杜 亭,方國林,喬 琳,朱仁發(fā)

(1.合肥學(xué)院a.生物食品與環(huán)境學(xué)院;b.能源材料與化工學(xué)院，合肥 230601；2.安徽華辰檢測(cè)技術(shù)研究院有限公司，合肥 230601)

0 引 言

烯啶蟲胺最早是由日本武田公司研發(fā)的新煙堿類殺蟲劑，具有高效、低毒、內(nèi)吸性強(qiáng)、無交互抗性和易降解等優(yōu)良的性質(zhì)，是新一代環(huán)境友好型殺蟲劑。烯啶蟲胺與其他新煙堿類殺蟲劑相似，主要作用于害蟲的神經(jīng)系統(tǒng)，通過阻斷害蟲正常的中樞神經(jīng)傳導(dǎo)而使其死亡，目前多用于防治水稻、蔬菜、水果等農(nóng)作物病蟲害，對(duì)蚜蟲、葉蟬、飛虱、粉虱和薊馬等刺吸式口器害蟲有較好的防治效果。[1]

相關(guān)研究表明，烯啶蟲胺在植物中代謝產(chǎn)生2-[N-(6-氯-3-吡啶甲基)-N-乙基]氨基-2-甲基亞氨基乙酸(2-[N-(6-chloro-3-pyridylmethyl)-N-ethyl] amino-2-methyliminoacetic acid，CPMA)、 N-(6-氯-3-吡啶甲基)-N-乙基-N’-甲基甲脒(N-(6-chloro-3-pyridylmethyl)-N- ethyl -N’ -methylformamidine，CPMF)等物質(zhì)，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。這些代謝物的毒性與母體大致相同，并且比母體表現(xiàn)出更強(qiáng)的遷移性和持久性。[2]GB 2763-2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[3]中對(duì)烯啶蟲胺制定了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)：稻谷(0.5mg/kg)、糙米(0.1mg/kg)、棉籽(0.05mg/kg)、結(jié)球甘藍(lán)(0.2mg/kg)、柑(0.5mg/kg)、橘(0.5mg/kg)、橙(0.5mg/kg)，但其監(jiān)測(cè)的作物種類較少，監(jiān)測(cè)定義僅為烯啶蟲胺母體，而對(duì)其代謝物CPMA、CPMF無相關(guān)要求。

圖1 烯啶蟲胺及其代謝物CPMA、CPMF的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

QuEChERS是2003年由美國農(nóng)業(yè)部最早提出的一種新的樣品前處理方法，是利用吸附劑與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用，從而吸附雜質(zhì)達(dá)到除雜凈化的目的，目前已經(jīng)用于多領(lǐng)域的樣品前處理，特別是在農(nóng)藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛。[4]相比傳統(tǒng)的固相萃取、溶劑萃取、索氏提取等樣品前處理方法，QuEChERS前處理法僅需少量高效的提取試劑和凈化提取試劑，通過簡(jiǎn)單的離心操作，便可將目標(biāo)組分與其他雜質(zhì)分離，具有提取時(shí)間短、過程簡(jiǎn)便、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。

目前，國內(nèi)外已有關(guān)于烯啶蟲胺在甘藍(lán)、蘋果、柑橘、棉花等作物及土壤中殘留及消解動(dòng)態(tài)的研究報(bào)道。侯少巖等[5]建立了烯啶蟲胺在金銀花中的氣相色譜檢測(cè)方法，方法靈敏度高、線性較好，但是保留時(shí)間7.68min相對(duì)LC- MS較長(zhǎng)，對(duì)于大批量檢測(cè)農(nóng)作物中烯啶蟲胺含量較耗時(shí)。檀笑昕等[6]建立了測(cè)定土壤中烯啶蟲胺含量的高效液相色譜方法；Malgorzata、潘金菊等[7-8]建立了測(cè)定烯啶蟲胺含量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；Laura等[9]建立了毛細(xì)管電泳串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)烯啶蟲胺含量的方法，但相關(guān)水稻樣品中烯啶蟲胺及其代謝物的殘留分析方法研究較少。對(duì)比以上檢測(cè)方法，QuEChERS-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有消耗有機(jī)試劑少、操作簡(jiǎn)便、提取時(shí)間及出峰時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，適用于快速檢測(cè)大批量農(nóng)殘樣品。近年來，烯啶蟲胺在各類農(nóng)作物上的使用日益廣泛，為保障消費(fèi)者的食品安全，急需建立農(nóng)作物中烯啶蟲胺及其代謝物的快速檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

乙腈、甲酸(色譜純，美國TEDIA公司)；N- 丙基乙二胺粉末(分析純，Agela Technologies公司)；C18粉末(分析純，天津博納艾杰爾科技有限公司)；烯啶蟲胺標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.1%，上海市農(nóng)藥研究所有限公司)； CPMA標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.7%，F(xiàn)UJIFILM wakopure chemical公司)；CPMF標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.1%，F(xiàn)UJIFILM wakopure chemical公司)。

LCMS- 8050液相色譜- 三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(日本島津公司)；XD- H旋渦混合器(上海漢諾儀器有限公司)；AUW- 220D電子天平，感量為0.000 01g(日本島津公司)；LD5- 2B離心機(jī)(北京雷博爾離心機(jī)有限公司)；SHZ- 82水浴恒溫振蕩器(常州國宇儀器制造有限公司)；JK-500DB超聲波清洗器(合肥市金尼克機(jī)械制造有限公司)；0.22μm有機(jī)相針式濾器、0.22μm水相針式濾器(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；移液槍(100～5 000μL，德國Eppendorf公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制

稱取烯啶蟲胺標(biāo)準(zhǔn)品0.010 09g(精確至0.000 01g)置于10 mL容量瓶中，用色譜純乙腈溶解并定容至刻度，配置成1 000mg/L的烯啶蟲胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

稱取烯啶蟲胺代謝物CPMA標(biāo)準(zhǔn)品0.010 13g(精確至0.000 01g)置于10 mL容量瓶中，用色譜純乙腈溶解并定容至刻度，配置成1 000mg/L的代謝物CPMA標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

稱取烯啶蟲胺代謝物CPMF標(biāo)準(zhǔn)品0.010 09g(精確至0.000 01g)置于10 mL容量瓶中，用色譜純乙腈溶解并定容至刻度，配置成1 000mg/L的代謝物CPMF標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.3 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液制備

分別用水稻稻殼、秸稈空白樣品提取液配成烯啶蟲胺及烯啶蟲胺代謝物CPMA、烯啶蟲胺代謝物CPMF系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，濃度梯度為1 mg/L、0.2 mg/L、0.05 mg/L、0.01 mg/L、0.005 mg/L、0.002 5 mg/L；用水稻糙米空白樣品提取液配成烯啶蟲胺代謝物CPMA及烯啶蟲胺代謝物CPMF系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，濃度梯度為0.25 mg/L、0.05 mg/L、0.025 mg/L、0.005 mg/L、0.002 5 mg/L；用水稻糙米空白樣品提取液配成烯啶蟲胺系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，濃度梯度為0..5 mg/L、0.1 mg/L、0.05 mg/L、0.005 mg/L、0.002 5 mg/L。

1.4 樣品前處理

水稻稻殼、秸稈(烯啶蟲胺及其代謝物CPMA、CPMF)：稱取2.0g粉碎混勻的水稻稻殼或秸稈樣品，置于50 mL離心管中，加入乙腈：水=65:35的混合溶液20ml振蕩2min，20℃超聲提取45min，置于離心機(jī)以3 000r/min離心5min。移取1mL上清液于裝有50mgPSA和50mg C18的2mL離心管中，渦旋1min，靜置2min，取上清液過0.22μm濾膜至進(jìn)樣瓶中，上機(jī)檢測(cè)。

水稻糙米(烯啶蟲胺)：稱取5.0g粉碎混勻的水稻糙米樣品，置于50 mL離心管中，加入10mL水，渦旋2min，振蕩提取45min，置于離心機(jī)以3 000r/min離心5min，取上清液過0.22μm濾膜至進(jìn)樣瓶中，上機(jī)檢測(cè)。

水稻糙米(烯啶蟲胺代謝物CPMA、CPMF)：稱取5.0g粉碎混勻的水稻糙米樣品，置于50 mL離心管中，加入乙腈：水=65:35的混合溶液20ml，振蕩2min，20℃超聲提取45min，置于離心機(jī)以3 000r/min離心5min，取上清液過0.22μm濾膜至進(jìn)樣瓶中，上機(jī)檢測(cè)。

1.5 器檢測(cè)條件

1.5.1 液相色譜分析條件

色譜柱：Shim-pack GIST C18柱，2.1mm(id)×100mm，粒徑2μm；柱溫：40℃；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液/ 乙腈(70/30)，等度洗脫；流速：0.2mL/min；進(jìn)樣量：1μL。根據(jù)保留時(shí)間(RT)定性，外標(biāo)法定量。

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子源：ESI+；接口電壓：4.5kV；DL管溫度：250℃；加熱塊溫度：400℃；霧化氣流量：3L/min；干燥氣流量：10L/min；碰撞氣：氬氣；監(jiān)測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件如表1所示。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)條件

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍、檢出限

按照試驗(yàn)方法測(cè)定系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及方法檢出限見表2。結(jié)果表明，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法中，3種化合物在0.002 5～1 mg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，水稻稻殼中烯啶蟲胺及其代謝物CPMA、CPMF的相關(guān)系數(shù)分別為0.999 9、0.998 7和0.998 2，水稻秸稈中烯啶蟲胺及其代謝物CPMA、CPMF的相關(guān)系數(shù)分別為0.999 7、0.998 6和0.999 5，水稻糙米中烯啶蟲胺及其代謝物CPMA、CPMF的相關(guān)系數(shù)分別為0.998 3、0.999 9和0.999 8，3種待測(cè)物的最低檢出限均為0.002 5mg/L。

表2 稻殼、秸稈、糙米基質(zhì)中的線性參數(shù)及檢出限

2.2 水稻樣品中的回收率和精密度試驗(yàn)

回收率是評(píng)價(jià)檢測(cè)方法準(zhǔn)確度的有效數(shù)值，通常至少設(shè)置3個(gè)不同的添加水平，每個(gè)添加水平至少5個(gè)重復(fù)。添加水平應(yīng)當(dāng)包含GB 2763—2019中規(guī)定的食品中農(nóng)藥最大殘留限量和檢測(cè)方法的定量限，定量限一般為0.01 mg/kg～0.05 mg/kg，再增加一個(gè)能覆蓋最高殘留限量的添加水平。

GB 2763—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[3]中制定了烯啶蟲胺在糙米中最大殘留限量0.1mg/kg，并且在殘留定義上只明確了烯啶蟲胺母體，而對(duì)其代謝物CPMA、CPMF無相關(guān)要求。在實(shí)際檢測(cè)中，對(duì)于未規(guī)定最大殘留限量的農(nóng)藥代謝物，其最大殘留限量一般根據(jù)母體的限量值確定。

2.2.1 水稻稻殼的添加回收率

分別將0.05 mg/kg、0.1 mg/kg、2 mg/kg的烯啶蟲胺、烯啶蟲胺代謝物CPMA、烯啶蟲胺代謝物CPMF添加到水稻稻殼的空白樣品中，混勻，靜置30min，按照試驗(yàn)方法平行測(cè)定5次，計(jì)算平均值，試驗(yàn)結(jié)果見表3。結(jié)果顯示：本次試驗(yàn)烯啶蟲胺在稻殼中的平均回收率為94.21%～102.65%，烯啶蟲胺代謝物CPMA在稻殼中的平均回收率為96.58%～100.47%，烯啶蟲胺代謝物CPMF在稻殼中的平均回收率為91.26%～95.88%，試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤3%，符合加標(biāo)回收率要求，說明本方法準(zhǔn)確可靠。

表3 水稻稻殼中烯啶蟲胺及其代謝物CPMA、CPMF的添加回收率

2.2.2 水稻秸稈的添加回收率

分別將0.05 mg/kg、0.1 mg/kg、2 mg/kg的烯啶蟲胺、烯啶蟲胺代謝物CPMA、烯啶蟲胺代謝物CPMF添加到水稻秸稈的空白樣品中，混勻，靜置30min，按照試驗(yàn)方法平行測(cè)定5次，計(jì)算平均值，試驗(yàn)結(jié)果見表4。結(jié)果顯示：本次試驗(yàn)烯啶蟲胺在秸稈中的平均回收率為86.02%～94.39%，烯啶蟲胺代謝物CPMA在秸稈中的平均回收率為81.82%～85.18%，烯啶蟲胺代謝物CPMF在秸稈中的平均回收率為80.13%～86.04%，試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤3%，符合加標(biāo)回收率要求，說明本方法準(zhǔn)確可靠。

表4 水稻秸稈中烯啶蟲胺及其代謝物CPMA、CPMF的添加回收率

2.2.3 水稻糙米的添加回收率

分別將0.02 mg/kg、0.1 mg/kg、1mg/kg的烯啶蟲胺、烯啶蟲胺代謝物CPMA、烯啶蟲胺代謝物CPMF添加到水稻糙米的空白樣品中，混勻，靜置30min，按照試驗(yàn)方法平行測(cè)定5次，計(jì)算平均值，試驗(yàn)結(jié)果見表5。結(jié)果顯示：本次試驗(yàn)烯啶蟲胺在糙米中的平均回收率為95.03%～104.42%，烯啶蟲胺代謝物CPMA在糙米中的平均回收率為85.06%～90.29%，烯啶蟲胺代謝物CPMF在糙米中的平均回收率為89.17%～94.07%，試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤3%，符合加標(biāo)回收率要求，說明本方法準(zhǔn)確可靠。

表5 水稻糙米中烯啶蟲胺及其代謝物CPMA、CPMF的添加回收率

續(xù)表5

3 結(jié) 論

本試驗(yàn)采用了QuEChERS前處理方法，建立了LC-MS同時(shí)測(cè)定水稻樣品中烯啶蟲胺及其代謝物的殘留分析方法。該方法操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，滿足水稻稻殼、秸稈、糙米中烯啶蟲胺及其代謝物的快速檢測(cè)和定量分析要求，可廣泛應(yīng)用于糧谷中農(nóng)藥快速批量分析。