張小杰， 王春明， 周天旺， 劉 浩， 沈瑞清， 李敏權*， 郭 成,*

(1.甘肅農業(yè)大學植物保護學院， 甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅省農業(yè)科學院植物保護研究所， 甘肅 蘭州 730070；3.寧夏農林科學院植物保護研究所， 寧夏 銀川 750002)

玉米(ZeamaysL.)是我國重要的糧飼兼用型作物和能源植物，在國民經濟中占有重要地位[1]。寧夏作為我國的主要玉米產區(qū)之一，素有西部玉米“黃金產業(yè)帶”之美譽，因其日照充足及積溫值高、晝夜溫差大、氣候較溫涼的獨特氣候條件，使得玉米籽粒飽滿、品質優(yōu)良，單產水平遠高于全國平均水平[2]。自2010年以來，玉米已成為寧夏的第一大糧食作物[3]。但近年來，由于全球氣候變暖，秸稈還田[4]和高密度種植技術的大力推廣，種植模式由套種模式逐步向單作玉米的轉變[3,5]，使得寧夏地區(qū)的玉米莖腐病呈逐年加重的趨勢。

玉米莖腐病是一種世界性的土傳病害，年度間產量損失在10%～30%[6]。病菌單獨或復合侵染可導致莖腐病的發(fā)生，使得養(yǎng)分和水分流失，導致作物減產，同時莖稈纖維受損引起植株倒伏[6]。目前已報道玉米莖腐病的病原菌有20余種[7]，國外研究表明，在美國該病是由玉蜀黍殼色單隔孢菌(Diplodiamaydis)、禾生炭疽菌(Collectotrichumgraminicolum)、膠孢鐮孢(Fusariumsubglutinans)和禾谷鐮孢(F.graminearum)等多種病原菌所致[8]，在西歐國家玉米莖腐病的主要致病菌是擬輪枝鐮孢(F.verticillium)和玉米穗粒干腐菌(Diplodiazeae)，東歐地區(qū)的是禾谷鐮孢[9]，俄羅斯和烏克蘭也以禾谷鐮孢為主。在氣候炎熱的熱帶國家，如印度、尼泊爾、孟加拉國、菲律賓、泰國、以色列、南非和希臘，玉米莖腐病主要由細菌歐文氏菌(Erwinia)引起[10]。我國幅員遼闊，不同地區(qū)氣候及環(huán)境等條件差異大，致使各玉米產區(qū)莖腐病病原菌種類多樣，且優(yōu)勢致病菌種群差異較大，如河北、陜西及東北三省等較干旱的省份鐮孢菌易成優(yōu)勢菌群[11]。郭成[12]通過對甘肅省4大生態(tài)區(qū)玉米莖腐病病原菌進行鑒定發(fā)現(xiàn)，禾谷鐮孢復合種(F.graminearumspecies complex)和擬輪枝鐮孢為當?shù)氐膬?yōu)勢病原菌；劉樹森等[13]研究發(fā)現(xiàn)黃淮海夏玉米主產區(qū)莖腐病主要病原菌為擬輪枝鐮孢、禾谷鐮孢復合種、芒孢腐霉(Pythiumaristosporum)和層出鐮孢(F.proliferatum)，其中擬輪枝鐮孢為優(yōu)勢種且在河北省的檢出率最高，層出鐮孢和芒孢腐霉在山東省的檢出率最高，禾谷鐮孢復合種在河北、河南和山東3省的檢出率相近；賀娟等[14]報道禾谷鐮孢和擬輪枝鐮孢是云南省玉米莖腐病的優(yōu)勢種群；陳楠等[11]提出引起東北地區(qū)玉米莖腐病的致病鐮孢菌主要為擬輪枝鐮孢和禾谷鐮孢；張超沖等[15]研究指出，廣西地區(qū)玉米莖腐病病原菌以串珠鐮孢(F.moniliforme)為主，禾谷鐮孢分離頻率較低；山西省的優(yōu)勢病原菌除串珠鐮孢外還有膠孢鐮孢[16]。鐮孢菌種類繁多，在形態(tài)上難以區(qū)分，給相關病害的診斷造成了很大的困難。根據形態(tài)特征，可參考Nelson和Leslie等分類系統(tǒng)對分離菌株進行初步鑒定。其中，Nelson系統(tǒng)對于種的概念較為清晰，較好的分析了各個種的重要特征及近似種間的區(qū)別，對鐮孢菌的分類比較具有重要的參考價值[17]。此外，該系統(tǒng)還增加了康乃馨葉片瓊脂(Carnation leaf-piece agar，CLA)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基能促進分生孢子梗和分生孢子大量產生，且與自然情況下的形態(tài)極其相似[18]。隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，基因序列分析等技術在真菌分類上的應用，使得鐮孢菌屬真菌分類更準確，尤其轉錄延伸因子(EF-1α)的分子進化過程與生物物種的整體進化過程一致，對親緣關系較近的種分辨率高，可以較好地表現(xiàn)鐮孢菌在種一級的關系[11]。

在當今農村勞動力日趨緊張,需迅速普及推廣機械化收獲的情況下，莖腐病已成為制約寧夏地區(qū)玉米持續(xù)增產的重要因素。該病害的防治以種植抗性品種和種子包衣為主，兩種防治技術的研究和推廣均建立在明確病原菌的研究基礎上[13]，但關于寧夏玉米莖腐病的病原種類目前尚不清楚。因此，本研究在形態(tài)學鑒定的基礎上，選取各個種的代表性菌株進行EF-1α測序，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，進一步驗證傳統(tǒng)形態(tài)學的鑒定結果，確定寧夏地區(qū)玉米鐮孢莖腐病的病原菌種類和數(shù)量，是有效防治該地區(qū)玉米莖腐病的前提和基礎。

1 材料與方法

1.1 病株采集

2020年9月8日至9月11日，在寧夏回族自治區(qū)玉米種植田中采集有明顯癥狀的發(fā)病植株，共計36份。采集地點如表1所示。

續(xù)表1

1.2 病原菌分離

玉米莖腐病病原菌的分離方法：首先用無菌水將玉米莖基部沖洗干凈，晾干后將病健交界處組織剪成約0.5 cm×0.2 cm的小塊，采用組織分離法進行病原菌分離，獲得分離物純化后，再參考相關文獻進行單孢分離[19]。經單孢分離獲得純化菌株后，將病菌分別轉接于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基和CLA培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)[17-18]，根據培養(yǎng)性狀進行形態(tài)學鑒定。

1.3 病原菌的種類鑒定

1.3.1形態(tài)學鑒定 鐮孢菌的形態(tài)學鑒定主要參考Nelson[20]和Leslie[21]等分類系統(tǒng)，根據觀察分離物在PDA培養(yǎng)基上形成的菌落大小及形態(tài)，CLA培養(yǎng)基上大、小型分生孢子和厚垣孢子的有無、特點以及產生方式等形態(tài)特征進行初步鑒定。

1.3.2TEF序列鑒定 在形態(tài)學特征鑒定的基礎上，選取相對應種的代表性菌株，在PDA上培養(yǎng)3 d后，轉移至鋪有滅菌玻璃紙的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，刮取菌絲體用液氮進行速凍，充分預冷后在研磨機中研磨，采用上海生工生物工程技術服務有限責任公司試劑盒提取基因組DNA。

使用鐮孢菌菌株種間鑒定的特異性引物TEF-F(5′-ATGGGTAAGGARGACAAGAC-3′)，TEF-R(5′-GGARGTACCAGTSATCATGTT-3′)(引物由上海生工生物工程技術服務有限責任公司合成)[22]以30 μL體系進行PCR擴增。擴增后的產物送上海生工生物工程技術服務有限公司北京分公司測序部測序。

1.3.3系統(tǒng)進化分析 將測序結果與NCBI基因庫中已登錄的鐮孢菌序列進行BLAST比對，統(tǒng)計比對結果。一個種選取2個菌株為代表，采用MEGA 7.0軟件進行ClustalW比對后，以鄰近相接法(Neighbor-joining，NJ)構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 致病性測定

選取不同種類的鐮孢菌代表菌株接種于PDA培養(yǎng)基上活化，置于25℃黑暗條件下培養(yǎng)5 d后，轉接至玉米粒培養(yǎng)基上，再培養(yǎng)7～10 d。選擇直徑10 cm的花盆，將土和蛭石以 1∶1(體積比)混勻滅菌后，每盆接種病原繁殖體40 g，使土壤帶菌。玉米品種選用‘利合328’(為甘肅早熟春玉米類型區(qū)種植品種，感莖腐病)。挑選健康飽滿的種子，用75%的酒精表面消毒5 min，無菌水沖洗3次，每個花盆播種10粒，重復5次。采用常規(guī)澆水等進行日常管理，待出苗20 d后開始記載發(fā)病狀況，并計算發(fā)病率和平均病級。分級標準參考宋佐衡等[23]針對苗期玉米莖腐病調查提出的5級標準。

1.5 統(tǒng)計分析

采用Excel 2010軟件進行數(shù)據的統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 病原菌的鑒定結果

根據Nelson和O'Donnell等人對鐮孢菌屬真菌的分類研究，進行形態(tài)學鑒定，可分為9種鐮孢菌。各個種的形態(tài)學特征如下：

禾谷鐮孢復合種：在PDA上產生玫瑰紅色絮狀氣生菌絲，間有白色、淺黃色的菌絲團。小型孢子較少，呈卵圓形；大型分生孢子呈鐮刀形，頂胞較尖呈鳥嘴狀，3～8個隔膜，分隔明顯(圖1-A)。產孢梗為單瓶梗。厚垣孢子聚生或串生，球形或近球形，較光滑或略粗糙。

擬輪枝鐮孢：在PDA上產生白色或淡紫色叢卷毛狀氣生菌絲，菌落背面隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加顏色變異比較大。小型分生孢子密集分布，形成或長或短的分生孢子鏈，0～1隔，卵形或棒槌形。大型分生孢子呈鐮刀形，細長較直，3～5分隔。產孢梗通常呈現(xiàn)“V”字形，或出現(xiàn)“兔子耳朵”狀，其分支一般不超過3個(圖1-B)。

木賊鐮孢(F.equiseti)：在PDA上產生絮狀氣生菌絲，比較致密平坦，菌落初期為白色至淺粉色，后逐漸變?yōu)橥咙S色。未觀察到小型分生孢子，大型分生孢子呈鐮刀狀，細長彎曲，頂細胞細長且基細胞足跟比較明顯，3～7隔。產孢梗為單瓶梗，梗較短，數(shù)量較少，不易觀察到。通常在氣生菌絲上產生大量串生的黃褐色厚垣抱子(圖1-C)。

層出鐮孢：在PDA上產生羊毛狀的氣生菌絲，菌落初期呈白色或淡紫色，菌落背面產生紫色色素。其分生孢子的形態(tài)特征與擬輪枝鐮孢較為相似。產孢梗分支較多，單瓶梗和復瓶梗共存。常見為較長的產孢細胞旁邊形成很短的產孢點，或形成“Z”形的復瓶梗(圖1-D)。

膠孢鐮孢：在PDA上氣生菌絲常聚集成較明顯的菌絲束，呈蛛網狀，菌落顏色從白色到灰紫色或深紫色，其上有粉狀物。其分生孢子的形態(tài)特征與擬輪枝鐮孢較為相似。產孢梗分支較多，單瓶梗和復瓶梗共存，以復瓶梗較多(圖1-E)。

半裸鐮孢(F.incarnatum)：在PDA上產生羊絨狀氣生菌絲，菌落初期為淺粉色，后期變?yōu)辄S褐色。小型分生孢子呈倒卵形或窄瓜籽形，串生或假頭生；大型分生孢子較直，呈針葉形，頂細胞錐狀，直或略彎曲，基細胞為一個小柄狀，多為3～5個隔膜。產孢梗為單瓶梗和復瓶梗共存(圖1-F)。

銳頂鐮孢(F.acuminatum)：在PDA上產生玫瑰紅色氣生菌絲，較致密繁茂，菌落邊緣不圓滑。小型分生孢子稀少，腎形，長橢圓形，絕大多數(shù)無隔，有的菌株產生，有的菌株不產生，以假頭狀著生；大型分生孢子細，中等長，稍彎，中間寬，3～5個隔膜，足胞不明顯，兩端漸尖。產胞細胞為單瓶梗(圖1-G)。

黃色鐮孢(F.culmorum)：在PDA上產生絮狀氣生菌絲，菌絲表面淺黃色，背面產生玫瑰紅色素。未觀察到小型分生孢子；大型分生孢子稍彎曲，梭形至鐮刀形，0～6個隔膜，足胞有凹缺，頂胞鈍圓或稍尖。產孢細胞單瓶梗(圖1-H)。

燕麥鐮孢(F.avenaceum)：在PDA上產生短羊毛狀氣生菌絲，中央少部分為淺紫紅色，邊緣白色，后期菌落背面產黃色色素。小型分生孢子呈卵形或棍棒形，0～1隔；大型分生孢子細長且直，呈線形，1～3個隔膜，頂胞逐漸變細彎曲。產孢細胞為單瓶梗(圖1-I)。

2.2 病原菌分離結果

2020年從寧夏回族自治區(qū)采集的36份玉米莖腐病植株樣本中，共分離得到209株鐮孢菌，根據形態(tài)學鑒定，共分為9種鐮孢菌(表2)。其中，禾谷鐮孢菌復合種分離頻率最高，為28.2%；擬輪枝鐮孢和木賊鐮孢次之，分離頻率分別為23.9%和20.1%；剩余7種鐮孢菌包括：層出鐮孢、膠孢鐮孢、半裸鐮孢、銳頂鐮孢、黃色鐮孢和燕麥鐮孢，其分離頻率依次為8.1%，7.2%，6.7%，2.9%，1.9%和1.0%，均不足10%。從采集分離的地點來看，禾谷鐮孢菌復合種、木賊鐮孢、膠孢鐮孢和半裸鐮孢在寧夏5市均有分布，擬輪枝鐮孢除在固原市沒有分布外，其余4市均有分布，銳頂鐮孢和燕麥鐮孢僅在固原市有分布，黃色鐮孢則僅在石嘴山市分離到。綜合來看，寧夏地區(qū)玉米鐮孢莖腐病優(yōu)勢致病菌為禾谷鐮孢復合種。

圖1 鐮孢菌形態(tài)特征圖

表2 寧夏地區(qū)玉米莖腐病鐮孢菌的分離頻率

2.3 病原菌的系統(tǒng)進化分析

經對選取的20個菌株的測序結果與NCBI基因庫中已登錄的鐮孢菌EF-1α基因序列比對，利用MEGA7.0軟件采用鄰近相接法(Neighbor-joining，NJ)構建系統(tǒng)發(fā)育樹(Bootstrap=1 000)，以匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)為外類群，三線鐮孢(F.tricinctum)為內類群，發(fā)現(xiàn)1-1和12-2與GenBank已登錄的布氏鐮孢(HQ889160)聚在同一分支上，13-2和26-4與禾谷鐮孢(KX269083,KX269100)聚在一起，禾谷鐮孢與布氏鐮孢位于同一分支，進化距離較短，親緣關系較近，這與O'Donnell將禾谷鐮孢與布氏鐮孢等合稱為禾谷鐮孢復合種這一事實相符合[24]。28-1和28-4與黃色鐮孢(GU370481,MK577954和MK577953)聚為一支；16-3和24-4與木賊鐮孢(MH595501,KT213281和KP267452)聚為一支；15-2和31-7與半裸鐮孢(MK328877,GQ339789和HQ165861)聚為一支；1-13和14-3與膠孢鐮孢(MG826894,KM462951和JF270168)聚為一支；8-2和27-4與層出鐮孢(KY435733和KT239490)聚為一支；17-1和35-3與擬輪枝鐮孢(MT470921,MF803750和MH791038)聚為一支；3-4和1-12與燕麥鐮孢(KP400697、MK185024和KY365607)聚為一支；7-7和6-10與銳頂鐮孢(MH341216,MG826865和KC175292)聚為一支(圖2)。通過對兩種鑒定結果的分析比較表明，分子鑒定結果與形態(tài)學鑒定結果一致?？蓪⒎蛛x獲得的鐮孢菌分為9種，包括禾谷鐮孢復合種、擬輪枝鐮孢、木賊鐮孢、層出鐮孢、膠孢鐮孢、半裸鐮孢、銳頂鐮孢、黃色鐮孢和燕麥鐮孢。

圖2 基于EF-1α基因序列構建的不同鐮孢菌種的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 致病性測定

選取所鑒定到的不同種類的鐮孢菌代表菌株對玉米品種‘利合328’幼苗進行致病性測定，試驗結果表明，供試菌株均能侵染玉米植株并引起莖基部不同程度腐爛變褐，且不同種類的鐮孢菌致病力存在較大差異。其中，黃色鐮孢的致病性最強，種子大多壞死，平均病情指數(shù)高達90以上。禾谷鐮孢復合種致病性次之，發(fā)病率為100%且平均病情指數(shù)在75以上。與對照相比，發(fā)病植株生長矮小，莖部病斑變褐凹陷，擴展明顯，嚴重的甚至腐爛壞死。層出鐮孢、膠孢鐮孢和銳頂鐮孢致病性較弱，兩者的發(fā)病率雖達到100%，但平均病情指數(shù)在45左右，其中，膠孢鐮孢在引起植株發(fā)病的同時，還出現(xiàn)了一定程度的白化。擬輪枝鐮孢、木賊鐮孢、半裸鐮孢和燕麥鐮孢的致病性最弱，平均病情指數(shù)僅在20～30(表3)。

表3 盆栽法測定結果

3 討論

不同地理、氣候條件和土壤中微生態(tài)差異導致各地莖腐病病原菌的組成和優(yōu)勢種都不盡相同[6,13]。寧夏位于我國西北內陸，全區(qū)屬溫帶大陸性干旱、半干旱氣候，多年平均年降水量為183.4～677 mm，由南向北逐漸遞減。依據地形可分為3大板塊：南部山區(qū)、中部干旱帶、北部引黃灌區(qū)。本試驗從采集的病樣中分離獲得209株鐮孢菌，由9種鐮孢菌組成，禾谷鐮孢復合種為主要致病菌，擬輪枝鐮孢和木賊鐮孢次之。本研究結果與河北[13]、河南[13]、甘肅[12]、陜西[25]和東北[11]等地區(qū)玉米莖腐病優(yōu)勢致病菌為禾谷鐮孢和擬輪枝鐮孢相一致，與廣西省[15]玉米莖腐病優(yōu)勢菌為串珠鐮孢、山西省[16]莖腐病優(yōu)勢菌為串珠鐮孢和膠孢鐮孢的結果有所差異,可能與不同地區(qū)氣候類型和耕作栽培方式等不同以及病原菌生態(tài)適應型不同相關。由于從自然和農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中獲得的鐮孢菌具有不同的氣候偏好[26]，氣候甚至天氣的局部變化都可以影響鐮孢菌的范圍及其相對頻率。本研究中擬輪枝鐮孢除在固原市沒有分離到外，其余4市均有分布，這可能也與擬輪枝鐮孢較喜歡相對溫暖干旱的地區(qū)[18]有關。

對分離得到的59株禾谷鐮孢復合種通過鐮孢菌特異性引物EF-1α擴增后進行測序和Blast比對，共獲得38株布氏鐮孢(F.boothii)和21株禾谷鐮孢，占比為64.4%和35.6%，由此可見，布氏鐮孢為禾谷鐮孢復合種的優(yōu)勢種群。該結論與郭成[12]研究發(fā)現(xiàn)甘肅省玉米莖基腐病優(yōu)勢種為禾谷鐮孢復合種，且布氏鐮孢和禾谷鐮孢的比例為2.75∶1的結果基本一致。從采集分離的地點來看，禾谷鐮孢在固原市、中衛(wèi)市、吳忠市、銀川市和石嘴山市均有分布，分離頻率分別占禾谷鐮孢總數(shù)的4.76%，4.76%，14.29%，61.90%和14.29%;布氏鐮孢除在石嘴山市未分離到外，其在固原市、中衛(wèi)市、吳忠市和銀川市均有分布，分離頻率分別占布氏鐮孢總數(shù)的63.16%，26.32%，7.89%和2.63%。分析發(fā)現(xiàn)布氏鐮孢多在寧夏南部分布，禾谷鐮孢多在北部分布，但兩者在中部干旱帶也均有分布，這可能是因為：寧夏南部山區(qū)相對潮濕，畜牧業(yè)發(fā)達，主要種植青貯玉米；中部干旱帶，種植業(yè)與畜牧業(yè)并存[27]；北部引黃灌區(qū)則相對干旱平坦，大面積連片種植普通玉米。

本研究首次明確了寧夏地區(qū)玉米鐮孢莖腐病病原菌的種類以及優(yōu)勢病原菌為禾谷鐮孢復合種，為該地區(qū)玉米莖腐病的防治提供了理論依據。但我們仍需對優(yōu)勢致病菌的遺傳多樣性、快速檢測方法的構建及綜合防治措施等方面進一步做深入研究。

4 結論

本研究明確了寧夏地區(qū)玉米鐮孢莖腐病的病原菌種類由禾谷鐮孢復合種、擬輪枝鐮孢、木賊鐮孢、層出鐮孢、膠孢鐮孢、半裸鐮孢、銳頂鐮孢、黃色鐮孢和燕麥鐮孢組成，其中禾谷鐮孢復合種的分離頻率最高，為寧夏玉米鐮孢莖腐病優(yōu)勢病原菌。