孫慧，程銳，程憲偉，閻百興，祝惠*

（1. 中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所/中國科學(xué)院濕地生態(tài)與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130102；2. 中國科學(xué)院大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100049）

種子萌發(fā)和幼苗生長是植物生命周期的關(guān)鍵階段，種子在鹽堿環(huán)境下的發(fā)芽能力和幼苗生長情況將直接影響其群落的發(fā)育和退化濕地恢復(fù)效果，進(jìn)而影響濕地生態(tài)功能。但鹽堿脅迫等不利條件下，植物種子萌發(fā)經(jīng)常受到抑制。因此，研究濕地植物在鹽堿脅迫下的催芽方法可為不同類型退化鹽堿濕地植被恢復(fù)提供適宜的技術(shù)參考。目前，國內(nèi)外針對種子萌發(fā)的研究多集中于不同鹽度、溫度、光照等影響因素對種子萌發(fā)的影響[1-2]。近年來，對種子休眠與萌發(fā)機(jī)制的研究也逐漸增多，例如，Zaynab等[3]通過對比蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)能量缺乏是青岡（Cyclobalanopsis gilva）種子萌發(fā)率低的主要原因；Duclos等[4]通過鑒定不同柳枝稷（Panicum virgatumL.）結(jié)構(gòu)對種子萌發(fā)的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源抑制和外源抑制綜合作用導(dǎo)致柳枝稷種子無法萌發(fā)；杜小芳等[5]發(fā)現(xiàn)甘草（Glycyrrhiza inflateBatal）種子休眠原因主要是外源抑制休眠，即物理性種殼休眠。然而，針對常見濕地植物催芽方法的報(bào)道仍相對較少。不同催芽方法的效果因植物種類不同而有所差異。因此，有必要研究不同催芽方法對濕地植物種子發(fā)芽效果的影響。此外，現(xiàn)有針對植物催芽效果的研究主要是以發(fā)芽率為判定指標(biāo)[6-7]，而鹽堿脅迫還會破壞植物細(xì)胞生理機(jī)能，影響植物株高、生物量、葉綠素含量指數(shù)等指標(biāo)[8-10]，因此，有必要將上述多個指標(biāo)納入到催芽效果評估當(dāng)中。

香 菇 草（Hydrocotyle vulgaris）和 梭 魚 草（Pontederia cordata）兩種典型濕地植物的種子萌發(fā)和幼苗生長對鹽堿脅迫較為敏感，在鹽堿脅迫下的種子自然發(fā)芽率較低[11-13]，在電導(dǎo)率（EC）為5 dS/m的溶液中，其種子自然萌發(fā)率均為0%[14]。且兩種植物廣泛分布于溫暖濕潤、光照充足的河濱濕地，并常用于濕地污水凈化工程。因此，本文以香菇草、梭魚草作為供試植物，通過光照培養(yǎng)箱和土培模擬試驗(yàn)，評估不同催芽方法對兩種植物種子在不同強(qiáng)度鹽堿環(huán)境下的催芽效果及其對早期幼苗生長的影響，進(jìn)而篩選出適宜于兩種典型濕地植物的最優(yōu)催芽方法。本研究將為退化鹽堿濕地的植被恢復(fù)和濕地生態(tài)工程的構(gòu)建提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2016年8月進(jìn)行。選取香菇草和梭魚草作為供試植物，植物種子于2015年12月采購于江蘇省宿遷市。為了避免細(xì)菌污染，確保試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，在試驗(yàn)開始前對所有試驗(yàn)用具進(jìn)行高溫滅菌處理，同時對香菇草、梭魚草種子采用滅菌劑浸泡殺菌。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 試驗(yàn)準(zhǔn)備 綜合考慮抑制香菇草、梭魚草植物種子發(fā)芽的主要因素（如種皮硬實(shí)、蠟質(zhì)化、休眠等），參考程憲偉[14]研究結(jié)果，以及可查催芽技術(shù)的有效性[15-16]，設(shè)計(jì)機(jī)械法T1（去除種子部分種衣）、熱水浴法T2（將種子在40 ℃的恒溫水浴鍋中浸泡30 min）、甘露醇法T3（用0.001 mol/L甘露醇浸泡種子72 h）、乙烯利法T4（用0.001 mol/L乙烯利浸泡種子24 h）、熱水浴法+乙烯利法T5（在40℃恒溫水浴鍋中浸泡30 min后用0.001 mol/L乙烯利浸泡種子24 h）5種濕地植物種子催芽方法[15-18]。分別采用NaCl和NaHCO3配制溶液，模擬兩種不同鹽堿脅迫。其中，NaCl代表鹽脅迫，NaHCO3代表堿脅迫。兩種溶液EC值和pH的關(guān)系如表1。根據(jù)以往關(guān)于鹽堿濕地的鹽堿度調(diào)查結(jié)果，EC值大多在4～19.18 dS/m之間[19-20]，每種類型鹽堿脅迫設(shè)置4個EC梯度，分別是5、7.5、10、15 dS/m。測試5種催芽方法的催芽效果（以發(fā)芽率為表征指標(biāo)）及生長效果（以芽長/株高、葉綠素含量指數(shù)、生物量為表征指標(biāo)）。試驗(yàn)中EC值均校正為25 ℃下的值，校正公式如下[14]：

式中：ECT表示T℃時的電導(dǎo)率，EC25表示25 ℃時的電導(dǎo)率，α為常數(shù)，數(shù)值為0.018 7。

表1 NaCl量與EC值和pH的關(guān)系Table 1 Electrical conductivity and pH for the NaCl concentration in mass percent

1.2.2 催芽試驗(yàn) 本研究包含光照培養(yǎng)箱試驗(yàn)和土培試驗(yàn)。光照培養(yǎng)箱催芽試驗(yàn)的容器選用直徑9 cm的培養(yǎng)皿。培養(yǎng)箱環(huán)境設(shè)置為：白天溫度25 ℃、光照22 000 Lx，12 h；夜晚溫度15 ℃、光照0 Lx，12 h；以24 h為一個周期。試驗(yàn)中，在培養(yǎng)皿底部鋪一層單層濾紙，滴入配制好的鹽堿溶液，將經(jīng)過5種催芽方法處理的香菇草、梭魚草種子各30粒均勻擺放在濾紙上，用封口膜密封后放入光照培養(yǎng)箱，每個處理設(shè)置3個平行。每24 h統(tǒng)計(jì)一次發(fā)芽數(shù)，植物發(fā)芽后，記錄芽長，測定葉綠素含量指數(shù)。植物種子的發(fā)芽率用以下公式計(jì)算[14]：

式中：Ng表示發(fā)芽種子總數(shù)，Nt表示供試種子總數(shù)。

土培實(shí)驗(yàn)在中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所控溫溫室內(nèi)進(jìn)行，采集中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所綜合農(nóng)田試驗(yàn)場土壤，經(jīng)過篩選、研磨后，裝入11 cm（長）×9 cm（寬）×10 cm（高）的塑料盆，土壤深度7 cm。塑料盆放置于距地面1.5 m高的鐵架上。溫室環(huán)境設(shè)置為：白天溫度（25±3） ℃，夜間溫度（15±3） ℃，空氣相對濕度40%～50%。土壤pH為8.08～8.18。試驗(yàn)中，對塑料盆噴灑50 mL的鹽堿溶液至土壤完全濕潤，放入經(jīng)催芽處理的植物種子（30粒/盆），表層覆蓋3～5 mm薄土，每3 d噴灑一次10 mL的含鹽堿溶液并統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)，記錄植物株高和葉綠素含量指數(shù)，試驗(yàn)結(jié)束后，對植物烘干處理，記錄各處理組植物生物量。使用Origin 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同催芽方法在鹽堿脅迫下對濕地植物種子的催芽效果

2.1.1 鹽脅迫 在光照培養(yǎng)箱試驗(yàn)中（圖1a、圖1b），經(jīng)機(jī)械法（T1）處理的香菇草種子，其萌發(fā)率在中度鹽脅迫下（EC = 7.5 dS/m）高于其他處理組；而梭魚草種子經(jīng)熱水浴法+乙烯利法（T5）處理，其萌發(fā)率在低度鹽脅迫下（EC = 5 dS/m）高于其他處理組；經(jīng)甘露醇法（T3）處理的種子，萌發(fā)率則隨著鹽度升高而顯著降低（p＜ 0.05）。在土培試驗(yàn)中（圖1c、圖1d），經(jīng)機(jī)械法（T1）和熱水浴法（T2）處理的香菇草種子在低度鹽脅迫下（EC= 5 dS/m）萌發(fā)率高于其他處理組；而梭魚草種子經(jīng)熱水浴法+乙烯利法（T5）處理，在中度鹽脅迫下（EC= 7.5 dS/m）萌發(fā)率顯著高于其他處理組（p＜ 0.05）。鹽脅迫下，香菇草種子更適于物理催芽方法，梭魚草種子更適于物化結(jié)合催芽方法?？傮w來看，對香菇草、梭魚草種子催芽效果較好的方法為機(jī)械法（T1）和熱水浴法+乙烯利法（T5）。

2.1.2 堿脅迫 在光照培養(yǎng)箱試驗(yàn)中，香菇草種子僅在對照組無堿溶液中萌發(fā)，且整體發(fā)芽率較低（小于20%）；梭魚草種子雖在堿溶液中得以萌發(fā)，但萌發(fā)率均很低（小于10%），說明香菇草和梭魚草耐堿能力均較差。在土培試驗(yàn)中，經(jīng)機(jī)械法（T1）和乙烯利法（T4）處理的香菇草種子在低度堿脅迫下（EC= 5 dS/m）萌發(fā)率顯著高于其余處理組（p＜0.05）。梭魚草種子經(jīng)熱水浴法+乙烯利法（T5）處理，其萌發(fā)率在低度堿脅迫下（EC= 5 dS/m）達(dá)33.33%，顯著高于其余處理組（p＜ 0.05）?？傮w來看，對香菇草種子催芽效果較好的方法為機(jī)械法（T1）和乙烯利法（T4）；對梭魚草種子催芽效果較好的方法為熱水浴法+乙烯利法（T5）（圖2）。

2.2 不同催芽方法在鹽堿脅迫下對濕地植物種子催芽后生長效果的影響

2.2.1 鹽脅迫 在光照培養(yǎng)箱試驗(yàn)中（圖3），經(jīng)機(jī)械法（T1）處理的香菇草和梭魚草種子發(fā)芽后，其葉綠素含量指數(shù)在低度鹽脅迫下（EC= 5 dS/m）高于其余處理組，更適合光照培養(yǎng)箱中香菇草和梭魚草種子的發(fā)芽。在土培試驗(yàn)中（圖4），香菇草種子經(jīng)熱水浴法（T2）處理后，其幼苗葉綠素含量指數(shù)和株高在低度鹽脅迫下（EC = 5 dS/m）顯著高于其余處理組（p＜ 0.05）。梭魚草種子經(jīng)乙烯利法（T4）處理后，其幼苗葉綠素含量指數(shù)和株高在低度鹽脅迫下（EC = 5 dS/m）顯著高于其余處理組（p＜ 0.05）；經(jīng)機(jī)械法（T1）處理的梭魚草種子，其發(fā)芽后植株生物量在鹽溶液中顯著低于無鹽對照（p＜ 0.05）。綜合種子發(fā)芽后的生長情況，熱水浴法（T2）和乙烯利法（T4）更有利于促進(jìn)供試植物種子發(fā)芽后的幼苗生長。

2.2.2 堿脅迫 堿脅迫比鹽脅迫對植物種子萌發(fā)的抑制效果更強(qiáng)[14]。在光照培養(yǎng)箱試驗(yàn)中（圖5），僅觀測到香菇草種子在無堿對照組的發(fā)芽數(shù)據(jù)。梭魚草種子經(jīng)乙烯利法（T4）和熱水浴法+乙烯利法（T5）處理后，其幼苗葉綠素含量指數(shù)、芽長在低度堿脅迫下（EC= 5 dS/m）高于其余處理組；且經(jīng)乙烯利法（T4）處理，堿脅迫梯度的增大對梭魚草幼苗的影響并不顯著，說明在高度堿脅迫環(huán)境中，乙烯利法（T4）可以有效促進(jìn)梭魚草種子的發(fā)芽。在土培試驗(yàn)中（圖6），香菇草和梭魚草種子經(jīng)熱水浴法（T2）處理，其幼苗葉綠素含量指數(shù)和株高在低度堿脅迫下（EC = 5 dS/m）高于其余處理組。經(jīng)乙烯利法（T4）處理的香菇草種子，其幼苗生物量在低度堿脅迫下（EC = 5 dS/m）高于其余處理組。僅經(jīng)機(jī)械法（T1）處理的梭魚草種子，其發(fā)芽后植株生物量在堿脅迫下顯著（p＜ 0.05）低于無鹽對照。整體而言，熱水浴法（T2）和乙烯利法（T4）更有利于促進(jìn)香菇草、梭魚草種子發(fā)芽后的幼苗生長。

對比鹽脅迫和堿脅迫下香菇草和梭魚草種子萌發(fā)及幼苗生長情況，本研究發(fā)現(xiàn)堿脅迫比鹽脅迫的抑制能力更強(qiáng)。在光照培養(yǎng)箱試驗(yàn)中，香菇草和梭魚草種子在NaCl溶液中的平均萌發(fā)率比在NaHCO3溶液中更高；香菇草種子在鹽脅迫下萌發(fā)而在堿脅迫下無法萌發(fā)（圖1a，圖2a）。在鹽脅迫下，梭魚草幼苗葉綠素含量指數(shù)平均值為1.12，高于堿脅迫處理組（0.66）（圖3，圖5）。在土培試驗(yàn)中，由于土壤的稀釋作用，鹽堿脅迫對濕地植物種子幼苗生長幾乎無影響。

3 討論

3.1 不同催芽方法對植物種子發(fā)芽率的影響

不同植物種子休眠的原因不同，因此應(yīng)該有針對性的選擇催芽方法。一般種子休眠的原因可以分為三類：一類是種皮的限制，許多植物種子經(jīng)過長期自然選擇，種皮厚實(shí)不透水，不能吸水撐破種皮，難以萌發(fā)[5]，針對這類植物種子，通過物理法可解除種子休眠；一類是種胚的影響，植物種子的胚未完全發(fā)育或雖外表成熟但胚內(nèi)缺乏酶、激素等化合物也會引起種子的休眠，使種子不能在正常環(huán)境條件下萌發(fā)，通過對這類種子進(jìn)行后熟處理，可使其具備萌發(fā)條件[16]；此外，一些植物種子內(nèi)鹽類、醛類、酚類等抑制物質(zhì)的存在也會影響種子的萌發(fā)[16]，可通過化學(xué)法解除種子休眠。研究發(fā)現(xiàn)，物理法對苦豆子（Sophora alopecuroidesL.）種子、化學(xué)法對煙草（Nicotiana tabacumL.）種子的萌發(fā)均起到促進(jìn)作用[5,21]。因此，本研究中，對供試植物香菇草、梭魚草的種子，分別采取物理（機(jī)械法、熱水浴法）、化學(xué)（甘露醇法、乙烯利法）、物化結(jié)合（熱水浴法+乙烯利法）等方法，在理論上能夠達(dá)到促進(jìn)催芽的效果，并在試驗(yàn)中得到驗(yàn)證。

鹽堿脅迫下，對香菇草、梭魚草種子催芽效果較好的方法為機(jī)械法（T1）、乙烯利法（T4）、熱水浴法+乙烯利法（T5）。機(jī)械法可磨破種皮，為種子發(fā)芽創(chuàng)造條件，同時磨去種皮外的蠟質(zhì)，從而促進(jìn)種子萌發(fā)[16]。乙烯利處理可促進(jìn)需后熟和內(nèi)含發(fā)芽抑制物的種子，加速抑制物分解，在高鹽環(huán)境中促進(jìn)種子萌發(fā)[16]。這可能是因?yàn)橐蚁├龠M(jìn)種子內(nèi)化合物發(fā)生了一系列的生理反應(yīng)，從而促進(jìn)種子萌發(fā)。有些植物種子無效于單一催芽方法，需同時采用幾種催芽方法才能促進(jìn)其萌發(fā)。Riley[22]研究證實(shí)，溫度由23 ℃升至41 ℃時，細(xì)胞能量狀態(tài)和酶活性會發(fā)生顯著變化。水能軟化種皮，增加種子滲透性。因此，本研究中，采用熱水浴法+乙烯利法既可消除供試種子種皮硬實(shí)的限制，又可緩解種子內(nèi)化合物質(zhì)的抑制，有效促進(jìn)種子的萌發(fā)。本研究中，鹽脅迫下香菇草和梭魚草種子經(jīng)甘露醇法（T3）催芽處理后，發(fā)芽率隨鹽脅迫梯度增大而減小。這可能是由于鹽脅迫抵消了甘露醇調(diào)節(jié)滲透壓的效應(yīng)。

3.2 不同催芽方法對植物幼苗生長效果的影響

鹽脅迫會引起植物生理代謝紊亂，致使生長受到明顯抑制，抑制程度取決于脅迫的強(qiáng)度和植物在不同時期的耐鹽能力[23]。本研究中，不僅測試了植物在鹽堿脅迫下的發(fā)芽率，還測定了葉綠素含量指數(shù)、株高、生物量等幼苗生長指標(biāo)。整體而言，熱水浴法（T2）、甘露醇法（T3）、乙烯利法（T4）更有利于促進(jìn)香菇草和梭魚草種子發(fā)芽后的幼苗生長。高鹽脅迫產(chǎn)生高滲透壓，引起光合活性降低、氣孔孔徑減少、葉綠素降解酶的活性增高等生理變化[10,24]，使植物體內(nèi)葉綠素含量減少。鹽分脅迫使植物生長發(fā)育遲緩，抑制植物組織和器官的生長和分化[25]，植物幼苗吸收過量的鹽分形成高滲透壓，抑制幼苗生長[26]。此外，高鹽脅迫影響細(xì)胞吸收和積累離子，破壞細(xì)胞功能分子，影響植物株高的生長，減少植物的生物量[8-9]。甘露醇能在鹽堿脅迫下維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓[27]，Yang等[28]研究證實(shí)，甘露醇處理能顯著提高植物幼苗的萌發(fā)能量、芽長、根長、干重、鮮重和葉綠素含量，這在本研究中也得到了驗(yàn)證。乙烯利是植物生長調(diào)節(jié)劑[29]，在本研究中，乙烯利法（T4）有效地改善了植物幼苗的生長情況。

3.3 鹽堿脅迫對植物種子萌發(fā)的影響

一些植物種子的萌發(fā)需要一定的鹽分供給[14]。本研究中，香菇草、梭魚草種子均在EC為5 dS/m的鹽堿溶液中表現(xiàn)出相對較高的萌發(fā)率。低鹽會促進(jìn)種子胚根、胚芽不同程度的生長，這種現(xiàn)象可能與低鹽促進(jìn)細(xì)胞膜滲透調(diào)節(jié)有關(guān)，也可能與微量的無機(jī)離子對呼吸酶有激活作用有關(guān)[23]。高鹽堿脅迫會抑制種皮吸脹，阻礙種子萌發(fā)，同時擾亂植物體內(nèi)的離子穩(wěn)態(tài)，造成分子損傷抑制植物的繁殖[23]，增加細(xì)胞膜透性導(dǎo)致細(xì)胞系統(tǒng)破裂、細(xì)胞死亡，最終導(dǎo)致植株的死亡。本研究中，隨堿脅迫梯度增大，梭魚草種子的發(fā)芽率逐漸減小直至為0。香菇草種子在堿脅迫下的發(fā)芽情況僅出現(xiàn)在光照培養(yǎng)箱試驗(yàn)對照組，這與土壤的稀釋作用與離子調(diào)節(jié)有關(guān)[14]。王偉華和姜黎[30]研究發(fā)現(xiàn)NaHCO3導(dǎo)致的高pH對植物的毒害作用遠(yuǎn)強(qiáng)于含等Na+濃度的NaCl溶液。堿脅迫比鹽脅迫對種子的抑制能力更強(qiáng)[14,31-32]，這是因?yàn)榈蜐舛鹊腘aCl溶液促進(jìn)種子胚根的生長，與之相反，NaHCO3溶液的高pH值抑制根部細(xì)胞分裂和細(xì)胞伸長，進(jìn)而抑制植物的生長和生物量[14]。

4 結(jié)論

本文通過光照培養(yǎng)箱和土培試驗(yàn)，綜合研究了不同催芽方法對香菇草、梭魚草種子在不同強(qiáng)度鹽堿環(huán)境下的催芽效果及其對早期幼苗生長的影響，主要得出如下結(jié)論：

1）在鹽堿脅迫環(huán)境下，機(jī)械法、乙烯利法更適合香菇草種子的發(fā)芽，熱水浴法+乙烯利法更適于梭魚草種子的發(fā)芽。

2）5種催芽方法對于幼苗生長指標(biāo)（植株葉綠素含量指數(shù)、芽長、生物量）的影響各有不同。經(jīng)機(jī)械法和乙烯利法處理后，鹽溶液中的香菇草幼苗葉綠素含量指數(shù)高于無鹽對照；高鹽（EC為10 dS/m和15 dS/m）脅迫下，土培環(huán)境中經(jīng)過不同催芽處理的梭魚草幼苗的株高和生物量均幾乎為0；經(jīng)催芽處理后，香菇草幼苗生物量在鹽脅迫下高于無鹽對照。

3）鹽堿脅迫下，低鹽（EC= 5 dS/m）溶液會對兩種植物種子的萌發(fā)起到促進(jìn)作用。

4）堿脅迫下，香菇草種子在光照培養(yǎng)箱中無法萌發(fā)，其耐堿能力較弱。本研究將為退化鹽堿地植被恢復(fù)和濕地工程構(gòu)建提供科學(xué)技術(shù)支撐。