徐洪雨， 甄莉麗， 李鈺瑩， 董寬虎， 李向林

(1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院， 山西 太谷 030801；2. 對(duì)外經(jīng)濟(jì)貿(mào)易大學(xué)外語(yǔ)學(xué)院， 北京 100029；3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所， 北京100193)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.，以下簡(jiǎn)稱(chēng)苜蓿)是一種蛋白含量豐富的優(yōu)質(zhì)飼草，其在我國(guó)的種植面積不斷擴(kuò)大，且主要集中在內(nèi)蒙古、甘肅和新疆等北方地區(qū)[1]。我國(guó)北方冬季寒冷少雪，因此苜蓿越冬失敗、不能正常返青時(shí)有發(fā)生，給生產(chǎn)上造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在管理措施中，有研究表明澆灌越冬水可提高苜蓿的越冬能力[2]。秋冬季節(jié)，氣溫和地面溫度不斷下降，并一直向地下傳遞。當(dāng)氣溫下降至凍結(jié)溫度后，地下土壤剖面就會(huì)形成深度逐漸增加的凍土層。在形成的凍土層中，上層土壤剖面(約20～40 cm)的溫度與地面溫度具有很好的相關(guān)性，但因溫度波向地下傳遞需要一定的時(shí)間，上層土壤剖面的溫度與地面溫度相比仍存在很大的滯后性[3]。另外，土壤凍結(jié)后，土壤孔隙被冰完全充填，凍土層可阻隔大氣與土壤空氣的熱交換[3]。因此，在苜蓿整個(gè)越冬過(guò)程中，土壤凍土層能夠緩解低溫和溫度劇烈變化對(duì)根頸和根系的傷害[4-5]。但北方地區(qū)(如內(nèi)蒙古阿魯科爾沁旗和甘肅等地)多為沙性土，沙性土保水能力差，澆灌越冬水時(shí)水分快速下滲，加上蒸發(fā)和空氣循環(huán)等因素導(dǎo)致表層土壤水分丟失嚴(yán)重，使越冬期間表土層內(nèi)水分含量低，難以形成凍土層。此種情況下，越冬水并不能對(duì)苜蓿根頸和根系起到很好的保護(hù)作用。2019年2月，對(duì)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院國(guó)際農(nóng)業(yè)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園(河北，廊坊)內(nèi)‘WL440HQ’苜蓿的越冬情況調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)月平均氣溫-6℃，0～10 cm表土層范圍內(nèi)的土壤(沙質(zhì)土)含水量?jī)H約田間持水量的20%～30%，土壤松散，苜蓿根頸失水嚴(yán)重，存在萎縮現(xiàn)象(圖1-A)，經(jīng)多樣點(diǎn)測(cè)定，根頸組織細(xì)胞液相對(duì)滲透率達(dá)到81.7%～89.6%。2019年4月，再次對(duì)產(chǎn)業(yè)園內(nèi)的苜蓿進(jìn)行調(diào)查，當(dāng)月平均氣溫已達(dá)8℃，苜蓿返青率不足10%，原2月份調(diào)查時(shí)失水萎縮的根頸絕大部分已發(fā)生霉變(圖1-B)。冬季寒冷和土壤干旱共同組成低溫干旱環(huán)境，此種不利的環(huán)境條件可能是導(dǎo)致苜蓿無(wú)法順利越冬的原因之一。

圖1 紫花苜蓿越冬期間根頸萎蔫及返青期根頸霉變的情況

在低溫脅迫下，植物細(xì)胞膜發(fā)生龜裂，透性增大，當(dāng)細(xì)胞液相對(duì)滲透率達(dá)到50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的溫度稱(chēng)為低溫半致死溫度(LT50)，常用來(lái)衡量植物的耐寒性[6-8]。根頸靠近地表，是苜蓿返青時(shí)新枝條的生長(zhǎng)點(diǎn)，因此根頸也被認(rèn)為是苜蓿最重要的越冬組織[9]，常用根頸的LT50來(lái)衡量苜蓿的耐寒性。有研究認(rèn)為，脯氨酸不僅可防止細(xì)胞膜脫水，而且具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用，是影響苜?？购缘闹饕被醄10]。在低溫脅迫初期，苜蓿通過(guò)冷適應(yīng)積累物質(zhì)以提高自身的抗寒能力，其中可溶性糖是對(duì)低溫條件反應(yīng)較為敏感的物質(zhì)[11]?？扇苄蕴遣粌H具有滲透調(diào)節(jié)的作用，還具有冷凍保護(hù)的作用[12-13]。此外，苜蓿的耐寒性還與冷適應(yīng)期間低溫誘導(dǎo)可溶性蛋白的積累有關(guān)，如脫水蛋白和營(yíng)養(yǎng)貯藏蛋白[14]?？扇苄缘鞍卓膳c細(xì)胞成分形成氫鍵從而結(jié)合水分，發(fā)揮冷凍保護(hù)劑的作用[10,15]。有研究表明，K-3脫水蛋白的轉(zhuǎn)錄水平在冷適應(yīng)過(guò)程中顯著提高，并且在苜?？购缘妮喕剡x擇性育種中，該基因在苜蓿群體中正等位基因的頻率也會(huì)增加[14]。低溫導(dǎo)致細(xì)胞脫水時(shí)，K3脫水蛋白在維持細(xì)胞膜的完整性中發(fā)揮著重要作用[16-17]，與苜蓿的耐寒性息息相關(guān)[18]。

為研究冬季冷凍期土壤干旱對(duì)苜蓿越冬的影響，本研究在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)通過(guò)培養(yǎng)箱控溫和更換表土試驗(yàn)，模擬苜蓿越冬過(guò)程中的低溫干旱環(huán)境，借助根頸組織細(xì)胞膜透性、低溫半致死溫度、細(xì)胞活力和丙二醛等指標(biāo)，分析低溫干旱環(huán)境對(duì)不同秋眠級(jí)苜蓿根頸耐寒性的影響，并通過(guò)根頸組織含水量、脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白等脅迫抗逆標(biāo)志物含量，分析低溫干旱環(huán)境對(duì)苜蓿耐寒性影響的原因。本研究結(jié)果將為研究如何通過(guò)管理措施提高苜蓿越冬能力提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選擇的苜蓿品種為‘WL440HQ’(秋眠級(jí)6.0，WL)和‘肇東’(秋眠級(jí)2.0，ZD)，ZD種子購(gòu)買(mǎi)于甘肅大業(yè)牧草科技有限責(zé)任公司，WL苜蓿種子購(gòu)買(mǎi)于北京正道生態(tài)科技有限公司。試驗(yàn)共涉及3個(gè)處理階段，2種水分處理，4次生物學(xué)重復(fù)。

試驗(yàn)所用的苜蓿苗在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院國(guó)際農(nóng)業(yè)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園區(qū)進(jìn)行培育，園區(qū)位于河北省廊坊市萬(wàn)莊鎮(zhèn)，占地約1 330 ha，全年光照充足，年平均氣溫11.9℃，年平均降水量為554.9 mm，土壤為沙質(zhì)土，田間持水量為0.203 3 g·g-1(水/干土)。2018年5月育苗，2019年5月在培育好的材料中選取根系大小相近的2個(gè)品種苜蓿苗，而后移栽到預(yù)先準(zhǔn)備好的PVC管(直徑10 cm，高度15 cm)內(nèi)，管內(nèi)填充育苗田里的沙質(zhì)土壤。將移栽好的苜蓿苗帶回培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行為期1個(gè)月的恢復(fù)生長(zhǎng)，PVC管內(nèi)的土壤含水量通過(guò)稱(chēng)重法維持在田間持水量的75%。進(jìn)行恢復(fù)生長(zhǎng)期間，培養(yǎng)室內(nèi)的其它條件設(shè)置為：溫度(24±2)/(20±2)℃(晝/夜)，光照時(shí)長(zhǎng)12 h，光照強(qiáng)度600～800 μmol·m-2·s-1。

1.2 試驗(yàn)處理及取樣

本研究的試驗(yàn)處理過(guò)程如圖2所示，具體處理細(xì)節(jié)如下所述：

(1)適應(yīng)性生長(zhǎng)。苜蓿苗在培養(yǎng)室恢復(fù)生長(zhǎng)1個(gè)月后，將苗轉(zhuǎn)移到低溫光照培養(yǎng)箱(LRH-200-GD，THK Ltd.，廣東)內(nèi)進(jìn)行適應(yīng)性生長(zhǎng)1周。培養(yǎng)箱內(nèi)的條件控制：24/20℃(晝/夜)、光照12 h和光照強(qiáng)度400 μmol·m-2·s-1。

(2)冷適應(yīng)處理(階段1)。適應(yīng)性生長(zhǎng)1周結(jié)束后，降低培養(yǎng)箱溫度對(duì)苜蓿苗進(jìn)行冷適應(yīng)處理。將培養(yǎng)箱溫度設(shè)置從24/20℃(晝/夜)降低到4/0℃(晝/夜)，光照條件不變，冷適應(yīng)處理1周。此處理階段不涉及控水處理，土壤含水量保持75%田間持水量。冷適應(yīng)處理結(jié)束后，剪掉所有苜蓿地上部，烘干稱(chēng)重測(cè)定含水量和地上部干重。每個(gè)品種隨機(jī)選取4管(Sampling 1，S1)，剪掉地上部，烘干稱(chēng)重測(cè)定含水量及干重；將地下部洗凈吸干，稱(chēng)取濕重，然后將根頸和根系分開(kāi)，根系烘干并計(jì)算地下部含水量，根據(jù)含水量及地下部總鮮重，計(jì)算地下部總干重；根頸部位用于測(cè)定冷適應(yīng)處理后苜蓿根頸的細(xì)胞液相對(duì)滲透率、LT50和細(xì)胞活力的大小以及丙二醛、脯氨酸、總可溶性糖和總可溶性蛋白的含量。此階段2個(gè)品種的試驗(yàn)處理樣品分別標(biāo)記為WL-1-B和ZD-1-B。

(3)剪掉地上部和更換表層土壤。在冷凍處理之前，剪掉地上部，模擬苜蓿越冬期地上部枯黃。將階段1取樣后每個(gè)品種剩余的樣品分別隨機(jī)分成2份，其中1份用烘干的陶粒(直徑1 mm)替換表層5 cm范圍內(nèi)的表土，模擬越冬期土壤干旱條件，另外1份保持原土壤及75%田間持水量的含水量不變。

(4)冷凍處理(階段2和階段3)。剪掉地上部和更換表層土壤后，關(guān)閉培養(yǎng)箱光照(地上部已剪掉，光合作用停止)，將培養(yǎng)箱溫度設(shè)置從4/0℃(晝/夜)降低到-2℃(夜)，對(duì)苜蓿進(jìn)行冷凍處理，以模擬北方苜蓿越冬。在冷凍處理5天后(Sampling 2，S2)和7天后(Sampling 3，S3)分別取樣一次，地下部樣品的處理參考冷適應(yīng)階段取樣。在階段2和階段3處理后，未更換表層土壤的2個(gè)苜蓿品種樣品冷凍處理后分別標(biāo)記為WL-2-B，WL-3-B，ZD-2-B和ZD-3-B，而更換表層土壤的2個(gè)苜蓿品種樣品冷凍處理后分別標(biāo)記為WL-2-K，WL-3-K，ZD-2-K和ZD-3-K。

圖2 試驗(yàn)過(guò)程示意圖

1.3 試驗(yàn)指標(biāo)的測(cè)定

(1)細(xì)胞液相對(duì)滲透率和LT50的測(cè)定

本研究采用細(xì)胞液相對(duì)滲透率和LT50作為判斷各處理間根頸耐寒性的主要依據(jù)。受低溫脅迫，細(xì)胞膜受到破壞，細(xì)胞液滲透增加，通過(guò)組織細(xì)胞電導(dǎo)率計(jì)算細(xì)胞液相對(duì)滲透率。具體計(jì)算公式如下：

相對(duì)滲透率(%)=(EL1-EL)/(EL2-EL)×100

(1)

式(1)中EL1為試驗(yàn)處理后根頸樣品的電導(dǎo)率；EL2為經(jīng)高壓滅菌鍋蒸煮后根頸樣品的電導(dǎo)率，代表細(xì)胞完全破裂、細(xì)胞液完全滲出式樣品的電導(dǎo)率；EL為浸泡根頸樣品所用蒸餾水的電導(dǎo)率。

LT50的測(cè)定原理是對(duì)樣品進(jìn)行不同溫度的冷凍，并測(cè)定每一冷凍溫度下的細(xì)胞液相對(duì)滲透率，再根據(jù)Logistic方程計(jì)算出細(xì)胞液相對(duì)滲透率為50%所對(duì)應(yīng)溫度即為L(zhǎng)T50。試驗(yàn)處理后，苜蓿根頸組織LT50的測(cè)定及計(jì)算方法參考徐洪雨[19-20]的方法。本研究測(cè)定根頸組織LT50時(shí)，對(duì)樣品進(jìn)行冷凍的溫度設(shè)置9個(gè)梯度，分別為-2℃，-4℃，-6℃，-8℃，-10℃，-12℃，-14℃，-16℃和-18℃。

(2)細(xì)胞活力的測(cè)定

根頸細(xì)胞活力的測(cè)定參考王學(xué)奎[21]測(cè)定植物根系細(xì)胞活性的方法。

(3)丙二醛、脯氨酸、總可溶性糖和總可溶性蛋白的測(cè)定

參考Catola[22]和Nemat[23]的方法提取樣品，參考Draper[24]，Troll[25]，Yemm[26]和Sedmak[27]的方法分別對(duì)丙二醛、脯氨酸、總可溶性糖和總可溶性蛋白的含量進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用最小顯著差數(shù)法(LSD)，對(duì)試驗(yàn)各階段間指標(biāo)變化的差異顯著性以及同一階段處理間比較的差異顯著性進(jìn)行分析，差異顯著標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

根據(jù)根頸組織的LT50、細(xì)胞液相對(duì)滲透率、細(xì)胞活力、含水量、干物質(zhì)量以及丙二醛、脯氨酸、總可溶性糖和總可溶性蛋白的含量，采用隸屬函數(shù)法對(duì)2個(gè)品種苜蓿在整個(gè)試驗(yàn)期間的表現(xiàn)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫干旱環(huán)境對(duì)苜蓿耐寒性的影響分析

2.1.1細(xì)胞液相對(duì)滲透率和低溫半致死溫度大小 圖3-A為試驗(yàn)期間苜蓿根頸細(xì)胞液相對(duì)滲透率的變化情況，其大小可表征細(xì)胞膜的透性。除WL-K外，WL-B，ZD-B和ZD-K樣本的根頸在試驗(yàn)期間細(xì)胞液相對(duì)滲透率無(wú)顯著性變化。經(jīng)過(guò)階段2的冷凍，WL-K樣本的根頸細(xì)胞液相對(duì)滲透率明顯提高，其值達(dá)到62.26%；經(jīng)過(guò)階段3的冷凍，其值達(dá)到66.99%。據(jù)此判斷，低溫干旱環(huán)境對(duì)WL苜蓿根頸的影響極其顯著，導(dǎo)致細(xì)胞液相對(duì)滲透率超過(guò)50%，即意味著細(xì)胞死亡，但此環(huán)境對(duì)ZD苜蓿根頸的影響并不顯著。

圖3 試驗(yàn)期間根頸細(xì)胞膜透性和低溫半致死溫度

圖3-B為試驗(yàn)期間WL-B，ZD-B和ZD-K樣本根頸的LT50的變化。經(jīng)過(guò)階段2的冷凍，ZD-B和ZD-K中根頸的LT50均有明顯降低。經(jīng)過(guò)階段3的冷凍后，ZD-K和ZD-B中根頸的LT50顯著低于WL-B中根頸的(P<0.05)，但在ZD-K和ZD-B樣本間根頸LT50的大小并無(wú)顯著性差異。對(duì)于WL苜蓿而言，冷凍處理已使WL-K中的根頸致死，其LT50大小遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于WL-B中根頸的LT50大小。綜上，本研究中更換表土后的土壤干旱嚴(yán)重影響了WL苜蓿在零下低溫環(huán)境中的耐寒性，但對(duì)ZD苜蓿并無(wú)顯著性影響。

2.1.2細(xì)胞活力大小 圖4為試驗(yàn)期間苜蓿根頸細(xì)胞活力的變化情況。冷適應(yīng)結(jié)束后，ZD-B中根頸的細(xì)胞活力顯著高于WL-B中根頸的(P<0.05)。而經(jīng)過(guò)階段2和階段3的冷凍，4個(gè)樣本中根頸的細(xì)胞活力均有所下降。在取樣點(diǎn)S2和S3，根頸細(xì)胞活力的大小在樣本間的比較為：ZD-B>ZD-K>WL-B> WL-K(P<0.05)。由此可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)冷適應(yīng)和冷凍處理后，ZD苜蓿根頸的細(xì)胞活力大于WL苜蓿的，不控水處理的根頸細(xì)胞活力大于控水處理的。

圖4 試驗(yàn)期間苜蓿根頸細(xì)胞活力

2.1.3丙二醛含量 圖5為試驗(yàn)期間苜蓿根頸細(xì)胞內(nèi)丙二醛的含量變化。由圖可知，經(jīng)過(guò)冷適應(yīng)處理后，WL-B根頸中的丙二醛含量顯著高于ZD-B根頸中的(P<0.05)。經(jīng)過(guò)冷凍后，4個(gè)樣本根頸中的丙二醛含量均有所增加，其中WL-K根頸中的丙二醛含量在階段2增加最明顯。經(jīng)過(guò)冷凍后，在取樣點(diǎn)S2和S3，WL-B和WL-K根頸中的丙二醛含量仍高于ZD-B和ZD-K根頸中的；WL-K根頸中的丙二醛含量顯著高于WL-B根頸中的(P<0.05)；對(duì)于ZD苜蓿，根頸中的丙二醛含量在ZD-B和ZD-K樣本間并無(wú)顯著性差異。根據(jù)試驗(yàn)樣本根頸內(nèi)的丙二醛含量變化判斷，低溫干旱環(huán)境對(duì)WL苜蓿的影響較大，而對(duì)ZD苜蓿影響不明顯。

圖5 試驗(yàn)期間苜蓿根頸丙二醛含量

2.2 低溫干旱環(huán)境對(duì)苜蓿耐寒性影響的原因分析

2.2.1地上部和地下部干物質(zhì)量 圖6為試驗(yàn)期間苜蓿單株的地上部和地下部干物質(zhì)量，目的是為評(píng)估試驗(yàn)期間苜蓿生長(zhǎng)可能對(duì)根頸耐寒性的影響。在本研究中，冷適應(yīng)處理結(jié)束后剪掉所有苜蓿的地上部并測(cè)定其干物質(zhì)量，WL-B和ZD-B樣本地上部干物質(zhì)量分別為0.51 g·株-1和0.57 g·株-1，且平均單株地上部干物質(zhì)量在2個(gè)樣本間并無(wú)顯著性差異(圖6-A)。從圖6-B中還可看出，4個(gè)樣本中苜蓿地下部干物質(zhì)量在同一取樣點(diǎn)均無(wú)顯著性差異。

圖6 試驗(yàn)期間苜蓿單株地上部和地下部干物質(zhì)量

2.2.2組織含水量 冷凍試驗(yàn)結(jié)束后，WL-K中的根頸出現(xiàn)萎縮，而其它3個(gè)處理中的根頸無(wú)萎縮表現(xiàn)。圖7為試驗(yàn)期間地上部和地下部組織(根頸和根系)含水量的變化情況。由圖7-A可知，冷適應(yīng)結(jié)束后，WL地上部的含水量為74.38%，ZD苜蓿的為71.25%，2個(gè)品種苜蓿地上部組織含水量與土壤含水量相近。由圖7-B可知，在更換表層土壤進(jìn)行凍干處理之前，2個(gè)品種苜蓿地下部含水量基本保持在75%左右；經(jīng)過(guò)階段2冷凍處理后，WL-B和ZD-B中地下部組織含水量無(wú)明顯變化，而WL-K和ZD-K中的均顯著降低。在階段2和階段3期間，WL-K中根系的失水速率分別為3.48 %·d-1和5.0 %·d-1，2個(gè)階段的平均失水速率為3.91 %·d-1；而ZD-K中根系失水速率分別為1.52 %·d-1和2.5 %·d-1，2個(gè)階段的平均失水速率為1.80 %·d-1。因此，WL-K中根系失水速率較ZD-K中的快。

圖7 試驗(yàn)期間苜蓿地上部和地下部的含水量

2.2.3脯氨酸、總可溶性糖和總可溶性蛋白的含量 圖8為試驗(yàn)期間根頸細(xì)胞內(nèi)脯氨酸、總可溶性糖和可溶性蛋白含量的變化情況。與S1處樣本根頸內(nèi)的脯氨酸含量相比，經(jīng)過(guò)階段2和3的冷凍，4個(gè)樣本根頸中的脯氨酸含量均明顯下降。在取樣點(diǎn)S2和S3處，ZD-B和ZD-K根頸中的脯氨酸含量顯著高于WL-B和WL-K樣本根頸中的(P<0.05)。在S2點(diǎn)，對(duì)于WL苜蓿來(lái)說(shuō)，WL-K樣本根頸中的脯氨酸含量顯著高于WL-B樣本根頸中的(P<0.05)；但對(duì)于ZD苜蓿來(lái)說(shuō)，根頸內(nèi)的脯氨酸含量在ZD-B和ZD-K樣本間卻無(wú)顯著性差異(圖8-A)。在S3點(diǎn)，對(duì)于同一品種苜蓿，根頸內(nèi)的脯氨酸含量在控水與不控水處理下的樣本間(WL-K和WL-B；ZD-K和ZD-B)均無(wú)顯著性差異(圖8-A)。從可溶性糖的含量來(lái)看(圖8-B)，在同一取樣點(diǎn)，ZD-B樣本根頸中的可溶性糖含量顯著高于WL-B樣本根頸中的(P<0.05)，ZD-K中的顯著高于WL-K中的(P<0.05)。對(duì)于ZD苜蓿而言，根頸中的可溶性糖含量在ZD-B和ZD-K樣本間無(wú)顯著性差異；而對(duì)于WL苜蓿，WL-B樣本根頸中的可溶性糖含量顯著高于WL-K樣本根頸中的(P<0.05)(圖8-B)。對(duì)于根頸細(xì)胞內(nèi)的可溶性蛋白含量，在S2點(diǎn)處，ZD-B中的顯著高于WL-B中的(P<0.05)；在S3點(diǎn)處，ZD-B中的顯著高于WL-B中的(P<0.05)，ZD-K中的的顯著高于WL-K中的(P<0.05)。對(duì)于同一品種苜蓿，根頸中可溶性蛋白含量在ZD-B和ZD-K樣本間無(wú)顯著性差異，在WL-B和WL-K樣本間也無(wú)顯著性差異(圖8-C)。

圖8 試驗(yàn)期間苜蓿根頸組織中脯氨酸、總可溶性糖和總可溶性蛋白含量

2.3 綜合評(píng)價(jià)

采用隸屬函數(shù)法對(duì)2個(gè)品種苜蓿在整個(gè)試驗(yàn)期間的表現(xiàn)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)多指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，排名前5位的全部為ZD苜蓿，而排名后5位的全部為WL苜蓿。在整個(gè)低溫干旱試驗(yàn)中，ZD苜蓿的表現(xiàn)完全優(yōu)于WL苜蓿，這與單純根據(jù)LT50和細(xì)胞液相對(duì)滲透率等指標(biāo)所比較的結(jié)果相一致。

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，WL苜蓿受低溫干旱環(huán)境的影響遠(yuǎn)大于ZD苜蓿，試驗(yàn)中更換表土使土壤干旱的處理嚴(yán)重影響了WL苜蓿應(yīng)對(duì)低溫冷凍的能力，本研究結(jié)果與過(guò)去的研究結(jié)果保持一致。針對(duì)冬季土壤干旱可能對(duì)苜蓿越冬造成不良的影響，生產(chǎn)者常通過(guò)澆灌越冬水來(lái)提高苜蓿的抗寒越冬能力[2]，其原因是土壤凍土層能夠緩解溫度劇烈變化對(duì)根頸和根系的傷害[4-5]。土壤剖面的溫度滯后于空氣的溫度，且土壤凍結(jié)后孔隙被冰完全填充，凍土層阻隔了大氣與土壤空氣的熱交換[3]。但即使秋末冬初已澆灌越冬水，因某些因素的影響(如澆灌越冬水的時(shí)節(jié)過(guò)早、灌水時(shí)土壤(沙質(zhì)土)滲水過(guò)快或土壤蒸發(fā)，等等)，導(dǎo)致越冬期間地表含水量過(guò)低，不能形成凍土層，從而影響苜蓿根頸應(yīng)對(duì)低溫冷凍的能力。因此，根據(jù)本研究結(jié)果，建議越冬期間對(duì)地表土壤水分狀況進(jìn)行監(jiān)測(cè)，適時(shí)補(bǔ)充土壤水分可提高苜蓿的越冬能力。這與Wu等對(duì)冬季高土壤含水量利于苜蓿越冬的研究結(jié)論一致[28]。

表1 隸屬函數(shù)法對(duì)2個(gè)品種苜蓿的綜合評(píng)價(jià)

研究表明，植物受到干旱或者低溫脅迫時(shí)，都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧的增加[11,29]。細(xì)胞膜系統(tǒng)在受到氧化傷害后產(chǎn)生丙二醛，其含量可表征細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的程度，也常用來(lái)表征細(xì)胞膜受破壞的程度[30]。在本研究中，經(jīng)過(guò)低溫冷凍處理后，WL根頸中的丙二醛含量明顯高于ZD苜蓿中的。此外，對(duì)于WL苜蓿而言，低溫干旱環(huán)境下根頸中的丙二醛含量顯著高于低溫環(huán)境下的，對(duì)于ZD苜蓿而言，低溫干旱環(huán)境下根頸細(xì)胞內(nèi)的丙二醛含量與低溫環(huán)境下的無(wú)顯著性差異。本研究中樣本根頸細(xì)胞內(nèi)丙二醛含量的對(duì)比結(jié)果與耐寒性的對(duì)比結(jié)果相一致，且符合丙二醛可表征細(xì)胞膜受破壞程度的理論。因此，本研究中丙二醛含量的對(duì)比結(jié)果可佐證耐寒性的對(duì)比結(jié)果。

在本研究中，調(diào)查了試驗(yàn)期間苜蓿地上部和地下部干物質(zhì)量的變化。冷適應(yīng)結(jié)束后，地上部干物質(zhì)量在2個(gè)苜蓿品種間并無(wú)顯著性差異。冷凍處理前，剪掉所有樣本的地上部，以模擬越冬期間苜蓿地上部枯黃。結(jié)果顯示，同一取樣點(diǎn)地下部干物質(zhì)量在各樣本間也沒(méi)有顯著性差異，可能是由于試驗(yàn)前所選的苜蓿樣本根系大小相近且冷凍處理期間地上部被剪掉后無(wú)新的物質(zhì)積累。根據(jù)各樣本間地上部和地下部干物質(zhì)量的差異性分析，推斷本研究中各樣本間根頸耐寒性的差異以及WL苜蓿根頸在經(jīng)過(guò)低溫干旱環(huán)境處理后死亡的原因，并不是因試驗(yàn)期間苜蓿的生長(zhǎng)而造成的。從本研究中苜蓿根頸含水量的變化來(lái)看，WL-B和ZD-B根頸含水量在試驗(yàn)期間未發(fā)生顯著性變化，而WL-K和ZD-K根頸含水量在試驗(yàn)期間均存在顯著性降低，只是WL-K根頸的失水速率遠(yuǎn)大于ZD-K根頸的。據(jù)此結(jié)果推斷，低溫干旱環(huán)境下水分散失過(guò)快致使根頸組織細(xì)胞含水量低，可能是導(dǎo)致WL-K根頸在低溫冷凍期間細(xì)胞膜受到不可恢復(fù)的破壞的原因之一。

水分散失過(guò)快可能是導(dǎo)致低溫干旱環(huán)境下苜蓿根頸細(xì)胞死亡的原因，需進(jìn)一步分析是什么因素影響了苜蓿根頸細(xì)胞的水分散失速率。脯氨酸是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[31-32]，但有時(shí)植物抗寒性的增強(qiáng)要早于脯氨酸的積累，故無(wú)法確定它在改變植物耐寒性上的作用[33]，然而也有研究通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段證明了脯氨酸的積累在植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫上的積極作用，如轉(zhuǎn)入P5CS基因的矮牽牛其脯氨酸的積累量較野生種提高1.5～2.6倍，耐旱性也明顯增強(qiáng)[34]。在本研究中，脯氨酸含量在品種間存在顯著性差異，ZD苜蓿根頸中的脯氨酸含量高于WL苜蓿根頸中的。對(duì)于同一品種苜蓿而言，在S2點(diǎn)處WL-K根頸含有比WL-B根頸較高的脯氨酸含量，在S3點(diǎn)處WL-K根頸含有與WL-B根頸相近的脯氨酸含量，但這并未能阻止在冷凍環(huán)境下WL-K根頸較快的失水速率以及較大的細(xì)胞液相對(duì)滲透率。此外，經(jīng)過(guò)階段2和3的低溫冷凍，2個(gè)品種苜蓿根頸內(nèi)的脯氨酸含量均有明顯降低，這與過(guò)去的研究結(jié)果相近。在對(duì)金銀花進(jìn)行干旱、低溫和水淹脅迫處理時(shí)，曾發(fā)現(xiàn)隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，脯氨酸含量有降低的趨勢(shì)，可能是由于隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，碳水化合物供應(yīng)不足或酶活性降低等原因造成的[35]。在對(duì)2種暖季型草坪草進(jìn)行持續(xù)的干旱脅迫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，脯氨酸含量呈先升高后降低的現(xiàn)象，可能是由于脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，根系活力下降造成的[36]。同時(shí)，研究還認(rèn)為不能簡(jiǎn)單將某一時(shí)間點(diǎn)的脯氨酸含量作為衡量植物抗性的標(biāo)準(zhǔn)，可能會(huì)造成假結(jié)論的產(chǎn)生[36]。

此外，以往的研究表明，苜蓿在冷適應(yīng)過(guò)程中會(huì)積累可溶性蛋白，并且學(xué)者們也肯定了可溶性蛋白在抗寒越冬過(guò)程中的重要作用[10,15]。但在本研究中，可溶性蛋白在WL-B和WL-K 2個(gè)樣本間并無(wú)顯著的差異性，可溶性蛋白未能阻止WL-K樣本根頸細(xì)胞的破裂?？扇苄蕴且彩擒俎ｓw內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)劑，還具有冷凍保護(hù)劑的作用，可影響苜蓿的耐寒性，如棉子糖和水蘇糖等[10,37-38]。在本研究中，ZD苜蓿根頸內(nèi)可溶性糖的含量顯著高于WL苜蓿根頸內(nèi)的。同時(shí)，對(duì)于ZD苜蓿而言，經(jīng)過(guò)低溫干旱環(huán)境和低溫環(huán)境處理后，苜蓿根頸內(nèi)的可溶性糖含量在2個(gè)樣本間無(wú)顯著差異；對(duì)于WL而言，低溫干旱環(huán)境處理后苜蓿根頸中的可溶性糖含量顯著高于低溫環(huán)境處理后苜蓿根頸中的，此結(jié)果與本研究中根頸耐寒性的比較結(jié)果相一致。據(jù)此推斷，在低溫干旱環(huán)境下根頸中的可溶性糖含量較低，可能是導(dǎo)致WL苜蓿根頸水分散失過(guò)快以及細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷的原因之一。根據(jù)幾種物質(zhì)的含量在品種間及樣本間的差異性判斷，脯氨酸和可溶性蛋白的含量可能與ZD苜蓿應(yīng)對(duì)冷凍環(huán)境時(shí)更優(yōu)異的表現(xiàn)有關(guān)，而可溶性糖的含量低是低溫干旱處理境下WL苜蓿根頸細(xì)胞滲透性變高乃至死亡的原因。

4 結(jié)論

在模擬的低溫干旱環(huán)境下，秋眠級(jí)較高的‘WL440HQ’苜蓿根頸失水速率較快，處理后細(xì)胞液相對(duì)滲透率超過(guò)60%，導(dǎo)致細(xì)胞受到無(wú)法修復(fù)的損傷，土壤干旱嚴(yán)重影響了‘WL440HQ’苜蓿抵抗冷凍的能力。而對(duì)于秋眠級(jí)較低的‘肇東’苜蓿，低溫干旱環(huán)境條件下其根頸失水速率較‘WL440HQ’苜蓿慢，土壤干旱未對(duì)冷凍期‘肇東’苜蓿根頸的耐寒性產(chǎn)生顯著性影響。從根頸細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的含量來(lái)看，脯氨酸和可溶性蛋白含量可能與‘肇東’苜蓿應(yīng)對(duì)低溫環(huán)境時(shí)更優(yōu)異的表現(xiàn)有關(guān)，而可溶性糖含量低才是與“低溫干旱”環(huán)境下‘WL440HQ’苜蓿根頸失水速率快乃至耐寒性受到嚴(yán)重影響的原因。