牛鑫 柴倩囡 馮九海

摘要：鬼傘是一類菌柄能在短時間內(nèi)快速伸長并且傘蓋易自溶形成墨汁的蘑菇，菌柄在伸長過程中細胞壁以伸長生長為主，細胞壁組分β-1，3-葡聚糖發(fā)生重構修飾，GH72家族的β-1，3-葡聚糖轉移酶能夠將較低聚合度的寡糖轉化生成更高聚合度的糖鏈。β-1，3-葡聚糖轉移酶可能參與鬼傘菌柄細胞壁中β-葡聚糖組分的重構修飾。以完成測序并有注釋信息的灰蓋擬鬼傘（Coprinopsis cinerea）、擬鬼傘（Coprinopsis marcescibilis）、晶粒小鬼傘（Coprinellus micaceus）和小脆柄菇（Psathyrella aberdarensis）等4種鬼傘的β-1，3-葡聚糖轉移酶的氨基酸序列為基礎，采用TargetP、WOLF PSORT、SignalP、Sompa、TMHMM 2.0、Big-PI Fungal Predictor、MEME和SISS-MODEL等生物信息學分析工具對其開展蛋白質(zhì)亞細胞定位、細胞信號肽、二級結構、跨膜螺旋、糖基化磷脂酰肌醇（GPI）錨定位點、基序以及三級結構等進行分析，同時對上述序列開展遺傳進化關系分析。研究結果可為進一步深入開展該蛋白在菌柄伸長過程中細胞壁β-葡聚糖組分的重構修飾研究作基礎。

關鍵詞：真菌細胞壁;菌柄伸長;β-1，3-葡聚糖;細胞壁重構;多序列比對;生物信息學

鬼傘（coprinoid mushrooms）是一類子實體形成后，菌柄能快速伸長，傘蓋易自溶形成墨汁的大型擔子菌傘菌[1]。舊的分類系統(tǒng)中鬼傘科（Coprinaceae）包含鬼傘屬（Coprinus）、小脆柄菇屬（Psathyrella）和斑褶菇屬（Panaeolus），依據(jù)第10版《真菌詞典》最新分子系統(tǒng)學研究表明，鬼傘屬已移至蘑菇科（Agaricaceae），小脆柄菇提升到科分類級別，舊的鬼傘屬中大部分成員被劃分至擬鬼傘屬（Coprinopsis）、小鬼傘屬（Coprinellus）和近地傘屬（Parasola），其與小脆柄菇屬（Psathyrella）等屬組成小脆柄菇科（Psathyrellaceae），也就是現(xiàn)在的鬼傘科[2-4]。鬼傘菌柄的生長方式是一種類似植物胚芽鞘的頂端生長，其主要特征是細胞主要進行伸長生長，細胞基本不進行分裂[5]。蘑菇菌柄細胞壁的伸長生長理論經(jīng)歷了“水解酶模型”[6-7]，“細胞膨壓理論”[8]以及“水解酶-膨壓折衷理論”[9]等，最新研究表明，特定的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶[10]和內(nèi)切 β-1，3-葡聚糖酶均能引起滅活菌柄的伸長[11]。

真菌細胞壁主要由葡聚糖、糖蛋白和幾丁質(zhì)組成，對真菌的生存、生長和真菌細胞的形態(tài)至關重要[12-13]。盡管它是剛性結構，但它在細胞生長過程中具有可塑性，并能適應環(huán)境，因此，真菌細胞壁是一個動態(tài)變化的、有個組分相互交聯(lián)在一起形成一個高強度的具有可塑性的三維復合結構[13]。有4個家族的糖基水解酶或者糖基轉移酶已被證明在細胞壁組分的交聯(lián)中發(fā)揮作用[12]。GH16家族水解酶（β-葡聚糖酶）已被證明可能參與葡聚糖和幾丁質(zhì)的交聯(lián)[14-15]。GH17家族水解酶（β-葡聚糖酶）在葡聚糖之間的交聯(lián)中起作用[16-17]。GH76家族的甘露聚糖酶在細胞壁的生物發(fā)生中起作用[18-19]。GH72家族葡聚糖轉移酶已被證明是形成正常細胞壁必不可少的，能夠與β-1，3-葡聚糖交聯(lián)在一起。這些細胞壁重構酶中，尤其是GH72家族的β-1，3-葡聚糖轉移酶為細胞壁提供了可塑性[20]。這些酶主要參與真菌細胞壁骨架結構多糖 β-1，3-葡聚糖的重構修飾，它們能夠水解至少含10個葡萄糖單元的昆布寡糖中的β-1，3-糖苷鍵，并且把新形成的帶還原性末端的供體（含有5個以上葡萄糖單元）轉移至另一個β-1，3-寡聚糖的非還原性末端（受體）形成聚合度更高的寡糖。除 β-1，3-葡聚糖合成酶合成延長葡聚糖鏈外，這種轉糖苷酶反應產(chǎn)生新的β-1，3糖苷鍵為β-1，3葡聚糖鏈的延長提供了另一種作用或者是協(xié)同作用機制[21]。迄今為止，這類酶在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、煙曲霉（Aspergillus fumigatus）、白色念珠菌（Candida albicans）等酵母和絲狀真菌中具有廣泛的研究，釀酒酵母中這類蛋白被命名為Gasp（表面錨定糖酯類蛋白），煙曲霉中為Gelp（葡聚糖延伸蛋白），白色念珠菌中則為Phrp（pH值響應蛋白）[22-23]。在酵母菌中，這些糖基轉移酶在孢子和菌絲的細胞壁組裝中具有重要作用，并在菌絲營養(yǎng)生長條件下維持細胞壁的完整性，是粟酒裂殖酵母生存不可缺少的[24]，煙曲霉中編碼Gel4蛋白的基因也是必需基因[21]，但在大型傘菌中對該基因的研究較少。

本研究選取已完成基因組測序且有注釋信息的4種鬼傘：灰蓋擬鬼傘（Coprinopsis cinerea）、擬鬼傘（C. marcescibilis）、晶粒小鬼傘（Coprinellus micaceus）和小脆柄菇（Psathyrella aberdarensis），對其β-1，3-葡聚糖轉移酶進行生物信息學和遺傳進化分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

根據(jù)煙曲霉中已報道的β-1，3-葡聚糖轉移酶Gel1蛋白序列（登錄號：XP_749253.1），在美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，簡稱NCBI）數(shù)據(jù)庫中的組裝庫（Assembly）中分別檢索“Coprinopsis”“Coprinellus”“Psathyrella”，獲得CC3、Copmar1、Copmic2和ASM412641v1等4個基因組組裝數(shù)據(jù)，分別點擊“BLAST the assembly”選項進入“BLAST”比對界面，點擊切換至tblastn，將Gel1蛋白登錄號XP_749253.1粘貼至文本框，點擊BLAST，對期望值小于10-3的結果點擊GenBank從Feature中查看CDS詳情獲得“protein_id”。

1.2 試驗方法

1.2.1 蛋白信號肽預測 利用SignalP 5.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在線預測蛋白的信號肽。

1.2.2 蛋白的基本理化性質(zhì)預測 利用ExPASy中的ProtParam（http：//web.expasy. org/protparam/）對蛋白的分子量、等電點、氨基酸組成、不穩(wěn)定指數(shù)、脂肪族系數(shù)和總平均疏水指數(shù)等基本理化參數(shù)進行預測。

1.2.3 蛋白的亞細胞定位預測 利用WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）進行蛋白的亞細胞定位預測。

1.2.4 蛋白二級結構預測 采用Sompa（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl？ page=npsa_sopma.html）在線預測蛋白的二級結構。

1.2.5 蛋白質(zhì)跨膜結構域預測 利用TMHMM 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）對蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)結構進行預測。

1.2.6 糖基化磷脂酰肌醇（GPI）修飾預測 利用big-PI Fungal Predictor（http：//mendel.imp.ac.at/gpi/fungi _server.html）對蛋白的GPI修飾位點進行預測。

1.2.7 蛋白基序（motif）分析 采用MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）對蛋白序列中的基序進行分析。

1.2.8 系統(tǒng)進化樹構建 在NCBI中找尋Gel的同源序列，利用MEGA 7中的Clustal X進行多重比對分析，然后以鄰接法構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.9 蛋白三級結構預測 利用SWISS-MODE（http：//swissmodel.expasy.org/）對蛋白進行同源建模預測分析。

2 結果與分析

2.1 Gel蛋白序列及其信號肽、基本理化特性和亞細胞定位分析

通過煙曲霉Gel1對灰蓋擬鬼傘、擬鬼傘、晶粒小鬼傘、小脆柄菇的基因組數(shù)據(jù)CC3、Copmar1、Copmic2和ASM412641v1進行tblastn比對，結果如表1所示。結果表明，灰蓋擬鬼傘有2個Gel蛋白，擬鬼傘有4個Gel蛋白，晶粒小鬼傘和小脆柄菇各僅含有1個Gel蛋白。

由表1可知，各鬼傘Gel蛋白均含有信號肽，除晶粒小鬼傘和小脆柄菇的信號肽為N端前24個氨基酸，其他均為前20個氨基酸，結合WoLF PSORT 亞細胞定位分析，Gel蛋白均分泌到胞外。其氨基酸組成數(shù)量在520～550個之間，分子量為55 ku左右，等電點呈酸性，在4～5之間，除擬鬼傘的Gel（TFK21136.1和TFK21135.1）為不穩(wěn)定蛋白，其他均為穩(wěn)定蛋白，灰蓋擬鬼傘Gel（XP_001831707.1）的脂肪族指數(shù)最低，為69.89，而晶粒小鬼傘Gel（TEB39055.1）的脂肪族指數(shù)最高，為87.09。除晶粒小鬼傘Gel為疏水蛋白外，其他均為親水性蛋白。此4種鬼傘Gel蛋白的優(yōu)勢氨基酸均為絲氨酸（Ser）、丙氨酸（Ala）和甘氨酸（Gly）。

2.2 Gel蛋白的二級結構、跨膜螺旋以及GPI修飾位點預測

4種鬼傘的Gels蛋白中二級結構以無規(guī)則卷曲和α-螺旋為主，其次是延伸鏈和β-轉角。α-螺旋比例在30%～36%之間，灰蓋擬鬼傘Gel蛋白 XP_001831707.1 的最高，為35.28%，擬鬼傘中TFK30742.1的比例最低，為3096%;延伸鏈的占比在13%～17%之間，擬鬼傘中TFK30742.1的比例最高，為1655%，而TFK21138.1的最低，為1369%;β-轉角占比最低，約為5%左右;無規(guī)則卷曲占比最高，在44%～50%之間。除擬鬼傘中TFK21138.1和小脆柄菇RXW23863.1在C端具有跨膜區(qū)域，其他Gel蛋白均不含跨膜結構。所有Gel蛋白均含有GPI修飾，主要修飾位點發(fā)生在C段區(qū)域的絲氨酸殘基上（表2）。

2.3 Gel蛋白的基序分析、多序列比對及三級結構預測

4種鬼傘的Gel蛋白序列中均含有3個基序（圖1）。4種鬼傘Gel蛋白具有較高的同源性，同源性矩陣分析結果表明其同源性均在50%以上（表3）。晶粒小鬼傘和小脆柄菇的Gel蛋白同源性最高，將近80%;其次是灰蓋擬鬼傘的2個Gel蛋白，其同源性為76.2%;晶粒小鬼傘的Gel與擬鬼傘的Gel（TFK21136.1）同源性最低，但也達到了51.6%。通過Gel蛋白的多序列比對（圖2）可以看出，4種鬼傘的Gel蛋白中含有177個保守氨基酸，其中包含甘氨酸（G）和亮氨酸（L）各17個，15個酪氨酸（Y），14個絲氨酸（S），半胱氨酸（C）和脯氨酸（P）各13個，以及11個天冬酰胺（N）等。4種鬼傘的Gel 序列中均包含糖基水解酶超家族 （Glyco_hydrosuper family）和8個半胱酸-盒子（Cys-box/X8）保守域， 在C端的絲氨酸或者甘氨酸或者天冬酰胺上發(fā)生GPI修飾。使用釀酒酵母β-1，3-葡聚糖糖基轉移酶GAS2的晶體結構（261.1.A）作為模板，采用Swiss-model對4種鬼傘Gel蛋白進行在線同源建模預測分析，結果表明預測結構與模板序列相似度均在35%左右，覆蓋度約為80%，各鬼傘Gel蛋白的三級結構十分相似（圖3）。

2.4 Gel蛋白的進化分析

結合研究較多的子囊菌中的煙曲霉（Aspergillus fumigatus）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的β-1，3-葡聚糖糖基轉移酶蛋白以及擔子菌中的玉蜀黍黑粉菌（Ustilago maydis）和雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）、平菇（Pleurotus ostreatus）、灰樹花（Grifola frondosa）以及靈芝（Ganoderma boninense）的Gel同源蛋白使用MEGA 7[25]進行演化分析，采用鄰接（neighbor-joining）法推導其演化歷史[26]，得到分支長度和為8.760 563 63的最優(yōu)樹（圖4）。Bootstrap 測試設置1 000次重復，進化距離采用基于JTT矩陣的方法[27]計算，以每個位點的氨基酸取代數(shù)為單位。分析包括24個氨基酸序列。所有包含間隙和缺失數(shù)據(jù)的位置被消除。最終數(shù)據(jù)集中共有347個位置?？梢钥闯觯?種鬼傘的Gel蛋白基本按照種屬分類關系進行聚類，擬鬼傘屬聚類為一組，小鬼傘屬和小脆柄菇屬聚為一組。根據(jù)序列C端是否有半胱氨酸富集結構域，GH72家族可分為2個亞類：GH72+（含CBM43或者X8）和GH72-（沒有CBM43或者X8）[28]。所有擔子菌的Gel蛋白序列中均含有X8結構域，因此屬于GH72+。

3 討論

眾所周知，GH72家族葡聚糖轉移酶是GPI錨定修飾的細胞壁蛋白。該類蛋白在子囊菌中有較多研究，在釀酒酵母中含有5個GAS基因，白色念珠菌中含有5個PHR基因，粟酒裂殖酵母含有4個GAS基因，煙曲霉中含有7個GEL基因，稻瘟病菌中含有5個GEL基因，粗糙脈孢菌中含有5個GEL基因[29]。在本研究中除擬鬼傘外，大部分擔子菌中僅有1～2個該類基因，明顯少于子囊菌。因此，擔子菌葡聚糖轉移酶基因的生理功能可能不完全等同于子囊菌。GH72酶可分為2類[30]，GH72+酶包含葡聚糖轉移結構域和1個來自轉移酶結構域的羧基末端第2個碳水化合物結合X8或CBM43結構域。GH72-酶缺乏X8/CB43碳水化合物結合域。4種鬼傘的Gel蛋白均屬于GH72+，且均含有信號肽序列，因此，鬼傘的Gel可能在細胞周質(zhì)空間中對新添加的細胞壁組分β-1，3-葡聚糖進行修飾。Hurtado-Guerrero等首次解析了GH72+與昆布五糖和昆布七糖水解產(chǎn)物有關的ScGas2轉糖苷酶的晶體結構，結構表明存在1個（β/α）8的催化核心，緊緊地和C端CBM43葡聚糖綁定結構域相互作用，活性位點位于不常見的半胱氨酸富集的溝槽，有2個谷氨酸作為催化殘基。定點突變數(shù)據(jù)結合ScGas2-o寡糖復合體的晶體結構，表明在受體位點產(chǎn)生綁定在調(diào)節(jié)水解和轉糖苷之間的平衡至關重要[31]。該酶作用的位點包含2個催化殘基（Glu176和Glu275），和3個酪氨酸殘基（Tyr107、Tyr244、Tyr307），這些位點在GH72家族中均是保守的。去除GPI修飾位點該酶的轉糖基活性不受影響，但去除X8結構域后其不再具有轉糖基活性[30]。本研究基于已測序并有注釋信息的4種鬼傘的Gel蛋白序列，通過對鬼傘Gel蛋白的生物信息學分析，為擔子菌中Gel基因的生理功能研究奠定了基礎。

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