陸紹霞， 張春雷，王常安，劉洋，韓世成，劉紅柏

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070)

魚類為低等水生動物，易受到生物和非生物因素的影響，所產(chǎn)生的生理或病理變化可通過血液學(xué)特征反映出來。黏液免疫和血液免疫是魚類非常重要的免疫機制，其中，外周血細胞在特異性、非特異性免疫應(yīng)答過程中均起著重要作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，血細胞的形態(tài)特征與動物分類、生理狀況及系統(tǒng)演化方面均有一定的關(guān)系[2-3]，魚類的血細胞具有吞噬、分泌等功能，可參與機體的傷口修復(fù)、防御等生理過程。魚類血細胞對自身生理狀況變化和外界環(huán)境因子刺激十分敏感，通過觀察及測量血液指標可初步判斷魚類的健康情況，為疾病診斷及水域環(huán)境質(zhì)量判定提供參考[4-5]。因此，研究魚類的血細胞形態(tài)、數(shù)量和顯微結(jié)構(gòu)在水體生態(tài)環(huán)境監(jiān)控、魚類養(yǎng)殖生產(chǎn)等方面具有重要的指導(dǎo)作用。

鮭鱒魚是世界上第三大主養(yǎng)魚類，近年來，關(guān)于鮭鱒魚血細胞研究中，相關(guān)學(xué)者僅對二、三倍體山女鱒Oncorhynchusmasou和虹鱒Oncorhynchusmykiss血細胞的數(shù)量、大小及顯微結(jié)構(gòu)進行了比較[6-9]。本試驗中，選取白點鮭Salvelinusmalma、紅點鮭Salvelinusleucomaenis、虹鱒及金鱒Oncorhynchusmykiss4種鮭鱒魚作為試驗材料，采用瑞氏-姬姆薩混合染色法與血細胞計數(shù)法,觀察并對比不同鮭鱒魚外周血細胞的顯微與超微結(jié)構(gòu)及形態(tài)、數(shù)量特征，旨在為鮭鱒魚血液學(xué)和免疫學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用白點鮭(體質(zhì)量49.07 g±12.05 g)、紅點鮭(體質(zhì)量83.23 g±15.07 g)、虹鱒(體質(zhì)量60.12 g±11.86 g)和金鱒(體質(zhì)量42.04 g±10.26 g)各8尾，均為1齡魚，采自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所渤海冷水性魚試驗站，養(yǎng)殖水溫為7 ℃，選擇健康無病、活動狀態(tài)正常的魚。

1.2 方法

1.2.1 光鏡樣品制備 從每尾魚尾靜脈采集血液，經(jīng)抗凝處理，用Dacie’s稀釋液將血液稀釋200倍和20倍，用于紅細胞和白細胞計數(shù)。每尾魚制作血涂片5張， 用瑞氏姬姆薩染液染色，光學(xué)顯微鏡下觀察血細胞的形態(tài)特征并拍照，同時測量各細胞的長徑和短徑，每種細胞各測40個，并在油鏡下對隨機視野內(nèi)100個白細胞進行分類計數(shù)，計算各種白細胞的占比。

1.2.2 電鏡樣品制備 電鏡樣品制備方法借鑒文獻[10]～[12]，略有改進。采集魚體尾靜脈血(肝素抗凝處理)，轉(zhuǎn)移至離心管中靜置45 min，以12 000 r/min離心20 min；用移液槍吸取上層血清后，挑取薄薄的一層白細胞于滅菌離心管中，加入體積分數(shù)為3.0%的戊二醛固定液(用0.1 mol/L pH 7.4的磷酸緩沖液配制)5 mL固定1 d；用PBS沖洗3次，4 ℃下以3 000 r/min離心3 min，每次間隔12 min；用體積分數(shù)為1%的鋨酸固定1.5 h，用磷酸緩沖液沖洗3次，條件同上；再分別用50%、70%和90%(均為體積分數(shù)，下同)梯度乙醇脫水1次，每次10 min，100%乙醇脫水2次，每次10 min，100%乙醇+100%丙酮(體積比1∶1)脫水1次，10 min，100%丙酮脫水1次，10 min，100%丙酮+812樹脂(體積比1∶1)包埋0.5 h，812樹脂包埋2 h，環(huán)氧樹脂包埋30 min，超薄切片機切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，在HITACHI7650型透射電鏡下觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理，試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差(mean±S.D.)表示，采用單因素方差分析比較不同魚類同種外周血細胞間的差異，采用Duncan法進行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 外周血細胞的組成及大小

從表1可見：虹鱒紅細胞密度顯著小于白點鮭、紅點鮭和金鱒(P<0.05)，金鱒白細胞密度顯著大于白點鮭(P<0.05)；4種魚白細胞中均觀測到嗜中性粒細胞、大淋巴細胞、小淋巴細胞及血栓細胞，白細胞中占比最高的均為小淋巴細胞，其中，虹鱒和紅點鮭外周血中小淋巴細胞在白細胞中的占比無顯著性差異(P>0.05)，兩者占比均顯著高于白點鮭和金鱒(P<0.05)；4種鮭鱒魚大淋巴細胞和嗜中性粒細胞在白細胞中的占比均無顯著性差異(P>0.05)，白點鮭外周血中血栓細胞和嗜中性粒細胞在白細胞中的占比較其他3種魚高，虹鱒血栓細胞占比顯著低于其他3種魚(P<0.05)。

表1 血細胞計數(shù)結(jié)果Tab.1 Result of blood cells counting

從表2、表3可見：白點鮭紅細胞的長徑和短徑均顯著大于紅點鮭(P<0.05)；虹鱒嗜中性粒細胞的長徑顯著大于白點鮭 (P<0.05)，4種魚嗜中性粒細胞的短徑無顯著性差異(P>0.05)；金鱒大淋巴細胞的長徑顯著大于白點鮭和虹鱒(P<0.05)，4種魚大淋巴細胞的短徑無顯著性差異(P>0.05)；4種鮭鱒魚小淋巴細胞和血栓細胞的長徑和短徑均無顯著性差異(P>0.05)；金鱒外周血中大淋巴細胞、小淋巴細胞、血栓細胞的長徑和短經(jīng)均大于其他3種魚類。

從形態(tài)學(xué)來看，虹鱒紅細胞長徑與短徑之比較小，其形態(tài)比其他3種魚紅細胞更接近圓形；4種魚類白細胞中血栓細胞長徑與短徑之比稍大(表2)，表明血栓細胞更近橢圓形，而其他白細胞的長徑與短徑之比更接近于1(表3)，在形態(tài)上接近于圓形。

表2 4種鮭鱒魚血細胞大小比較Tab.2 Comparison of size of peripheral blood cells among 4 salmonid species

表3 4種鮭鱒魚淋巴細胞大小比較Tab.3 Comparison of size of lymphocyte among 4 salmonid species

2.2 外周血細胞的顯微結(jié)構(gòu)觀察

2.2.1 紅細胞 光學(xué)顯微鏡下，可觀察到圓形或近圓形的原紅細胞，細胞核較大且圓，核質(zhì)比較大，呈疏松網(wǎng)狀的染色質(zhì)被染成淺紫色，細胞質(zhì)較少，被染成淺藍色(圖1A、B、C、D)；幼紅細胞呈橢圓形，與成熟紅細胞相似，但細胞核較成熟紅細胞稍大，呈橢圓形，核質(zhì)比較大，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松，著色較淺，細胞質(zhì)較成熟紅細胞少，染成較淺藍色(圖1E、F、G、H)；成熟紅細胞呈橢圓形或長橢圓形，細胞表面光滑，細胞核近橢圓形，位于細胞中央，核中染色質(zhì)密集，被染成深藍色，細胞質(zhì)被染成淺藍色，紅細胞的核質(zhì)比約為1∶3 (圖1I、J、K、L)；衰老紅細胞較正常紅細胞大，核也較大，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松，被染成淺紫紅色，細胞質(zhì)著色很淺，接近白色(圖1M、N、O、P)。此外，可見被染成淡紫紅色的“核影”紅細胞，似裸核狀，染色質(zhì)呈疏松網(wǎng)狀，其結(jié)構(gòu)不同于外周血中其他有形成分(圖1S)；偶見分裂期的紅細胞、溶解紅細胞(圖1Q、R、T)。

A、B、C、D—白點鮭、紅點鮭、虹鱒、金鱒原紅細胞；E、F、G、H—白點鮭、紅點鮭、虹鱒、金鱒幼紅細胞；I、J、K、L—白點鮭、紅點鮭、虹鱒、金鱒成熟紅細胞；M、N、O、P—白點鮭、紅點鮭、虹鱒、金鱒衰老紅細胞；Q—白點鮭分裂期紅細胞；R—紅點鮭溶解紅細胞；S—虹鱒核影細胞；T—金鱒溶解紅細胞。標尺長度=10 μm。A,B,C and D—primitive erythrocyte of Dolly varden, Alpine charr, rainbow trout and golden trout; E,F,G and H—immature erythrocyte of Dolly varden, Alpine charr, rainbow trout and golden trout; I, J, K and L—mature erythrocyte of Dolly varden, Alpine charr, rainbow trout and golden trout; M, N, O and P—aged erythrocyte of Dolly varden, Alpine charr, rainbow trout and golden trout; Q—mitotic erythrocyte of Dolly varden; R—lysed erythrocytes of Alpine charr; S—nuclear shadow erythrocyte of rainbow trout; T—lysed erythrocytes of golden trout. bar scale=10 μm.圖1 紅細胞顯微結(jié)構(gòu)Fig.1 Microstructure of red blood cells

2.2.2 嗜中性粒細胞 光學(xué)顯微鏡下，嗜中性粒細胞多近圓球形，細胞核位于細胞的一側(cè)，細胞質(zhì)呈紫紅色，表面有鋸齒狀突起，核質(zhì)間較為明顯，細胞核較大且常偏位；核有單葉核和分葉核，單葉核呈腎形、馬蹄形和半圓形，分葉核多為2～3葉，少數(shù)為4～6葉，被染成藍紫色。細胞質(zhì)顆粒清晰，被染成紫紅色，顆粒排列不規(guī)則，呈毛玻璃狀。根據(jù)細胞核類型區(qū)分，白點鮭觀察到5種嗜中性粒細胞，分別為馬蹄形、半圓形、3葉形、4葉形、6葉形(圖2A、B、C、D、E)；紅點鮭觀察到5種嗜中性粒細胞，分別為T形、馬蹄形、S形、2葉形及3葉形共(圖2F、G、H、I、J)；虹鱒觀察到4種嗜中性粒細胞，分別為卵圓形、2葉形、3葉形、4葉形嗜中性粒細胞(圖2K、L、M、N)；金鱒僅觀察到2葉形嗜中性粒細胞(圖2O)。

A、B、C、D、E—白點鮭馬蹄形、3分葉、半圓形、4分葉、6分葉嗜中性粒細胞；F、G、H、I、J—紅點鮭T形、馬蹄形、S形、3分葉、2分葉嗜中性粒細胞；K、L、M、N—虹鱒卵圓形、2分葉、3分葉、4分葉嗜中性粒細胞；O—金鱒2分葉嗜中性粒細胞。標尺長度=10 μm。A，B，C，D and E—neutrophil with a hoof-shape nucleus，trilobed nuclei， half round， quartered nuclei，and six nuclei of Dolly varden; F,G,H,I and J—neutrophil with T-shaped nucleus， hoof-shaped nucleus， S-shaped nucleus，trilobed nuclei，and bilobed nuclei of Alpine charr; K,L,M and N—neutrophil with oval nuclei，bilobed nuclei， trilobed nuclei，and quartered nuclei of rainbow trout; O—neutrophil with bilobed nuclei of golden trout. bar scale=10 μm.圖2 嗜中性粒細胞顯微結(jié)構(gòu)Fig.2 Microstructure of neutrophils

2.2.3 淋巴細胞 光學(xué)顯微鏡下，淋巴細胞近圓形，有的表面光滑，有的有明顯的偽足胞突(圖3G)；核質(zhì)比大，核占細胞體積的3/4以上，被染成藍紫色，細胞質(zhì)呈堿性被染成淺藍或深藍色，根據(jù)細胞的大小可將淋巴細胞分為大淋巴細胞(圖3A、B、C、D)及小淋巴細胞(圖3E、F、G、H)。

A、B、C、D—白點鮭、紅點鮭、虹鱒、金鱒大淋巴細胞； E、F、G、H—白點鮭、紅點鮭、虹鱒、金鱒小淋巴細胞； I—白點鮭成群聚集的血栓細胞；J—紅點鮭腎形血栓細胞；K—虹鱒短棒狀血栓細胞；L—金鱒短棒狀血栓細胞。標尺長度=10 μm。A,B,C and D—large lymphocyte of Dolly varden， Alpine charr， rainbow trout and golden trout; E, F, G and H—small lymphocyte of Dolly varden, Alpine charr, rainbow trout and golden trout; I—group of thrombocyte of Dolly varden; J—thrombocyte with a kidney-shaped nucleus of Alpine charr; K—thrombocyte with a clubbed nucleus of rainbow trout; L—thrombocyte with a clubbed nucleus of golden trout. bar scale=10 μm.圖3 淋巴細胞及血栓細胞顯微結(jié)構(gòu)Fig.3 Microstructure of lymphocyte and thrombocyte

2.2.4 血栓細胞 光學(xué)顯微鏡下，血栓細胞呈圓形或橢圓形或不規(guī)則圓形，表面光滑，細胞質(zhì)少，核質(zhì)比大，細胞核呈腎形(圖3J)、馬蹄形(圖3J)和棒形(圖3K、L)，核中染色質(zhì)密集，被染成深紫色；細胞質(zhì)僅一薄層，著色較淺，呈淡藍色、透明色或顏色不清，繞核零星分布，邊界模糊，在白點鮭血細胞圖片中還可觀測到聚集成隊的血栓細胞(圖3I)。

2.3 外周血細胞的超微結(jié)構(gòu)觀察

2.3.1 紅細胞 透射電鏡下，4種鮭鱒魚成熟紅細胞呈橢圓形，表面光滑；細胞核呈卵圓形，位于細胞中央，核膜清晰，可見核孔；異染色質(zhì)沿著核膜內(nèi)側(cè)呈帶狀分布，在核中央呈片狀分布；胞質(zhì)均勻致密，電子密度較高；成熟紅細胞胞質(zhì)內(nèi)已無細胞器，核糖體亦幾乎消失(圖4A、B、C、D)。

2.3.2 淋巴細胞 透射電鏡下，鮭鱒魚淋巴細胞呈不規(guī)則圓形或橢圓形，有的表面伸出許多細小的指狀突起(圖4E)；核體積大，呈不規(guī)則形，偏于細胞一側(cè)，核膜清晰，核內(nèi)異染色質(zhì)較少，結(jié)構(gòu)疏松，位于核中央；胞質(zhì)中細胞器較少，只含有少量細小顆粒和空泡，紅點鮭和虹鱒淋巴細胞含有極少量線粒體(圖4F、G、H)。

2.3.3 單核細胞 透射電鏡下，單核細胞呈不規(guī)則橢圓形，表面有少量偽足狀突起；核偏位，核膜不清晰，核內(nèi)異染色質(zhì)多，大部分沿核膜內(nèi)緣分布；胞質(zhì)豐富，有少量小的嗜天青顆粒，靠近細胞膜的外質(zhì)中有許多大小不一數(shù)量不等的囊泡和空泡；金鱒和虹鱒單核細胞胞質(zhì)可觀察到線粒體，白點鮭胞質(zhì)中溶酶體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)含量較為豐富，紅點鮭和白點鮭胞質(zhì)中含有少量嗜天青顆粒(圖4I、J、K、L)。

2.3.4 嗜中性粒細胞 透射電鏡下，嗜中性粒細胞呈錐形或橢圓形，表面可見突起和微絨毛；胞核較小、分葉，呈不規(guī)則狀，偏于細胞一側(cè)，核膜不清晰，異染色質(zhì)較多且濃重，胞質(zhì)豐富，特殊顆粒較多，有單位膜包被，形態(tài)多樣，大小差異較大，排列不規(guī)則；比較幾種魚嗜中性粒細胞胞質(zhì)中細胞器含量，白點鮭線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)含量均不豐富(圖4M)，虹鱒及紅點鮭嗜中性粒細胞內(nèi)富含各種細胞器，線粒體數(shù)目多且大、峭清晰、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，可見少量吞噬小泡(圖4N、O、P、Q)，金鱒嗜中性粒細胞內(nèi)可見少量線粒體(圖4R)。

2.3.5 血栓細胞 透射電鏡下，血栓細胞呈紡錘形、橢圓形或圓形；核較大，位于細胞中央，呈圓形或長橢圓形，核膜圍隙和核孔均清晰；異染色質(zhì)豐富、電子致密、多集中分布在核膜內(nèi)側(cè)，細胞中幾乎無細胞質(zhì)，偶見少量線粒體和空泡(圖4S、U、V)；比較4種魚的血栓細胞顯示，白點鮭紡錘形血栓細胞核呈橢圓形，染色質(zhì)呈細沙狀，細胞器結(jié)構(gòu)極少有少量空泡(圖4S)，紅點鮭血栓細胞為不規(guī)則形、細胞膜鋸齒狀、核近圓形，偏于一側(cè)，核周有少量線粒體及吞噬泡(圖4U)，而虹鱒及金鱒血栓細胞形態(tài)不規(guī)則，核呈橢圓形或近圓形，染色質(zhì)呈細沙狀，細胞器結(jié)構(gòu)極少，有少量空泡及線粒體(圖4V、W、X)。

A、B、C、D—白點鮭、紅點鮭、虹鱒、金鱒成熟紅細胞；E、F、G、H—白點鮭、紅點鮭、虹鱒、金鱒淋巴細胞；I、J、K、L—白點鮭、紅點鮭、虹鱒、金鱒單核細胞；M—白點鮭6葉形嗜中性粒細胞；N—紅點鮭2葉形嗜中性粒細胞；O、P—紅點鮭4葉形嗜中性粒細胞；Q—虹鱒2葉形嗜中性粒細胞；R—金鱒S形嗜中性粒細胞；S—白點鮭紡錘形血栓細胞；T—白點鮭橢圓形血栓細胞；U—紅點鮭橢圓形血栓細胞；V—虹鱒血栓細胞；W—金鱒棒槌形血栓細胞；X—金鱒血栓細胞；m—線粒體；n—細胞核；g—顆粒； Ly—溶酶體； RER—粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)； v—囊泡。A，B，C and D—mature erythrocyte of Dolly varden，Alpine charr，rainbow trout and golden trout; E，F(xiàn)，G and H—lymphocyte of Dolly varden，Alpine charr，rainbow trout and golden trout; I，J，K and L—monocyte of Dolly varden，Alpine charr，rainbow trout and golden trout; M—neutrophil with six nuclei in Dolly varden；N—neutrophil with bilobed nuclei in Alpine charr; O and P—neutrophil with quartered nuclei in Alpine charr; Q—neutrophil with bilobed nuclei of rainbow trout; R—neutrophil with S-shaped nucleus of golden trout; S—thrombocyte with spindly nucleus of triploid Dolly varden; T—thrombocyte with oval nucleus in Dolly varden; U—thrombocyte with oval nucleus in Alpine charr; V—thrombocyte of rainbow trout; W—thrombocyte with clubbed nucleus in golden trout; X—thrombocyte of golden trout; m—mitochondria; n—nucleus; g—granules; Ly—lysosome; RER—rough endoplasmic reticulum; v—vesicle.圖4 血細胞超微結(jié)構(gòu)Fig.4 Ultrastructure of peripheral blood cells

3 討論

3.1 血細胞組成

魚類血細胞一般包括紅細胞、血栓細胞、淋巴細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和單核細胞7大類[13]。本試驗中4種鮭鱒魚外周血細胞中包括5類細胞，未發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞，這與陳俠君等[7]的研究結(jié)果一致。林光華等[14]認為，魚類血液指標值的高低與魚類活動性及食性有關(guān)，活動性強的魚類高于活動性弱的魚類, 肉食性魚類高于草食性魚類, 草食性魚類高于雜食性魚類。本試驗中鮭鱒魚屬于肉食性魚類，活動能力較強，其紅細胞數(shù)量較中華鱘Acipensersinensis[15]、5種鯉科魚類多[16]，這與鮭鱒魚的生態(tài)習(xí)性相適應(yīng)，而較波紋唇魚Cheilinusundulatus[17]、瓦氏黃顙魚Pelteobagrusvachelli[18]、白甲魚Onychostomasima[19]、羅非魚Oreochromismossambicus[20]及歐洲鰉Husohuso[21]紅細胞密度低，可能與水溫、年齡等有關(guān)；4種鮭鱒魚白細胞密度較中華鱘[22]、歐洲鰉[21]高，這表明其抗病能力也高于二者；4種鮭鱒魚白細胞中淋巴細胞數(shù)量最多，其次為血栓細胞和嗜中性粒細胞，這與大多數(shù)淡水魚一致[14]，但在中華鱘[15]、淡水石斑魚[23]等的白細胞中，血栓細胞最多。本研究中，金鱒的白細胞密度顯著高于白點鮭，而與紅點鮭和虹鱒間無顯著性差異，表明白點鮭的抗病力可能相對較差。此外，本研究中測量出的虹鱒血細胞的大小較陳俠君等[7]的結(jié)果稍小，可能與測量誤差、飼養(yǎng)環(huán)境、水溫及個體差異等有關(guān)。

3.2 紅細胞

紅細胞是血液中最主要也是數(shù)量最多的細胞成分[24]，其主要功能是體內(nèi)攜帶和運輸氧氣[25]。紅細胞的形態(tài)和大小與動物的分類地位有關(guān)，進化地位越高，紅細胞越小，此外，細胞核在高等哺乳動物進化過程中逐漸消失。紅細胞的長短徑比值可反映紅細胞的基本形狀：該比值越大，表明紅細胞越呈長橢圓形；比值越接近于1，表明紅細胞越呈圓形。不同種屬間紅細胞長短徑比不同，本研究中，白點鮭長短徑比與金鱒接近，小于紅點鮭，大于虹鱒。與兩棲類和爬行類動物相比，魚類進化地位低，但大多數(shù)魚類紅細胞比兩棲爬行類動物小，提示紅細胞大小可能與其適應(yīng)長時間底棲生活有關(guān)。本研究中，4種鮭鱒魚中白點鮭紅細胞長徑和短徑均最長，其相應(yīng)的體積也大于其他3種魚類，表明白點鮭的攜氧能力、機體代謝能力可能要強于其他3種魚類。在白點鮭血涂片中觀察到處于分裂期的紅細胞，與對條石鯛Oplegnathusfasciatus[1]、史氏鱘Acipenserschrenckii[26]等觀察到的結(jié)果一致，表明鮭鱒魚紅細胞除了在造血器官中產(chǎn)生并釋放到外周血中，還可在外周血中通過直接分裂產(chǎn)生[7]。此外，外周血中還發(fā)現(xiàn)少量原紅細胞和幼紅細胞，這與雜交鱘等相似[27]。有研究表明，未成熟紅細胞的占總紅細胞的比例與魚的種類有關(guān)，而未成熟紅細胞占比受魚體溫度、溶氧等生活環(huán)境的影響，還與魚體的健康狀況有關(guān)[28]。本研究中，電鏡下觀察到4種鮭鱒魚紅細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)相似。

3.3 單核細胞

單核細胞具有活躍的變形運動、明顯的趨化性和一定的吞噬功能，在非特異性免疫中起到重要作用[22]。單核細胞細胞質(zhì)中有較多大小不一數(shù)量不等的囊泡和空泡，對歐洲鰻鱺Anguillaanguilla[29]、鯉Cyprinuscarpio[30]和鱖Sinipercachuitsi[31]等的研究表明，3種魚均有較強的變形與吞噬能力。本研究中，電鏡下觀察到白點鮭較其他3種魚其單核細胞胞質(zhì)內(nèi)具有更豐富的細胞器，細胞核電子更致密，推測白點鮭單核細胞變形和吞噬能力較其他3種鮭鱒魚強。陳俠君等[7]在二倍體和三倍體虹鱒血涂片中觀察到單核細胞數(shù)量很少，而本研究中在血涂片中未觀察到單核細胞，這可能是因單核細胞的數(shù)量較少，且有時血涂片中嗜中性粒細胞與單核細胞難以區(qū)分所致。

3.4 血栓細胞

血栓細胞為魚類的凝血細胞，具有凝血、吞噬(碳顆粒、細菌和細胞殘骸)和蠶食分解衰老紅細胞等功能，與哺乳動物血小板的功能類似。硬骨魚類血栓細胞數(shù)量差異較大，有研究表明，血栓細胞數(shù)量在個體間波動極大，且受涂片制作過程影響明顯[22]。陳俠君等[7]發(fā)現(xiàn)，虹鱒外周血白細胞中的血栓細胞在白細胞中占比最大，而本研究中發(fā)現(xiàn)，4種鮭鱒魚淋巴細胞數(shù)量在外周血中占比最大。本研究中，白點鮭、紅點鮭和金鱒外周血中血栓細胞占比顯著高于虹鱒，4種鮭鱒魚血栓細胞的大小間無顯著性差異；血栓細胞在4種鮭鱒魚中形態(tài)多樣，但同種魚外周血中為何出現(xiàn)多種形態(tài)有待進一步研究。另外，鮭鱒魚血栓細胞中含少量的細胞器及空泡，可能與血栓細胞的吞噬功能有關(guān)，也可能類似于血小板中的表面連接系統(tǒng)，作用是增加血漿凝血因子附著的表面積[32]。

3.5 淋巴細胞

淋巴細胞是細胞免疫的重要組成部分，本研究中發(fā)現(xiàn)了兩種大小和顏色稍有差別但形態(tài)結(jié)構(gòu)基本一致的淋巴細胞，目前，兩種淋巴細胞的功能尚未見報道。林光華[33]研究表明，成年草魚大淋巴細胞和小淋巴細胞胞質(zhì)內(nèi)所含溶酶體樣顆粒數(shù)量不同，可能兩種淋巴細胞具有不同功能。也有研究表明，當處于靜息狀態(tài)的小淋巴細胞受到抗原刺激時，可轉(zhuǎn)變成代謝活躍并具有增殖能力的大淋巴細胞，此時細胞核增大、染色質(zhì)致密、細胞質(zhì)增多，重新分裂和分化進行免疫應(yīng)答，說明大小兩種淋巴細胞可能代表了同種細胞的不同功能狀態(tài)[34]。本研究中，大小兩種淋巴細胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)在4種鮭鱒魚中差異不大，但虹鱒和紅點鮭淋巴細胞數(shù)量顯著高于白點鮭和金鱒，表明虹鱒和紅點鮭抗病力可能高于白點鮭和金鱒；此外，4種冷水魚外周血白細胞中淋巴細胞所占比例最大，血栓細胞占比也較大，這可能與其長期棲息于礫石底質(zhì)水體中有關(guān)，白細胞以血栓細胞和淋巴細胞為主體，在鮭鱒魚受傷后快速凝血，并將侵入體內(nèi)的病原體殺死，以發(fā)揮免疫保護作用。

3.6 嗜中性粒細胞

嗜中性粒細胞存在于所有硬骨魚類中，但嗜酸性和嗜堿性粒細胞也因魚種類而異[22]。嗜酸性和嗜堿性粒細胞細胞質(zhì)內(nèi)的2種顆粒易溶于水，在制作血涂片過程中可能被溶解掉，從而不易被觀察[35]。有學(xué)者在金魚和革胡子鯰外周血中發(fā)現(xiàn)極少量的嗜堿性粒細胞[36-37]；在花斑裸鯉、南方鲇等的外周血中觀察到嗜酸性粒細胞，但未發(fā)現(xiàn)嗜堿性粒細胞[28,38]；而歐洲鰻鱺等魚類的外周血中僅存在嗜中性粒細胞[29]。本次試驗中也未觀察到嗜酸性和嗜堿性粒細胞，白點鮭嗜中性粒細胞數(shù)量在白細胞中占最多，虹鱒嗜中性粒細胞長徑顯著大于白點鮭，而與紅點鮭和金鱒無顯著性差異；鮭鱒魚外周血細胞中觀察到多種核型的嗜中性粒細胞，從細胞發(fā)育角度來說，嗜中性粒細胞的核從未分葉到分葉，其實是一個衰老的過程，且分葉越多，細胞衰老的程度越高[39]；白點鮭的嗜中性粒細胞數(shù)量比其他魚類稍多，分葉更多，胞質(zhì)中細胞器更少，推測白點鮭的嗜中性粒細胞較其他3種鮭鱒魚而言，參與機體防御和免疫的效率更低，而白點鮭嗜中性粒細胞在白細胞中占比較其他3種魚大，因此，嗜中性粒細胞的數(shù)量與工作效率之間可能存在一定的平衡。此外，嗜中性粒細胞具有吞噬能力，能做變形運動，可參與機體的炎癥反應(yīng)[40-41]。本研究顯示，幾種鮭鱒魚嗜中性粒細胞內(nèi)富含內(nèi)吞泡及多種細胞器，表明均具有活躍的吞噬功能。

4 結(jié)論

1)4種鮭鱒魚外周血中可見紅細胞、淋巴細胞、嗜中性粒細胞、血栓細胞和單核細胞5種細胞。

2)4種鮭鱒魚的成熟紅細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)相似，金鱒紅細胞密度最大，白點鮭紅細胞體積最大，鮭鱒魚紅細胞除在造血器官中產(chǎn)生，還可在外周血中通過直接分裂產(chǎn)生。

3)4種鮭鱒魚白細胞總數(shù)存在差異，其白細胞均以血栓細胞和淋巴細胞為主，其中，淋巴細胞數(shù)量最多，其次為血栓細胞和嗜中性粒細胞，單核細胞數(shù)量最少。金鱒白細胞密度最大，白點鮭白細胞密度最小。

4)小淋巴細胞和血栓細胞大小在4種鮭鱒魚中無顯著性差異。

5)4種鮭鱒魚淋巴細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)相似，血栓細胞在4種鮭鱒魚中形態(tài)多樣。