馬將軍，孫怡

（1.中山大學(xué)腫瘤防治中心，華南腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，腫瘤醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，分子診斷科，廣東 廣州 510060；2.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院，廣東省惡性腫瘤表觀遺傳和基因調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 兒科，廣東 廣州 510120 ）

0 引言

結(jié)直腸癌 (Colorectal carcinoma，CRC) 是我國最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，近年來，其發(fā)病率呈逐年增高的趨勢(shì)。免疫細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子在其發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。近年來，已有研究表明，Th17 細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[1]。Th17 細(xì)胞是一類不同于Th1 和Th2 的CD4+T 細(xì)胞，是由初始的CD4+T 細(xì)胞在TGF-β 和IL-6 的誘導(dǎo)下分化而來。Th17 細(xì)胞可分泌IL-17、IL-6、IL-21 等多種細(xì)胞因子[2]，其中，IL-17 是Th17 細(xì)胞主要分泌的細(xì)胞因子，IL-17 不僅促進(jìn)炎癥的發(fā)生，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展也有很大關(guān)系，但其確切作用機(jī)制尚不完全清楚。為了明確IL-17 在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中的作用及其免疫病理意義，本研究通過檢測(cè)不同分期結(jié)腸癌患者外周血中Th17細(xì)胞水平及相關(guān)細(xì)胞因子IL-17 表達(dá)的變化，探討Th17 細(xì)胞及IL-17 與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

隨機(jī)選取2020 年1 月至2020 年9 月在中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院初次住院的結(jié)直腸癌患者60 例，其中男性35 例、女性25 例，年齡29～71 歲，平均54 歲。直腸癌26 例，結(jié)腸癌34 例，所有患者均無免疫系統(tǒng)疾病史，手術(shù)前均未接受免疫治療、放療、化療及其它抗腫瘤治療，入院前1 個(gè)月內(nèi)無輸血或血制品，術(shù)后均獲得病理確診。其中，按Dukes 分期法分為A-B(I-Ⅱ)期40 例，其中高中分化腺癌26 例、低分化腺癌14 例。C-D(Ⅲ-IV)期20 例，高中分化腺癌9 例、低分化腺癌11 例；I-Ⅱ期有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移者6 例，無轉(zhuǎn)移者35 例。Ⅲ-Ⅳ期有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移者16 例，無轉(zhuǎn)移者3 例。對(duì)照組來源于同期本院健康體檢者30 例，其中男性18 例，女性12 例；年齡27～61 歲，平均47 歲。所有研究對(duì)象均無潰瘍性結(jié)腸炎、類風(fēng)濕、甲狀腺功能減退等自身免疫性疾病史、無感染性疾病以及無免疫治療史。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。本研究獲得中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 標(biāo)本采集

抽取受檢者手術(shù)前清晨空腹靜脈血3mL 和健康志愿者清晨空腹靜脈血3mL，肝素抗凝。加 Hank'S 液等體積稀釋后，用Ficoll 進(jìn)行密度梯度離心(22℃ ，800×g，20 min)。將獲得的外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs) 充分洗滌后，用RPMI1640 完全培養(yǎng)液調(diào)整PBMCs的密度為2×106/mL。

1.3 主要試劑及儀器

FITC-Anti-Human IL-17 抗 體、APC-Anti-Human CD3抗體、PE-Anti-Human CD4 抗體均購自美國BD 公司；抗人IL-17 ELISA 試劑盒購自美國R&D 公司；固定破膜劑和破膜緩沖液購自美國eBioscience 公司；Trizol 購自life technologies公司；cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTM RT reagent Kit,貨號(hào)：RR047A）購自寶生物(大連)有限公司；佛波酯(PMA)、離子霉素(Ionomycin)以及布雷桿氏菌素A(Brefeldin-A，BFA)均為Sigma 公司產(chǎn)品(美國)；RPMI1640、Hank'S 液等均購自美國GIBGO 公司；瓊脂糖（Biowest Agarose）購自北京沃比森科技有限公司；淋巴細(xì)胞分離液購自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司；酶標(biāo)儀(ELx808)為BIO-TEK 公司產(chǎn)品(美國)；普通PCR 儀(Bio-RAD)，DNA 凝膠分析系統(tǒng)(美國Wealltec)；BD FACS Calibur 流式細(xì)胞儀為美國BD 公司生產(chǎn)；FlowJo 7.6軟件購自Tree Star 公司(美國)。

1.4 ELISA 方法檢測(cè)IL-17 水平

收集不同條件下的培養(yǎng)上清液，嚴(yán)格按照IL-17 檢測(cè)試劑盒(R&D)說明書提供的方法進(jìn)行操作。IL-17 試劑盒檢測(cè)靈敏度為15pg/mL。

1.5 總RNA 提取和反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 吸取1 mL Trizol 試劑加入到細(xì)胞層中，室溫孵育5 min，加入0.2 mL 氯仿，混勻，室溫孵育2 min 后，12 000×g 于4℃離心15 min。離心后將上層無色水相層吸出保留，加入0.5mL 異丙醇?；靹?，室溫孵育10min，12 000×g 于4℃ 離心10min。去除上清，使用75%乙醇清洗沉淀，7500×g 于4℃離心5min，去除上清，空氣干燥10min。加入DEPC 水溶解 RNA，測(cè)量RNA 濃度。取1 μg RNA 進(jìn)行cDNA 反轉(zhuǎn)錄，方法根據(jù) PrimeScriptTM RT reagent Kit 試劑盒說明書進(jìn)行。引物由上海生工生物工程有限公司合成，其中，IL-17 的上、下游引物序列分別為：5'-ATG ACT CCT GGG AAG ACC TCA-3' 和5'-TTA GGC CAC ATG GTG GAC AAT CGG-3'； GAPDH 的上、下游引物序列分別為：5'-GCA TGG CCT TCC GTG TCC-3' 和5'-TGA GTG TGG CAG GGA CTC-3'。反應(yīng)體系：12.5μL Taq PCR Mastermix(天根生化科技有限公司)，上、下游引物各0.5μL （10μM）, 2μl cDNA(5 ng/μl),ddH2O 9.5μL,總體積25μL。PCR 擴(kuò)增條件如下：95℃預(yù)變性5min，然后進(jìn)入35 個(gè)循環(huán)，包括95℃30S，58℃30S，72℃30S，最后72℃延伸5min。將5μL 擴(kuò)增產(chǎn)物于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%瓊脂糖凝膠電泳，DNA 凝膠分析系統(tǒng)觀察照相。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞Th17 細(xì)胞的含量

細(xì)胞充分洗滌后，完全RPMI1640 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×106/mL， 加 入PMA(20ng/mL)1μL，Ionomycin(1μg/mL)1μL，置 于37 ℃培 養(yǎng) 箱 中 刺 激4h，加 入BFA(10mg/mL)1μL，置于37℃培養(yǎng)箱中刺激8h 后，收集細(xì)胞，用PBS 洗滌2 次，去上清后每管100μL 重懸細(xì)胞，分別加入不同熒光素標(biāo)記的抗CD3 和CD4 單克隆抗體，4℃避光反應(yīng)30min。孵育結(jié)束后，PBS 洗2 次，加入固定劑500μL，4℃避光孵育8min，PBS 洗2 次，加入100μL 破膜劑重懸細(xì)胞，4℃避光過夜，次日加入PEanti-humanIL-17 抗體，混勻，4℃避光孵育30min，PBS 洗滌棄上清后，用100μL 的PBS 重懸準(zhǔn)備上機(jī)檢測(cè)。應(yīng)用流式細(xì)胞檢測(cè)儀(BD FACS Calibur)檢測(cè)細(xì)胞，F(xiàn)lowJo 7.6 軟件分析結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，所有檢測(cè)結(jié)果均以±s 表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行比較；相關(guān)分析為計(jì)數(shù)資料的相關(guān)分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血單個(gè)核細(xì)胞中IL-17 mRNA 的表達(dá)

PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-17 mRNA 在健康對(duì)照組中表達(dá)最低，在Ⅰ-Ⅱ期組中表達(dá)較高，而在Ⅲ-IV 期組表達(dá)最高，且三組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。說明IL-17 mRNA 表達(dá)水平的變化與腫瘤分期緊密相關(guān)。PCR 電泳圖和統(tǒng)計(jì)圖分別見圖1、圖2。

圖1 PCR 技術(shù)檢測(cè)CRC 患者與健康對(duì)照組外周血中IL-17 mRNA表達(dá)情況

圖2 PCR 技術(shù)檢測(cè)CRC 患者與健康對(duì)照組外周血中IL-17 mRNA表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)圖

2.2 CRC 患者及健康對(duì)照組血清中IL-17 含量的測(cè)定

ELISA 結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌Ⅰ- Ⅱ期組和Ⅲ-IV 期組血清中IL-17 的濃度分別為(42.46±15.62)ng/L 和(97.55±20.12) ng/L，均明顯高于健康對(duì)照組(18.74±7.82)ng/L，三組之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖3。

圖3 ELISA 技術(shù)檢測(cè)CRC 患者與健康對(duì)照組血清中IL-17 含量水平統(tǒng)計(jì)圖

2.3 不同實(shí)驗(yàn)組外周血中IL-17 表達(dá)水平與臨床病理特征之間的關(guān)系

通過ELISA 實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)的結(jié)果顯示，血清中IL-17 含量水平與腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes 分期及腫瘤分化程度明顯相關(guān)(P＜0.01)；與患者性別、年齡、腫瘤部位無關(guān)，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1、圖4。

表1 不同實(shí)驗(yàn)組外周血中IL-17 表達(dá)水平與臨床病理特征間的關(guān)系

圖4 血清中IL-17 表達(dá)水平與臨床多個(gè)指標(biāo)相關(guān)性分析

2.4 不同組份PBMCs 中Th17 細(xì)胞的表達(dá)情況

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，未經(jīng)刺激的空白對(duì)照組幾乎無Th17 細(xì)胞的表達(dá)；而經(jīng)過PMA+Ionomycin 刺激后，Ⅲ-IV期組表達(dá)Th17 細(xì)胞數(shù)量要高于Ⅰ-Ⅱ期組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且二者均高于健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見圖5、圖6。

3 討論

腫瘤能嚴(yán)重威脅人類健康，在我國，惡性腫瘤已經(jīng)成為疾病患者首位致死主要病因。目前，腫瘤早期診斷與治療已經(jīng)成為許多研究學(xué)者的關(guān)注重點(diǎn)，而免疫治療在繼手術(shù)、放化療之后，逐漸成為一種新興的腫瘤治療方法，其主要作用是激發(fā)和調(diào)動(dòng)機(jī)體免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境抗腫瘤的免疫力，控制并殺傷腫瘤細(xì)胞。作為機(jī)體適應(yīng)性免疫反應(yīng)中重要的效應(yīng)細(xì)胞，Th17 細(xì)胞在免疫調(diào)解中發(fā)揮著重要作用，但其在腫瘤中的確切作用機(jī)制仍不十分明確。根據(jù)細(xì)胞因子和生物功能特征的不同，可將CD4+T 細(xì)胞分為Th1，Th2 及Th17 等多個(gè)亞群，其中，Th17 細(xì)胞主要由TGF-β 和IL-6 誘導(dǎo)分化[3]，而成熟的Th17 細(xì)胞可在IL-23 存在的環(huán)境下發(fā)生增殖[4]。成熟的Th17 細(xì)胞常被視為促炎細(xì)胞，可分泌多種炎癥因子，如IL-17，IL-6，IL-21,IL-22 和IL-23 等，這些炎癥因子能有效地介導(dǎo)炎癥細(xì)胞到局部浸潤和造成組織損傷。而IL-17 作為Th17 細(xì)胞特征性細(xì)胞因子，其表達(dá)水平的高低主要受控于Th17 細(xì)胞數(shù)量與功能活性的影響。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CRC 患者與健康對(duì)照組外周血中Th17 細(xì)胞含量的變化

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CRC 患者與健康對(duì)照組外周血中Th17 細(xì)胞含量變化的統(tǒng)計(jì)圖

雖然Th17 細(xì)胞廣泛存在于腫瘤微環(huán)境中，但是其在腫瘤免疫中所發(fā)揮的功能作用仍存在著分歧。有研究發(fā)現(xiàn)，癌癥患者腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中Th17 細(xì)胞數(shù)量顯著高于非腫瘤組織[5]，也有研究認(rèn)為，在前列腺癌中Th17 細(xì)胞數(shù)量隨腫瘤進(jìn)展而下降[6]。此外，在Th17 細(xì)胞發(fā)揮抗癌作用的研究中，其分泌的細(xì)胞因子IL-17 所發(fā)揮的作用最讓人困惑。研究表明,在腫瘤微環(huán)境中，IL-17 可能擁有二重角色[7]，一方面其可促進(jìn)腫瘤相關(guān)血管生成，使腫瘤體內(nèi)微血管數(shù)量和密度顯著增加，更有利于腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和浸潤[8]；另一方面，Th17 細(xì)胞可促進(jìn)抗腫瘤免疫應(yīng)答，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[9]。

目前，國內(nèi)外已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道Th17 細(xì)胞在結(jié)腸癌患者外周血中的表達(dá)情況，提示Th17 細(xì)胞可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10,11]。

本研究為了揭示Th17 細(xì)胞在CRC 患者中所發(fā)揮的免疫學(xué)作用，檢測(cè)了不同受試者外周血中Th17 細(xì)胞的數(shù)量及細(xì)胞因子IL-17 表達(dá)的情況。結(jié)果顯示，CRC 患者外周血Th17細(xì)胞水平均較正常組升高，且Ⅲ-Ⅳ期組患者Th17 細(xì)胞比例顯著高于Ⅰ-Ⅱ期組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示CRC 患者體內(nèi)存在Th17 細(xì)胞與疾病的進(jìn)展呈正相關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，外周血中細(xì)胞因子IL-17 表達(dá)水平與CRC 患者腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes 分期及腫瘤分化程度相關(guān)，差異據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而Th17 與CRC 性別、年齡無關(guān)、腫瘤部位無相關(guān)（P＞0.05）。因此，我們認(rèn)為Th17細(xì)胞在結(jié)腸癌病情進(jìn)展中發(fā)揮著重要的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，Th17 細(xì)胞和IL-17 具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用，這與先前文獻(xiàn)報(bào)道的一致[12]，其主要原因可能是Th17 細(xì)胞和IL-17 參與誘導(dǎo)腫瘤血管生成和提高腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞因子的表達(dá)而產(chǎn)生促腫瘤生長作用。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-17 主要是通過誘導(dǎo)血管生成因子，如VEGF、PGE2、角質(zhì)化細(xì)胞衍生趨化因子等，導(dǎo)致腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤發(fā)展[13]。另外，IL-17 可誘導(dǎo)IL-6 生成，后者可激活致瘤信號(hào)通路（STAT-3），從而上調(diào)促存活和促血管生成基因的表達(dá)，以此參與腫瘤血管生成[14]。

綜上所述，Th17 細(xì)胞和IL-17 改變了人們對(duì)腫瘤免疫的認(rèn)識(shí)，隨著研究的進(jìn)一步深入，Th17 細(xì)胞和IL-17 極有可能成為腫瘤治療的有效治療靶點(diǎn)，也可能成為預(yù)測(cè)結(jié)腸癌患者預(yù)后、生存期及死亡率的重要分子標(biāo)記，但其在結(jié)腸癌治療過程中所發(fā)揮的免疫調(diào)控作用及具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的探討研究。