青貯相比，混合青貯提高了青貯中乳酸菌的數(shù)量。混合青貯改善了發(fā)酵條件，有利于厭氧發(fā)酵，提高了發(fā)酵品質(zhì)。青貯原料中水分含量和乳酸菌數(shù)量是青貯發(fā)酵成功的關(guān)鍵因素[21-22]。本研究中，青貯原料水分含量均低于80%，無需再進行萎蔫處理[23]。青貯后，各處理DM含量與原料相比均表現(xiàn)下降趨勢，WSC被乳酸菌分解是DM含量降低的主要原因。此外，酸類水解作用下半纖維素被分解也使得DM含量下降[24]。混合青貯pH值顯著低于高單草和黑麥草單獨青貯，LA，AA含量及LA/AA也隨著黑麥草所占比例的增加呈上升趨勢。一方面，混合青貯充足的乳酸菌數(shù)量和水分含量促進了發(fā)酵；另一方面，WSC是乳酸菌發(fā)酵的重要前體物質(zhì)，充分的WSC在同型發(fā)酵和異型發(fā)酵乳酸菌的共同作用下產(chǎn)生LA和AA，降低了pH[24]?；旌锨噘A中，D組LA含量和LA/AA較高，發(fā)酵品質(zhì)較好。NH3-N含量的高低反應(yīng)青貯飼料中氨基酸和蛋白質(zhì)的分解程度，數(shù)值越大表明越多氨基酸和蛋白質(zhì)被梭菌等腐敗菌分解為NH3-N，青貯飼料品質(zhì)變差[25]。A組與E組青貯60 d時pH值接近，但A組青貯原料中大腸菌群數(shù)量高于E組，梭菌等腐敗菌生命代謝活動可能是造成A組中NH3-N含量顯著高于E組的主要原因[15]。隨著黑麥草在混合青貯中所占比例增加，青貯原料中水分含量升高，乳酸菌的生命活動增強，pH值降低，梭菌等腐敗菌生命代謝活動被抑制[26-27]，NH3-N含量呈下降趨勢?；旌锨噘A中，D組NH3-N含量顯著低于其他兩組，表明CP降解較少，營養(yǎng)品質(zhì)保存較好。

3.3 高丹草與黑麥草混合青貯對微生物數(shù)量的影響

青貯原料中乳酸菌數(shù)量直接影響青貯品質(zhì)，乳酸菌的生命代謝活動是青貯發(fā)酵的關(guān)鍵因素[28-29]。研究結(jié)果表明，青貯原料中乳酸菌數(shù)量少于105cfu·g-1時青貯不易成功[30-31]。本研究中，高丹草與黑麥草原料中乳酸菌數(shù)量均小于105cfu·g-1，低于青貯飼料所要求最低乳酸菌數(shù)量?；旌锨噘A60 d時各處理乳酸菌數(shù)量均大于105cfu·g-1，且與pH值呈負(fù)相關(guān)，混合青貯使微生物的數(shù)量和種類發(fā)生改變可能是造成這一結(jié)果的主要原因[19]。大腸菌群和霉菌是評價青貯飼料品質(zhì)的重要指標(biāo)，其次級代謝產(chǎn)物會影響家畜和人體健康[32]。本研究中，青貯60 d時各處理組未檢測到霉菌和大腸菌群，這與前人研究結(jié)果一致，即青貯60 d時不存在大腸菌群和霉菌[33]。乳酸菌將WSC轉(zhuǎn)化成LA，使pH值下降，抑制大腸菌群和霉菌的生命代謝活動[34-35]和AA抑制霉菌的產(chǎn)生[36]可能是造成這一結(jié)果的主要原因。

3.4 高丹草與黑麥草混合青貯對體外發(fā)酵特性的影響

飼草中各營養(yǎng)物質(zhì)含量只代表其本身的特性，不能代表飼草在動物體內(nèi)的消化吸收利用情況[37]。IVDMD大小反應(yīng)了飼料的消化難易程度。本研究中，青貯60 d時，IVDMD和IVNDFD隨著黑麥草比例的增加而呈上升趨勢。混合青貯中，D組IVDMD顯著高于其他兩組，在混合青貯中干物質(zhì)利用率較高。不同青貯原料的自身特性可能使IVDMD和IVNDFD出現(xiàn)差異；青貯過程中微生物和酸類物質(zhì)的水解作用破壞了纖維結(jié)構(gòu)，將纖維類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可消化利用的營養(yǎng)物質(zhì)，提高了干物質(zhì)和纖維類物質(zhì)的利用率，使IVDMD和IVNDFD升高[23]。

4 結(jié)論

與單獨青貯相比，高丹草與黑麥草混合青貯能增加乳酸菌數(shù)量，降低pH值；與高丹草單獨青貯相比，混合青貯降低了氨態(tài)氮含量，與黑麥草單獨青貯相比，混合青貯降低了乙酸含量，有效改善了發(fā)酵品質(zhì)，更有利于青貯飼料營養(yǎng)物質(zhì)的保存?；旌锨噘A高丹草和黑麥草比例為3∶7時青貯效果和飼用價值較優(yōu)。