劉 波，吳雨蒙，孫煜昕

(江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌 330004)

骨骼是一個(gè)動(dòng)態(tài)活性組織，它的形成需要各類(lèi)骨細(xì)胞共同參與。骨形成通常始于骨細(xì)胞的死亡，釋放的生物活性分子，誘導(dǎo)其他存活的骨細(xì)胞分泌核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)，隨后破骨細(xì)胞前體被趨化蛋白招募，核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)和RANKL在其表面結(jié)合啟動(dòng)了破骨細(xì)胞生成。與此同時(shí)，成骨細(xì)胞分泌的巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage-stimulating factor，M-CSF)、單核細(xì)胞趨化蛋白l(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)和RANKL還能募集破骨細(xì)胞前體并促進(jìn)其向破骨細(xì)胞分化。破骨細(xì)胞吸收破損骨時(shí)分泌胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin like growth factor，IGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等耦合因子，可促進(jìn)成骨細(xì)胞對(duì)骨骼腔隙的填充，當(dāng)新礦化的細(xì)胞外骨基質(zhì)完全替代吸收的骨基質(zhì)時(shí)，骨形成過(guò)程完成[1]。

近年來(lái)，大量文獻(xiàn)顯示，骨組織中的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-mesenchymal stem cells,BMSCs)、成骨細(xì)胞(osteoblast)、破骨細(xì)胞(osteoclast)和骨細(xì)胞(osteocyte)等產(chǎn)生的外泌體介導(dǎo)了上述骨形成過(guò)程。陳長(zhǎng)軍等[2]全面地介紹了外泌體在骨以及關(guān)節(jié)疾病中的作用和在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用，本文則主要介紹骨相關(guān)細(xì)胞來(lái)源外泌體中的miRNA對(duì)骨形成的調(diào)節(jié)作用。

1 外泌體簡(jiǎn)介

1.1 外泌體生物學(xué)特性外泌體(exosome)是Johnstone等[3]首先在研究網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的，是一種形似杯狀直徑約30-150 nm的細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)。其主要來(lái)源于細(xì)胞膜內(nèi)出芽形成的多囊泡體(multivesicular bodies，MVBs)，經(jīng)多囊泡體膜與細(xì)胞膜融合后釋放到細(xì)胞外基質(zhì)，在外環(huán)境中通過(guò)受體細(xì)胞內(nèi)吞作用、受體配體相互作用及細(xì)胞膜相互融合進(jìn)行攝取，調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的生物學(xué)活性[4]。外泌體內(nèi)容物主要有蛋白質(zhì)、miRNAs、脂質(zhì)等[5]。不同來(lái)源的外泌體均包含膜轉(zhuǎn)運(yùn)融合蛋白(GTPase、Annexins和 flotillin)，四跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81和CD82)和熱休克蛋白(Hsc70、Hsp 90、Hsp60和Hsp20)等，其中四跨膜蛋白常是區(qū)別外泌體與其他細(xì)胞外囊泡(微囊泡和凋亡小體)的分子標(biāo)記物[6]。外泌體脂質(zhì)雙分子層中富含膽固醇、神經(jīng)酰胺及鞘磷脂等，可防止外泌體內(nèi)部的RNA、蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)在細(xì)胞外環(huán)境中被破壞，通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)這些生物信息分子，在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮了重要作用。

1.2 外泌體的應(yīng)用Welker等[7]發(fā)現(xiàn)慢性丙型肝炎患者血清中可溶性CD81水平顯著升高；而Goto等[8]在尋找胰腺癌早期診斷標(biāo)志物時(shí)發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患者血清外泌體中miR-191、miR-21、miR-451a表達(dá)水平比健康人高，上述研究表明，外泌體的分子成分如外泌體相關(guān)蛋白和微小RNA等，具有作為分子標(biāo)記物用于臨床診斷的潛力。外泌體可從血液、尿液、唾液、腦脊液等體液中獲取[9]，研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)自人尿干細(xì)胞的外泌體可以促進(jìn)骨形成相關(guān)基因OCN、ALP、RUNX2的表達(dá)，而通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)CTHRC1和OPG抑制破骨的形成[10]。外泌體還具有細(xì)胞毒性小、生物相容性好、免疫抑制性低等優(yōu)點(diǎn)，可作為天然的納米級(jí)藥物載體[11]。目前運(yùn)用外泌體載藥有以下幾種方式[12]：(1)藥物與外泌體共孵育；(2)通過(guò)轉(zhuǎn)染試劑或者電轉(zhuǎn)染將藥物裝載入外泌體中；(3)藥物與供體細(xì)胞共孵育或者轉(zhuǎn)染供體細(xì)胞，供體細(xì)胞分泌的外泌體就含有藥物。Aqil等[13]便是直接用姜黃素與外泌體共孵育來(lái)獲得載藥外泌體，結(jié)果表明，與游離姜黃素相比，載藥外泌體組抗炎活性和抗腫瘤活性更高，提高了姜黃素的生物利用度。

2 外泌體miRNA對(duì)骨形成的作用

miRNA是一類(lèi)非編碼單鏈RNA分子，包含19-25個(gè)核苷酸[14]。miRNA不穩(wěn)定易于降解，外泌體中的miRNA有外泌體的包裹，因而對(duì)普遍存在的RNA酶，極端溫度和pH水平具有更好的耐受性甚至可以在細(xì)胞外環(huán)境中保存較長(zhǎng)時(shí)間。受體細(xì)胞通過(guò)質(zhì)膜融合和胞吞作用攝取外泌體miRNA并發(fā)揮其生物學(xué)功能[15]。本文將著重描述骨相關(guān)細(xì)胞來(lái)源外泌體miRNA對(duì)骨形成的作用。

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體miRNA對(duì)骨形成的作用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (BMSCs)是一類(lèi)具有自我更新和多向分化潛能的干細(xì)胞，在特定條件下可以分化為成骨細(xì)胞，BMSCs來(lái)源的外泌體可以上調(diào)生長(zhǎng)因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein2，BMP2)和TGF-β1，還能使miRNA表達(dá)譜朝成骨細(xì)胞譜系分化促進(jìn)骨形成。Xu等[16]首次對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中外泌體miRNA的表達(dá)譜進(jìn)行分析，研究結(jié)果顯示，let-7a、miR-199b、miR-218、miR-148a、miR-135b、miR-203、miR-219、miR-299-5p和miR-302b表達(dá)水平顯著升高，而miR-221、miR-155、miR-885-5p、miR-181a和miR-320c表達(dá)水平顯著降低；對(duì)miR-885-5p進(jìn)一步研究表明，miR-885-5p通過(guò)抑制Runx2從而抑制成骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，可作為BMSCs成骨分化的負(fù)調(diào)控因子。而Qin等[17]研究表明BMSCs源性外泌體miR-196a在體外能上調(diào)成骨相關(guān)基因ALP、OCN、OPN和RUNX2的表達(dá)從而影響成骨細(xì)胞的分化，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了BMSCs來(lái)源外泌體可以增加顱骨缺損的SD大鼠的骨形成。Wang等[18]對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化各階段分泌的外泌體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)成骨分化后期外泌體miRNA的表達(dá)存在顯著差異，miRNA表達(dá)譜分析揭示了外泌體miRNA表達(dá)的變化，其中成骨分化負(fù)調(diào)控因子miR-31、miR-221和miR-144表達(dá)水平顯著降低，成骨分化正調(diào)控因子miR-21則顯著升高，表明這些外泌體miRNA參與了成骨分化的調(diào)節(jié)。以上研究說(shuō)明，BMSCs源性外泌體miRNA在成骨細(xì)胞分化和成骨基因表達(dá)的調(diào)控中起著至關(guān)重要作用，進(jìn)而影響骨形成。

2.2 破骨細(xì)胞來(lái)源外泌體miRNA對(duì)骨形成的作用在骨形成過(guò)程中，除了眾所周知的成骨細(xì)胞通過(guò)RANK/RANKL途徑調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞生成及骨吸收以外，越來(lái)越多的證據(jù)表明破骨細(xì)胞可以通過(guò)ephrinA2/EphA2途徑等直接方式或旁分泌等間接方式調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的活動(dòng)。外泌體miRNA經(jīng)過(guò)旁分泌途徑參與成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞間的信息傳遞。破骨細(xì)胞分泌的富含miR-214-3p的外泌體可定向運(yùn)輸至成骨細(xì)胞中，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明破骨細(xì)胞源性外泌體miR-214-3p通過(guò)靶向成骨轉(zhuǎn)錄因子ATF4抑制成骨細(xì)胞活性進(jìn)而抑制骨形成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示用破骨細(xì)胞源性外泌體miR-214-3p處理的小鼠成骨標(biāo)志基因ALP、OPN、BSP和BGLAP的mRNA水平顯著降低，顯微CT分析顯示骨質(zhì)量降低和骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂，這些結(jié)果闡明破骨細(xì)胞源性外泌體miR-214-3p可以抑制體內(nèi)骨形成[19]。

另一項(xiàng)研究表明，破骨細(xì)胞分泌的外泌體miR-23a-5p通過(guò)靶向RUNX2來(lái)抑制成骨細(xì)胞的分化。該實(shí)驗(yàn)顯示破骨細(xì)胞源性外泌體miR-23a-5p會(huì)抑制成骨細(xì)胞的活性，運(yùn)用N-SMase抑制劑GW4869及Rab27a siRNAs抑制外泌體的釋放，發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞源性miR-23a-5p對(duì)成骨細(xì)胞的抑制作用減弱了，提示外泌體對(duì)miR-23a-5p作用的發(fā)揮具有重要作用；此外，還進(jìn)一步探討了破骨細(xì)胞源性外泌體miR-23a-5p抑制成骨細(xì)胞功能的具體機(jī)制，研究結(jié)果證明了miR-23a-5p可以靶向抑制成骨分化相關(guān)基因RUNX2的表達(dá)，通過(guò)調(diào)控下游信號(hào)通路(RUNX2-MT1DP- RUNX2反饋通路)影響成骨細(xì)胞分化，進(jìn)而影響骨形成[20]。

2.3 成骨細(xì)胞來(lái)源外泌體miRNA對(duì)骨形成的作用在Cui等[21]的一項(xiàng)研究中，他們發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞可以釋放出含有成骨性miRNA的外泌體，這些外泌體被骨髓基質(zhì)細(xì)胞(ST2)攝取，從而促進(jìn)了骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。此外，該研究顯示轉(zhuǎn)移成骨細(xì)胞外泌體后受體ST2細(xì)胞中miRNA譜發(fā)生顯著改變，計(jì)算機(jī)模擬數(shù)據(jù)表明，這些改變的miRNA可能會(huì)影響調(diào)控成骨細(xì)胞分化和功能的多個(gè)重要途徑，例如Wnt信號(hào)途徑，胰島素信號(hào)途徑，TGF-β信號(hào)途徑和鈣信號(hào)途徑。進(jìn)一步研究證明了成骨細(xì)胞來(lái)源的外泌體通過(guò)激活Wnt信號(hào)通路抑制ST2細(xì)胞中Axin1表達(dá)并增加β-catenin表達(dá)來(lái)促進(jìn)成骨。總之，該研究表明成骨細(xì)胞來(lái)源外泌體通過(guò)轉(zhuǎn)移miRNA影響受體ST2細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化，進(jìn)而影響骨形成。

2.4 骨細(xì)胞來(lái)源外泌體miRNA對(duì)骨形成的作用Qin等[22]在研究骨骼與肌肉的相互作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，肌肉細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子(肌生長(zhǎng)抑制素)可以促進(jìn)骨細(xì)胞中成骨抑制基因(SOST，DKK1和RANKL)的表達(dá)，同時(shí)抑制miR-218在Ocy454細(xì)胞和其衍生的外泌體中的表達(dá)，表明肌生長(zhǎng)抑制素(myostatin)通過(guò)抑制骨細(xì)胞來(lái)源的外泌體miR-218抑制成骨細(xì)胞的活性及其分化，暗示骨細(xì)胞源性的外泌體miR-218可以促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)肌生長(zhǎng)抑制素修飾的骨細(xì)胞源性外泌體抑制了Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而抑制成骨細(xì)胞的分化和活性。將肌生長(zhǎng)抑制素修飾的骨細(xì)胞源性外泌體與成骨細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)組中促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子RUNX2和骨鈣素的mRNA表達(dá)下調(diào)，抑制成骨細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)因子SOST mRNA表達(dá)上調(diào)；轉(zhuǎn)染的外源性miR-218通過(guò)抑制SOST可完全逆轉(zhuǎn)肌生長(zhǎng)抑制素修飾的骨細(xì)胞外泌體對(duì)成骨細(xì)胞分化的抑制作用，證明骨細(xì)胞所分泌的富含miR-218的外泌體能夠通過(guò)激活Wnt信號(hào)通路抑制SOST的表達(dá)來(lái)促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。

2.5 外泌體其他生物活性分子對(duì)骨形成的作用外泌體內(nèi)含物除了miRNA以外，還有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及其他生物活性分子，這些生物活性分子也會(huì)影響骨形成。最近蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，成骨細(xì)胞來(lái)源的外泌體包含大量蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)在成骨相關(guān)信號(hào)通路如整聯(lián)蛋白信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路和真核起始因子2(EIF2)信號(hào)通路中高度富集，可能對(duì)成骨產(chǎn)生影響[23]。成骨細(xì)胞分泌的富含RANKL的外泌體可以靶向運(yùn)輸至單核細(xì)胞，在單核細(xì)胞表面與RANK結(jié)合從而激發(fā)破骨細(xì)胞形成，間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體通過(guò)上調(diào)Nfatc1、Trap和Ctsk的表達(dá)可以增強(qiáng)這一過(guò)程，隨后破骨細(xì)胞分泌的耦合因子可以促進(jìn)成骨細(xì)胞骨形成，從而構(gòu)成了一個(gè)正反饋通路[1]。

3 小結(jié)與展望

外泌體調(diào)節(jié)骨形成是一個(gè)受多種因素影響的復(fù)雜過(guò)程。骨相關(guān)細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以通過(guò)調(diào)節(jié)成骨分化基因(ALP、RUNX2等)、成骨抑制基因(SOST，DKK1和RANKL)以及Wnt/β-catenin信號(hào)通路等機(jī)制來(lái)影響成骨細(xì)胞的活性和功能(Fig 1)。目前，骨相關(guān)細(xì)胞來(lái)源外泌體中miRNA作用的靶點(diǎn)尚不明確，盡管計(jì)算機(jī)模擬數(shù)據(jù)表明這些外泌體miRNA可以參與調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)途徑，胰島素信號(hào)途徑，TGF-β信號(hào)途徑和鈣信號(hào)途徑，但是缺少相關(guān)文獻(xiàn)資料，對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證的研究也較少。因此進(jìn)一步的研究需深入關(guān)注外泌體miRNA發(fā)揮調(diào)節(jié)骨形成的作用靶點(diǎn)。此外，大量文獻(xiàn)顯示，骨相關(guān)細(xì)胞中的外泌體不僅可以介導(dǎo)生理情況下骨髓微環(huán)境內(nèi)的細(xì)胞間通訊，還參與了骨骼疾病的病理過(guò)程。霍春暉等[24]對(duì)骨質(zhì)疏松癥患者血清外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)Integrinβ3、Integrinα2β1、Talin 1和Gelsolin等17個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)量在骨質(zhì)疏松癥組和骨量減少組有顯著改變；杜昱和等[25]對(duì)骨量減少患者血清外泌體中miRNA進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示34個(gè)miRNA有顯著差異。所以，研究在生理及病理?xiàng)l件下骨相關(guān)細(xì)胞中外泌體的變化情況及其作用的靶點(diǎn)，對(duì)闡明骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制具有重大意義。

Fig 1 Effects of miRNA in exosomes derived from bone-related cells on osteoblasts

為了逐步實(shí)現(xiàn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化，促進(jìn)中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展，中醫(yī)藥與外泌體相結(jié)合為其提供了新的研究思路。有研究表明，中藥可以引起外泌體內(nèi)含物的改變，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)控疾病的作用。Yang等[26]研究顯示，補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)后間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，而且補(bǔ)陽(yáng)還五湯可以上調(diào)外泌體中miR-126的表達(dá)并下調(diào)miR-221和miR-222的表達(dá)，進(jìn)而增加大鼠腦中的血管生成。張小藝等[27]研究表明梓醇可以促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞分泌外泌體且梓醇修飾的外泌體可以保護(hù)神經(jīng)；Wei等[28]研究表明紫草素通過(guò)下調(diào)腫瘤來(lái)源外泌體miR-128的表達(dá)抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖等。綜上，中藥能夠改變外泌體的分泌并發(fā)揮重要調(diào)控作用從而影響疾病的進(jìn)程。目前，關(guān)于中醫(yī)藥通過(guò)外泌體對(duì)骨質(zhì)疏松癥等疾病作用的報(bào)道較少，我們前期研究表明二仙湯防治骨質(zhì)疏松與促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和骨向分化有關(guān)[29]，且BMSCs源性外泌體能使miRNA表達(dá)譜朝成骨細(xì)胞譜系分化[18]，但二仙湯對(duì)BMSCs來(lái)源外泌體的作用尚不清楚。從外泌體角度探討中醫(yī)藥防治疾病的分子機(jī)制將是未來(lái)研究方向之一。