林美芬,鄭 毅*,王曉彤,許旭萍**,王維奇

富炭硅肥對水稻土鐵還原菌群落特征的影響

林美芬1,鄭 毅1*,王曉彤1,許旭萍1**,王維奇2,3

(1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,福建 福州 350117；2.福建師范大學(xué)地理研究所,福建 福州 350007；3.福建師范大學(xué)濕潤亞熱帶生態(tài)地理過程教育部重點實驗室,福建 福州 350007)

為了探究富炭硅肥施加處理對稻田土壤鐵還原菌相對豐度、多樣性及群落結(jié)構(gòu)的影響,以福州平原稻田為研究對象,分別設(shè)置對照組及3種不同劑量(300,600和900kg/hm2)富炭硅肥施加處理組.研究結(jié)果表明:施加富炭硅肥有助于土壤鐵還原菌的生長和繁殖,其中600kg/hm2施加處理對鐵還原菌的生長影響最為顯著(<0.05).由Shannon指數(shù)可知,3種施加處理均使晚稻拔節(jié)期土壤鐵還原菌多樣性有所下降,以300kg/hm2施加處理組多樣性指數(shù)降低最為明顯,較對照組降低了29.4%.在早、晚稻拔節(jié)期土壤中共鑒定出5個菌門,其中變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)的占比之和平均高達(dá)95%以上,是稻田土壤中的優(yōu)勢菌門.施加富炭硅肥后,早稻拔節(jié)期土壤中擬桿菌屬()的相對豐度顯著提高(<0.05),而厭氧粘細(xì)菌屬()的相對豐度則有所降低.此外,環(huán)境因子與稻田土壤鐵還原菌的相對豐度具有相關(guān)性,的相對豐度與土壤pH值呈顯著正相關(guān)(<0.05),的相對豐度與土壤溫度(ST)呈顯著正相關(guān)(<0.05).

富炭硅肥；鐵還原菌；多樣性；群落結(jié)構(gòu)；稻田

稻田土壤是溫室氣體的主要來源,對全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境功能維持具有重要意義,其周期性的干濕交替會產(chǎn)生氧化還原反應(yīng),影響各種具有氧化還原活性的元素進(jìn)行生物地球化學(xué)循環(huán)元素.其中異化Fe(Ⅲ)還原就是發(fā)生在厭氧沉積物及淹水稻田中重要的微生物學(xué)過程,是多種細(xì)菌和古菌在厭氧條件下以有機物為電子供體,Fe(Ⅲ)為呼吸鏈末端電子受體,在氧化有機物質(zhì)的過程中將電子傳遞給Fe(Ⅲ),從而對生物地球化學(xué)過程產(chǎn)生影響[1-3].有研究表明,Fe(Ⅲ)氧化物是水稻土中含量最豐富的氧化物,可通過異化Fe(Ⅲ)還原促進(jìn)鐵還原菌對不穩(wěn)定可溶性有機物(DOM)的生物修飾和礦化作用來驅(qū)動水稻土的碳循環(huán),減少氣態(tài)碳的排放和DOM的化學(xué)多樣性[4].鐵還原菌也可以利用產(chǎn)甲烷菌常用的電子供體(如乙酸、氫氣)還原Fe(Ⅲ),在鐵還原菌和產(chǎn)甲烷菌同時存在的環(huán)境中,二者會由于競爭電子供體而抑制甲烷的產(chǎn)生與排放[5].由此可知,微生物鐵還原在稻田溫室氣體產(chǎn)生與排放、物質(zhì)循環(huán)與肥力演變等過程中發(fā)揮重要作用.

隨著我國經(jīng)濟快速發(fā)展及環(huán)境與資源問題日益突出,工、農(nóng)業(yè)廢棄物處理還田再利用成為目前國內(nèi)外的研究熱點.生物炭作為有效的土壤改良劑,施加于旱地土壤中,可以增加土壤的持水性和孔隙度,促進(jìn)植物根系的生長[6].黃超等[7]研究表明紅壤施用生物炭能明顯提高土壤水穩(wěn)定性團(tuán)聚體數(shù)量,增強土壤保肥能力,降低土壤容重.許多研究也表明,生物炭能夠調(diào)節(jié)土壤pH值并提高土壤肥力[8],增加農(nóng)作物產(chǎn)量[9],同時還可以改善土壤理化性質(zhì)[10],促進(jìn)微生物生長[11].此外,Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn),工業(yè)廢棄物爐渣能夠有效降低CH4的排放,提高稻田土壤碳的固存,從而提高水稻產(chǎn)量.Ali等[13]也證實了鋼鐵爐渣施加于稻田能夠有效減緩CH4的產(chǎn)生與排放,同時還能改善土壤環(huán)境,增加土壤養(yǎng)分含量并提高稻田生產(chǎn)力.目前,大多數(shù)研究主要集中在探究廢棄物對土壤理化性質(zhì)及減排效應(yīng)的影響,而忽略了鐵還原菌在控制水稻土碳循環(huán)的過程中發(fā)揮的重要作用及其參與介導(dǎo)的異化鐵還原過程與水稻土中有機質(zhì)分解的密切關(guān)系.因此,研究工、農(nóng)業(yè)廢棄物對稻田土壤中鐵還原菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)的影響具有深遠(yuǎn)意義.

前期研究證實了爐渣與生物炭的施加在處理工、農(nóng)業(yè)廢棄物的同時,能夠有效提高稻田土壤碳固持并減少溫室氣體排放[14-15],更進(jìn)一步探究了其對土壤鐵還原菌群落結(jié)構(gòu)及鐵代謝活性等產(chǎn)生的影響[16].但是,由于生物炭質(zhì)量較輕,施加于土壤中易隨水分流失,因此前期自主研發(fā)以廢棄物為原料的土壤改良劑——將生物炭和爐渣進(jìn)行復(fù)合造粒制成富炭硅肥.本文以福州平原稻田為研究對象,借助高通量測序平臺,分析比較不同施加量富炭硅肥處理對稻田土壤鐵還原菌豐度、多樣性及群落結(jié)構(gòu)組成的影響,以及稻田土壤環(huán)境因子與鐵還原菌群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性,旨在探究富炭硅肥對稻田土壤鐵還原菌的影響機制,為工、農(nóng)業(yè)廢棄物再利用提供依據(jù),并為富炭硅肥應(yīng)用于稻田提供理論支持.

1 研究區(qū)與研究方法

1.1 研究區(qū)概況

本實驗于福建省倉山區(qū)農(nóng)科院水稻研究所吳鳳綜合實驗基地(26.1°N,119.3°E)內(nèi)進(jìn)行,該實驗基地共有紅壤稻田7hm2,區(qū)內(nèi)實行早稻-晚稻-蔬菜的輪作制度.水稻生長前期采用水淹管理的傳統(tǒng)灌溉方式,分蘗期后實行淹水-烤田-濕潤灌溉相結(jié)合的方式,實驗前對土壤進(jìn)行人工整平,以確保土壤的均一性.該實驗地區(qū)位于閩江河口區(qū)福州平原的南分支,屬于亞熱帶海洋性季風(fēng)氣候,其氣候條件、降水量、地形地貌及土壤理化性質(zhì)等均可參見文獻(xiàn)[17].

1.2 施加物與施加方式

本實驗于2018年在水稻田內(nèi)分別設(shè)置300, 600和900kg/hm2的富炭硅肥施加處理組,以無施加處理為對照組,水稻種植密度為20穴/m2.施加物是本文以廢棄物為原料自主研制的富炭硅肥,主要成分為C(5.54%)、N(0.52%)、P(0.48%)、K(0.53%)、Ca(16%)、Mg(2.81%)、Fe(0.78%)、S(0.21%)和Si(14%),pH值為(8.93±0.03).對照及各施加處理分別設(shè)置3個重復(fù),每個重復(fù)均分割成一個面積為10m2的小區(qū)塊,共有12個小區(qū)塊,隨機區(qū)組排列.各小區(qū)塊之間用0.5cm厚、30cm高的PVC板隔開,以免相互干擾.富炭硅肥于早、晚稻秧苗移栽前各施加一次,對照組不予施加.除此之外,本研究施加的主要肥料是復(fù)合肥(N-P2O5- K2O=16-16-16)和尿素(46% N),具體施加時間和施加方式可參照Wang等[18].

1.3 試驗時間與土壤樣品的采集

早稻生長時間為2018年4月18日~7月6日,晚稻生長時間為2018年8月1日~11月8日.由于拔節(jié)期的淹水狀態(tài)可為鐵還原菌提供一個較為適宜的生長環(huán)境,本研究分別于早、晚稻拔節(jié)期用小型土壤采樣器進(jìn)行土壤樣品采集(早稻拔節(jié)期采樣時間為2018年6月2日,晚稻拔節(jié)期采樣時間為2018年9月19日),采集樣品為深度0~15cm的表層土壤,剔除樣品中的植物殘根和石礫后,放入冰盒中帶回實驗室.將每個樣品分成3份,一部分鮮土用于土壤鐵還原菌數(shù)量的測定;一部分置于-20℃冰箱中保存,以便用于土壤微生物基因組的提取與分析;另一部分自然風(fēng)干、研磨過篩后,用于土壤理化指標(biāo)的測定.

1.4 土壤樣品理化性質(zhì)的測定

土壤容重(BW)采用環(huán)刀法測定[19];含水量(WC)采用烘干稱重法測定[19];電導(dǎo)率(EC)和土壤溫度(ST)采用2265SF電導(dǎo)/溫度計測定,并以電導(dǎo)率表征土壤鹽度;土壤pH值采用水土質(zhì)量比為5:1,搖床振蕩30min,靜置后用PHS-3CpH計測定.

1.5 土壤鐵還原菌數(shù)量的測定——最大或然數(shù)法

稱取5g土樣加入盛有45mL無菌超純水的三角瓶中,充分振蕩10min,此即為10-1濃度的土壤懸液,然后進(jìn)行一系列10倍稀釋,制成10-2~10-7濃度的土壤懸液.取最后5個稀釋度的土壤懸液各1mL,接種到裝有鐵還原菌培養(yǎng)液的試管中,每一稀釋度做3個重復(fù).接種后置于30℃培養(yǎng)10d(不接種的對照管同時培養(yǎng)),觀察培養(yǎng)液的顏色,培養(yǎng)液顏色由紅褐色變?yōu)闇\綠色或無色,則記為鐵還原菌陽性管.最后根據(jù)不同稀釋度出現(xiàn)的陽性管數(shù)確定數(shù)量指標(biāo),查“最大或然數(shù)法則統(tǒng)計表,MPN表”得到菌數(shù)近似值,并根據(jù)菌數(shù)計算公式計算結(jié)果[19].

1.6 土壤鐵還原菌群落組成分析

本研究的鐵還原菌門、屬的分類數(shù)據(jù)是借助Illumina HiSeq高通量測序平臺對實驗項目的土壤樣品基因組16S rRNA基因中的V3~V4可變區(qū)域進(jìn)行測序分析,再與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,從中篩選出已知的鐵還原菌[16],并對其進(jìn)行重分析,最終得到鐵還原菌的多樣性及群落結(jié)構(gòu)組成結(jié)果.

1.6.1 基因組DNA的提取與PCR擴增 采用CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)方法對土壤樣品的基因組DNA進(jìn)行提取后,利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度,取適量樣品DNA于離心管中,使用無菌水稀釋樣品至1ng/μL.以稀釋后的基因組DNA為模板,使用帶Barcode的特異引物,New England Biolabs公司的Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進(jìn)行PCR,確保擴增效率和準(zhǔn)確性.PCR擴增引物為341F (CCTAYGGGRBGCASCAG)和806R(GGACTACN NGGGTATCTA AT).

1.6.2 PCR產(chǎn)物的混樣與純化 PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測40min;根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣,充分混勻后使用1×TAE濃度2%的瓊脂糖凝膠電泳純化PCR產(chǎn)物,剪切回收目標(biāo)條帶.產(chǎn)物純化試劑盒使用的是Thermo Scientific公司GeneJET膠回收試劑盒回收產(chǎn)物.

1.6.3 文庫構(gòu)建與上機測序 使用Thermofisher公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48rxns建庫試劑盒進(jìn)行文庫的構(gòu)建,構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測合格后,使用Thermofisher的Ion S5TMXL進(jìn)行上機測序.

1.7 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excel 2016和SPSS 21統(tǒng)計分析軟件對測定數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析,利用Origin 8軟件進(jìn)行繪圖;通過Uparse軟件對所有樣品的全部Clean Reads進(jìn)行聚類,以97%的一致性將序列聚類成為OTUs;使用QIIME軟件(Version 1.9.1)計算土壤鐵還原菌的Alpha多樣性指數(shù);利用Canoca軟件進(jìn)行PCA和CCA分析;使用R軟件(Version 2.15.3)對土壤環(huán)境影響因子與鐵還原菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 富炭硅肥施加對稻田土壤理化性質(zhì)的影響

注:EJC:早稻拔節(jié)期對照組;EJ300:早稻拔節(jié)期300kg/hm2施加處理組;EJ600:早稻拔節(jié)期600kg/hm2施加處理組;EJ900:早稻拔節(jié)期900kg/hm2施加處理組;LJC:晚稻拔節(jié)期對照組;LJ300:晚稻拔節(jié)期300kg/hm2施加處理組;LJ600:晚稻拔節(jié)期600kg/hm2施加處理組;LJ900:晚稻拔節(jié)期900kg/hm2施加處理組;同列不同字母表示同一指標(biāo)不同處理之間具有顯著差異(ABCD表示早稻,abcd表示晚稻,<0.05,下同).

如表1所示,與對照組相比,早、晚稻3種施加處理均在不同程度上提高了土壤pH值.在早稻土壤中,600kg/hm2施加處理使土壤pH值較對照顯著提高了2.1%(<0.05);在晚稻土壤中,300和900kg/ hm2施加處理分別使土壤pH值較對照顯著提高了5.3%和8.9%(<0.05).此外,早、晚稻拔節(jié)期土壤的BW、WC、EC和ST等環(huán)境因子與對照組相比雖有所波動,但變化均不顯著(0.05),說明富炭硅肥施加處理并未對稻田土壤的BW、WC、EC和ST等造成顯著影響.

2.2 富炭硅肥施加對稻田土壤鐵還原菌數(shù)量的影響

如圖1所示,晚稻3種處理及對照土壤中鐵還原菌數(shù)量均高于早稻.在早稻拔節(jié)期中,對照組及300,600,900kg/hm2富炭硅肥施加處理組土壤鐵還原菌數(shù)量分別為1.67′105,2.16′105,2.12′105,1.16′105MPN/g,與對照組相比,300和600kg/hm2施加處理均使土壤鐵還原菌數(shù)量顯著升高(<0.05),而900kg/hm2施加處理使土壤鐵還原菌數(shù)量顯著降低(<0.05).在晚稻拔節(jié)期中,對照組及300,600, 900kg/hm2富炭硅肥施加處理組土壤鐵還原菌數(shù)量分別為2.55′105,3.43′105,5.32′105,3.23′105MPN/g,與對照組相比,3種施加處理均使土壤鐵還原菌數(shù)量顯著升高(<0.05),其中600kg/hm2施加處理對鐵還原菌數(shù)量影響最為明顯,較對照組提高了108.6%.由此可知,富炭硅肥施加有助于鐵還原菌的生長和繁殖,且當(dāng)施加量為600kg/hm2時最有利于土壤鐵還原菌的生長.

2.3 富炭硅肥施加對稻田土壤鐵還原菌多樣性的影響

圖1 富炭硅肥施加對稻田土壤鐵還原菌數(shù)量的影響

如表2所示,早、晚稻8個土壤樣品經(jīng)高通量測序以97%的一致性進(jìn)行OTUs聚類,共有437個鐵還原菌OTUs.各樣品文庫的Coverage(覆蓋率)范圍為95.5%~98.7%,說明土壤樣品中基因序列被檢出的概率較高,測序深度足夠,可以真實反映稻田土壤鐵還原菌群落的真實情況.

表2 不同施加處理條件下稻田土壤鐵還原菌多樣性指數(shù)

注:OTUs占比指的是鐵還原菌OTU數(shù)目占總OTU數(shù)目的比值.

Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均是用來估算樣品中微生物的多樣性指數(shù),其指數(shù)值越大,則樣品中群落多樣性越高.由Shannon指數(shù)可知(表2),早稻拔節(jié)期中300kg/hm2施加處理略微提高了土壤鐵還原菌多樣性,而600和900kg/hm2施加處理使土壤鐵還原菌多樣性相比于對照均略微降低;晚稻拔節(jié)期中3種施加處理均使土壤鐵還原菌多樣性在一定程度上有所下降,其中300kg/hm2施加處理組多樣性指數(shù)降低最為明顯,較對照降低了29.4%.Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)均可用來評估樣品中微生物的群落豐度.以Chao1指數(shù)為例,Chao1指數(shù)在生態(tài)學(xué)中常用來估算物種總數(shù),其指數(shù)值越高,群落中含有的OTU數(shù)目越多,群落豐度也就越高.早稻拔節(jié)期600kg/hm2施加處理提高了土壤鐵還原菌的群落豐度,較對照提高了5.4%;而晚稻拔節(jié)期3種施加處理均降低了土壤鐵還原菌的群落豐度,其中600kg/hm2施加處理組的群落豐度高于其它兩種施加處理.

2.4 富炭硅肥施加對稻田土壤鐵還原菌OTU分布的影響

通過Venn圖可分析出多個樣品中所共有和特有的OTU數(shù)目,能夠較直觀的比較出早、晚稻施加處理組與對照組樣品OTU組成的相似性和差異性.由圖2(a)可知,早稻拔節(jié)期對照組,300,600和900kg/hm2施加處理組特有的OTUs分別為1、7、5和4個,3個處理組與對照組共有的OTUs為31個;從圖2(b)可以看出,晚稻拔節(jié)期對照組,300,600和900kg/hm2施加處理組特有的OTUs分別為7、5、6和6個,3個處理組與對照組共有的OTUs為15個.早稻土壤樣品中,300kg/hm2施加處理組所特有的OTUs最多;而晚稻土壤樣品中,對照組所特有的OTUs最多,這一結(jié)果與Shannon指數(shù)相吻合,說明在不同施加量富炭硅肥處理條件下,早、晚稻土壤中的鐵還原菌均出現(xiàn)了新菌型,分析其原因可能是由于土壤中某些原有的鐵還原菌因其相對豐度發(fā)生改變而被檢測出來,從而影響土壤鐵還原菌群落組成.

2.5 富炭硅肥施加對稻田土壤鐵還原菌群落組成的影響

2.5.1 稻田土壤門水平的鐵還原菌群落組成 如圖3(a)所示,在早、晚稻拔節(jié)期土壤中共鑒定出5個菌門的鐵還原細(xì)菌,其相對豐度分別為:變形菌門(Proteobacteria)占32.81%~80.58%、擬桿菌門(Bacteroidetes)占0.89%~62.05%、厚壁菌門(Firmicutes)占1.34%~31.70%、酸桿菌門(Acidobacteria)占0~ 0.89%和unidentified Bacteria 占0~0.67%.在8個土壤樣品中變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)的鐵還原細(xì)菌占比之和平均高達(dá)95%以上,是早、晚稻拔節(jié)期土壤中優(yōu)勢菌門的鐵還原細(xì)菌.

在早稻拔節(jié)期,與對照組相比,施加處理組土壤中擬桿菌門(Bacteroidetes)的相對豐度均有所提高,而變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度均有不同程度的降低,此外在施加處理組土壤中新增了酸桿菌門(Acidobacteria)和其它新的未知菌門.晚稻300kg/hm2施加處理組(LJ300)土壤中擬桿菌門(Bacteroidetes)的相對豐度從15.4%下降到0.9%,而厚壁菌門(Firmicutes)的相對豐度從3.1%提高到31.7%;晚稻其它施加處理土壤中變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)相對豐度的變化趨勢與早稻一致.從門水平來看,不同施加量富炭硅肥處理對稻田土壤中變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)的相對豐度影響較大,而對鐵還原菌群落組成的影響較小.

2.5.2 稻田土壤屬水平的鐵還原菌群落組成 如圖3(b)所示,8個土壤樣品中共鑒定出18個鐵還原菌屬,其中相對豐度排列前10位的屬占總菌屬的89.51%~100.00%,分別為擬桿菌屬()、厭氧粘細(xì)菌屬()、芽孢桿菌屬()、地桿菌屬()、氣單胞菌屬()、硫桿菌屬()、假單胞菌屬()、地溫桿菌屬()、脫硫微菌屬()、紅桿菌屬().其中擬桿菌屬()、厭氧粘細(xì)菌屬()和芽孢桿菌屬()相對豐度較高,是福州平原稻田土壤中的優(yōu)勢鐵還原菌屬.

在早稻拔節(jié)期土壤中施加處理組與對照組相比,擬桿菌屬()相對豐度均有不同程度的升高,而厭氧粘細(xì)菌屬()相對豐度均有所降低;晚稻拔節(jié)期300kg/hm2施加處理組(LJ300)與對照組相比,擬桿菌屬()相對豐度從15.40%下降到0.89%,而厭氧粘細(xì)菌屬()和芽孢桿菌屬()相對豐度大幅度升高,分別升高33.93%、28.58%;晚稻其它施加處理組中擬桿菌屬()和厭氧粘細(xì)菌屬()相對豐度變化趨勢與早稻一致.早、晚稻土壤施加處理較對照均有新的鐵還原菌屬出現(xiàn),也有鐵還原菌屬消失,如地發(fā)菌屬()和脫硫桿菌屬().由此可知,不同施加量富炭硅肥處理對稻田土壤鐵還原菌的相對豐度和群落組成均有不同程度的影響.

2.6 富炭硅肥施加對稻田土壤鐵還原菌屬水平分布的影響

為進(jìn)一步探究早、晚稻土壤在不同施加量富炭硅肥處理條件下鐵還原菌屬水平優(yōu)勢菌屬的差異,根據(jù)所有樣本在屬水平的物種注釋及豐度信息,選取豐度排名前35的屬,從物種和樣本兩個層面進(jìn)行聚類,繪制成熱圖(圖4),便于發(fā)現(xiàn)不同菌屬在不同處理樣本中的聚集程度.

如圖4所示,在早、晚稻拔節(jié)期土壤中,早稻對照組(EJC)的優(yōu)勢菌屬為等,早稻300kg/hm2施加處理組(EJ300)的優(yōu)勢菌屬為等,早稻600kg/hm2施加處理組(EJ600)的優(yōu)勢菌屬為、等,早稻900kg/hm2施加處理組(EJ900)的優(yōu)勢菌屬為等;晚稻對照組(LJC)的優(yōu)勢菌屬為等,晚稻300kg/hm2施加處理組(LJ300)的優(yōu)勢菌屬為,晚稻600kg/hm2施加處理組(LJ600)的優(yōu)勢菌屬為等,晚稻900kg/hm2施加處理組(LJ900)的優(yōu)勢菌屬為等.由此可知,早、晚稻拔節(jié)期各個樣品處理之間土壤鐵還原菌優(yōu)勢菌屬差異較大,不同菌屬在不同樣品中的相對豐度也存在一定差異,說明富炭硅肥施加處理對土壤微生物的生存環(huán)境造成影響,進(jìn)而導(dǎo)致稻田土壤中鐵還原菌優(yōu)勢菌屬發(fā)生改變.

圖4 不同施加處理下稻田土壤鐵還原菌屬相對豐度聚類熱圖

2.7 富炭硅肥施加對稻田土壤鐵還原菌群落結(jié)構(gòu)主成分的影響

為了能夠更加直觀的分析不同施加量富炭硅肥對稻田土壤鐵還原菌群落結(jié)構(gòu)間造成的差異性,繪制了基于OTU水平的PCA分析圖(圖5).

如圖5所示,早、晚稻土壤選擇前兩個主成分(PC1和PC2)進(jìn)行分析,第1主成分對樣本差異的貢獻(xiàn)值為24.34%,第2主成分對樣本差異的貢獻(xiàn)值為19.45%,說明這兩個主成分是造成稻田土壤鐵還原菌群落結(jié)構(gòu)差異的主要因素.早、晚稻各處理樣品代表的點在空間上均具有一定的距離.EJC組與EJ300、EJ900組點距離較近,與EJ600組點距離最遠(yuǎn),說明早稻300、900kg/hm2施加處理與對照的土壤鐵還原菌群落結(jié)構(gòu)相似,而600kg/hm2施加處理對土壤鐵還原菌群落結(jié)構(gòu)的影響最為顯著;LJC組與LJ600、LJ900組點距離較近,而與LJ300組點距離最遠(yuǎn),說明晚稻600、900kg/hm2施加處理與對照的土壤鐵還原菌群落結(jié)構(gòu)相似,而300kg/hm2施加處理對土壤鐵還原菌群落結(jié)構(gòu)的影響最為明顯.綜上所述,不同施加量富炭硅肥處理都會對稻田土壤鐵還原菌群落結(jié)構(gòu)造成影響,但不同稻季的土壤鐵還原菌對富炭硅肥的響應(yīng)有所不同.

圖5 不同施加處理下稻田土壤鐵還原菌群落結(jié)構(gòu)PCA分析

2.8 稻田土壤環(huán)境因子與鐵還原菌群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性分析

2.8.1 Spearman 相關(guān)性分析 用Spearman相關(guān)性分析來研究稻田土壤環(huán)境因子與微生物物種及其豐度之間的相互變化關(guān)系,得到兩兩之間的相關(guān)性和顯著性值.如圖6可知,的相對豐度與WC呈極顯著負(fù)相關(guān)(<0.01),與BW呈極顯著正相關(guān)(<0.01),與ST呈顯著負(fù)相關(guān)(0.05);的相對豐度與土壤pH值呈顯著正相關(guān)(<0.05);的相對豐度與EC呈顯著正相關(guān)(0.05);的相對豐度與ST呈顯著正相關(guān)(<0.05).以上結(jié)果分析說明,環(huán)境因子與土壤鐵還原菌的相對豐度具有相關(guān)性,環(huán)境因子的改變能夠使稻田土壤中某些鐵還原菌屬的相對豐度發(fā)生改變.

圖6 Spearman 相關(guān)性分析熱圖

橫向為環(huán)境因子信息,縱向為物種信息,中間熱圖對應(yīng)的值為Spearman相關(guān)系數(shù),介于-1,1之間,<0為負(fù)相關(guān),>0為正相關(guān),*<0.05,**<0.01

2.8.2 CCA分析 CCA分析主要用來反映菌群與環(huán)境因子之間的關(guān)系,可以檢測環(huán)境因子、樣本、菌群三者之間的關(guān)系或者兩兩之間的關(guān)系,可得到影響樣本分布的重要環(huán)境驅(qū)動因子.由圖7可知早稻對照組(EJC)和300,600kg/hm2處理組(EJ300、EJ600)點距離較近,群落結(jié)構(gòu)差異較小,因此這3個樣本土壤鐵還原菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的相關(guān)性也較為一致;而早稻900kg/hm2處理組(EJ900)點距離最遠(yuǎn),其與WC和ST呈正相關(guān),與BW、EC及pH值呈負(fù)相關(guān),這與其他3個樣本的相關(guān)性相反.和與WC、ST之間的角度均為銳角,說明這3個菌屬的相對豐度與環(huán)境因子WC、ST呈正相關(guān);同時可以看出和這3個菌屬與晚稻對照組(LJC)鐵還原菌群落結(jié)構(gòu)呈正相關(guān),而正是晚稻對照組(LJC)土壤的優(yōu)勢菌屬.因此,由以上分析結(jié)果可知富炭硅肥能夠通過改變土壤理化性質(zhì),影響土壤中某些優(yōu)勢菌屬的相對豐度,進(jìn)一步對稻田土壤鐵還原菌群落結(jié)構(gòu)造成影響,而這一系列的影響機制同時受到水稻不同生長時間和氣候條件的影響與調(diào)控.

圖7 CCA分析

3 討論

3.1 富炭硅肥施加處理對稻田土壤鐵還原菌數(shù)量的影響

本文研究土樣采自早、晚稻拔節(jié)期,此時稻田正處于淹水階段,水稻生長旺盛,根系分泌出大量的營養(yǎng)物質(zhì)可供微生物利用,有利于微生物生長繁殖[20].此外,本研究稻田土壤中施加的富炭硅肥主要成分為生物炭和爐渣,有研究表明生物炭因其疏松多孔狀結(jié)構(gòu),施加于土壤中能夠貯存更多養(yǎng)分,為微生物群落的生長提供充足的營養(yǎng)物質(zhì),同時可避免外界不良因素對微生物造成干擾與毒害,從而提高微生物數(shù)量和活力[21-22].而爐渣中含有大量的微量元素和礦物質(zhì),植物生長消耗土壤中大量的營養(yǎng)物質(zhì),爐渣的施加可補充土壤中硅、鈣、鎂和鐵等營養(yǎng)元素,進(jìn)而促進(jìn)微生物生長[12,23].通過不同劑量富炭硅肥施加處理發(fā)現(xiàn),300和600kg/hm2施加處理使早稻土壤鐵還原菌數(shù)量顯著升高(<0.05);晚稻3種施加處理均使土壤鐵還原菌數(shù)量顯著升高(<0.05),其中600kg/hm2施加處理組升高最為顯著,這表明富炭硅肥能夠提供充足的營養(yǎng)物質(zhì),促進(jìn)鐵還原菌的生長和繁殖,同時為鐵還原菌的生存提供一個良好的微環(huán)境.

3.2 富炭硅肥施加處理對稻田土壤鐵還原菌多樣性的影響

土壤微生物多樣性和豐度的增加對提高水稻土生態(tài)功能的穩(wěn)定和健康具有重要意義[24].富炭硅肥是由生物炭和爐渣混合造粒制作而成的肥料,其中生物炭在土壤中施用具有多重效應(yīng),如改善土壤理化性質(zhì)和土壤微生物生境、提供營養(yǎng)物質(zhì)、增加土壤有機碳含量、減少溫室氣體排放等[25-27].此外,生物炭施用還能顯著影響微生物的群落結(jié)構(gòu)和活性[28-29].本研究發(fā)現(xiàn),早、晚稻土壤鐵還原菌對不同施加量富炭硅肥處理具有不同響應(yīng).由Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)可知,早稻拔節(jié)期中300kg/hm2施加處理略微提高了土壤鐵還原菌群落多樣性,600kg/ hm2施加處理提高了土壤鐵還原菌群落豐度,這一結(jié)果表明富炭硅肥施加改變了微生物生存環(huán)境并為其提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì),進(jìn)而提高稻田土壤鐵還原菌多樣性及豐度,有助于穩(wěn)定稻田生態(tài)系統(tǒng).但晚稻與早稻恰好相反,3種施加處理均使土壤鐵還原菌群落多樣性及豐度有所降低,其中300kg/hm2施加處理組多樣性指數(shù)降低最為明顯,這一現(xiàn)象可能與微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的競爭作用以及早、晚稻不同生長時間和氣候條件有關(guān).

營養(yǎng)競爭是發(fā)生在生活于同一生態(tài)位、生理學(xué)需求相同的微生物之間的普遍現(xiàn)象,它們以此調(diào)節(jié)不同種群的數(shù)量,尤其是在營養(yǎng)成分有限的環(huán)境中更為明顯[30].另有研究表明,養(yǎng)分的投入促進(jìn)微生物的生長和多樣性的增加,而養(yǎng)分的投入處于超營養(yǎng)化狀態(tài)時,會導(dǎo)致優(yōu)勢菌種的過量生長,反而影響其它菌種的生長[31].除了微生物之間的營養(yǎng)競爭外,早、晚稻不同生長時間及氣候條件也會對微生物產(chǎn)生影響.王國兵等[32]研究發(fā)現(xiàn)季節(jié)通過影響土壤微生物生存環(huán)境間接影響微生物群落且作用明顯,這主要與植物生長規(guī)律、土壤水、肥、氣、熱條件等因素有關(guān).楊寧等[33]對紫色土丘陵坡地微生物群落的季節(jié)變化進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)夏季土壤微生物三大類菌群以及總量最高,其次為春季,秋季最低;夏季土壤微生物多樣性顯著高于春秋兩季.本研究早稻生長期處于春夏季,隨著氣溫逐漸回升,水稻代謝物和根系分泌物增多,同時富炭硅肥的施加也為土壤提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì),這為微生物營造了一個營養(yǎng)充足、競爭較小的良好環(huán)境,因此有利于提高土壤鐵還原菌群落多樣性;而晚稻生長期處于夏秋季,氣溫逐漸降低,水稻代謝物和根系分泌物減少,富炭硅肥的施加雖為土壤提供了營養(yǎng)物質(zhì),但營養(yǎng)有限使得微生物之間產(chǎn)生了營養(yǎng)競爭,導(dǎo)致優(yōu)勢菌種大量生長,其它菌種可能因無法獲取營養(yǎng)物質(zhì)使得其生長活性受到抑制,從而導(dǎo)致土壤鐵還原菌群落多樣性下降.

3.3 富炭硅肥施加處理對稻田土壤鐵還原菌群落結(jié)構(gòu)的影響

在稻田生態(tài)系統(tǒng)中,合理施肥可以促進(jìn)土壤有機碳積累和植物生長,并驅(qū)動稻田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)演變[34].王偉華等[35]研究發(fā)現(xiàn)化肥配合秸稈還田可以顯著改善土壤養(yǎng)分含量和土壤微生物量、微生物群落結(jié)構(gòu)和活性;Kumar等[36]研究發(fā)現(xiàn)使用有機肥可以增加稻田土壤有機碳含量,同時提高微生物多樣性.本研究在稻田土壤中施加富炭硅肥,其中含有硅和氮元素,可作為硅肥、氮肥使用來改善土壤肥力,改變土壤理化性質(zhì),在一定程度上影響稻田土壤鐵還原菌的群落結(jié)構(gòu).

對于稻田土壤的菌群結(jié)構(gòu)分布,Cui等[37]借助高通量測序手段研究發(fā)現(xiàn),松嫩平原鹽堿性水稻土根際的主要微生物群落為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes).本研究在富炭硅肥施加處理條件下從稻田土壤中鑒定出的菌門為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和酸桿菌門(Acidobacteria),這一結(jié)果與前人一致.變形菌門在施加處理土壤中的相對豐度雖有不同程度的降低,但仍在土壤鐵還原菌豐度中占有最大比重,其在修復(fù)土壤以及促進(jìn)氮肥的利用等方面發(fā)揮著重要作用[38-39].由此看來,稻田土壤鐵還原菌在門水平上群落結(jié)構(gòu)差異不大,但從土壤鐵還原菌屬水平分布熱圖可知,在屬水平下不同施加處理菌屬差異較大,每種樣品處理之間都有各自的優(yōu)勢菌屬.因此,本研究在稻田土壤中施用富炭硅肥,在改變土壤理化性質(zhì),增強土壤肥力的同時也會作用于微生物,導(dǎo)致土壤中優(yōu)勢菌屬的種類和相對豐度發(fā)生變化,從而進(jìn)一步影響土壤鐵還原菌群落結(jié)構(gòu)和分布.

3.4 富炭硅肥施加處理條件下稻田土壤鐵還原菌與環(huán)境因子的相關(guān)性

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性變化是多種因素共同作用的結(jié)果,如土壤類型、pH值、溫度和濕度、作物根系分泌物、耕作方式、氣候條件等都是影響土壤微生物的因子[40].土壤pH值決定了土壤的酸堿度,從而影響土壤中所能夠生存的微生物數(shù)量與種類,pH值降低,土壤酸性增強刺激耐酸性細(xì)菌生長,抑制嗜堿性細(xì)菌的生命活動,反之亦然.Sheng等[41]研究發(fā)現(xiàn),生物炭在酸性土壤中施用會導(dǎo)致富營養(yǎng)型微生物豐度增加,如擬桿菌門和芽單胞菌門;而在堿性土壤中會使貧養(yǎng)型微生物增加,如酸桿菌門.本研究檢測發(fā)現(xiàn)早、晚稻土壤pH值呈酸性,施加富炭硅肥后,各處理土壤中擬桿菌門(Bacteroidetes)的相對豐度均有所升高,這一結(jié)果與前人研究一致.此外,研究發(fā)現(xiàn)在晚稻施加處理土壤中酸桿菌門(Acidobacteria)的相對豐度下降,甚至消失,這可能是因為酸桿菌門是嗜酸菌,而富炭硅肥中含有二氧化硅、氧化鈣、氧化鎂及生物炭等弱堿性物質(zhì),施加后必然會使土壤pH值有所升高,從而影響土壤中酸桿菌門的相對豐度.

本研究發(fā)現(xiàn)和的相對豐度與ST、WC呈正相關(guān),說明溫度和濕度對微生物的生命活動具有一定影響.有研究表明異化鐵還原菌微生物適宜的環(huán)境溫度有所不同,分為嗜低溫菌、嗜溫菌、嗜熱菌和超嗜熱菌這幾種[42],所以溫度的改變會影響土壤鐵還原菌的種類及相對豐度.另外,早、晚稻3種施加處理均使土壤含水量較對照有所升高,土壤中的含水量直接關(guān)系到土壤空隙中的溶氧量.鐵還原菌大多為厭氧或兼性厭氧菌[43],充足的水分不僅為微生物細(xì)胞的生長提供必要的水分條件,同時也為鐵還原菌的生長提供一個無氧或少氧的微環(huán)境,從而促進(jìn)鐵還原菌的生長和繁殖.

3.5 富炭硅肥施加處理對稻田土壤的綜合影響

有研究表明生物炭的施加能夠改變土壤的某些物理結(jié)構(gòu)和性質(zhì),對提高土壤肥力及作物對肥料的利用效率,增加作物產(chǎn)量等都有重要作用[44-45],另有研究發(fā)現(xiàn)爐渣富含硅、鈣、鎂等營養(yǎng)元素,能夠為水稻的生長提供養(yǎng)分,促進(jìn)產(chǎn)量增加[13,46].本研究所施用的富炭硅肥主要成分為生物炭和爐渣,由此初步推測,富炭硅肥對土壤理化性質(zhì)及微生物群落的綜合效應(yīng)可能會對土壤肥力以及作物產(chǎn)量產(chǎn)生一定影響,這一推測需要進(jìn)一步研究證明.

鐵還原菌通常是具有異化Fe(Ⅲ)還原功能,并通過對有機物的分解從而獲取其生長所需能量的厭氧或兼性厭氧微生物[43].根據(jù)獲取能量途徑的不同,可將鐵還原菌分為兩類[47]:專性鐵還原菌,它們能夠通過Fe(Ⅲ)還原從有機質(zhì)或H2氧化中獲取能量,包括地桿菌和厭氧粘細(xì)菌;兼性鐵還原菌,它們在厭氧環(huán)境下代謝有機物生成有機酸或H2,并將少量電子傳遞給Fe(Ⅲ)使其還原,包括芽孢桿菌,其中厭氧粘細(xì)菌屬()和芽孢桿菌屬()是本研究稻田土壤中的優(yōu)勢鐵還原菌屬.富炭硅肥能夠增加土壤養(yǎng)分和有機物含量,促進(jìn)鐵還原菌的生長,并為鐵還原菌進(jìn)行異化Fe(Ⅲ)還原提供能量.此外,富炭硅肥中還含有豐富的鈣離子,能夠與稻田生成的CO2發(fā)生反應(yīng),形成碳酸鈣沉積于土壤中,進(jìn)而減少氣態(tài)碳的排放,有效提高稻田土壤碳的固持.基于此,未來可對不同施加量富炭硅肥處理條件下的土壤碳含量及溫室氣體排放量進(jìn)行檢測,以此來進(jìn)一步研究富炭硅肥在稻田中的作用.

4 結(jié)論

4.1 施加富炭硅肥能夠改變稻田土壤鐵還原菌數(shù)量,有助于鐵還原菌的生長和繁殖,其中600kg/hm2施加處理對鐵還原菌的生長影響最為顯著(<0.05).

4.2 3種施加處理均使晚稻拔節(jié)期土壤鐵還原菌多樣性有所下降,以300kg/hm2施加處理組多樣性指數(shù)降低最為明顯,較對照組降低了29.4%.

4.3 在早、晚稻土壤中共鑒定出5個菌門,其中變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)的占比之和平均高達(dá)95%以上,是稻田土壤中的優(yōu)勢菌門.

4.4 施加富炭硅肥后,早稻拔節(jié)期土壤中擬桿菌屬()的相對豐度顯著提高(<0.05),而厭氧粘細(xì)菌屬()的相對豐度則有所降低.

4.5 環(huán)境因子與稻田土壤鐵還原菌的相對豐度具有相關(guān)性.的相對豐度與WC呈極顯著負(fù)相關(guān)(<0.01),與BW呈極顯著正相關(guān)(<0.01),與ST呈顯著負(fù)相關(guān)(<0.05);的相對豐度與pH值呈顯著正相關(guān)(<0.05);的相對豐度與ST呈顯著正相關(guān)(<0.05).

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Effects of carbon-enrich silicon fertilizer on the community characteristics of iron-reducing bacteria in paddy fields.

LIN Mei-fen1, ZHENG Yi1*, WANG Xiao-tong1, XU Xu-ping1**, WANG Wei-qi2,3

(1.College of Life Science, Fujian Normal University, Fuzhou 350117, China；2.Institute of Geography, Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China；3.Key Laboratory of Humid Sub-tropical Eco-geographical Process of Ministry of Education, Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China)., 2021,41(4)：1778~1789

In order to explore the relative abundance, diversity and community structure of iron-reducing bacteria (FeRB) in paddy fields of Fuzhou Plain, by setting up the control group and the treatment groups with three dosage levels (300, 600 and 900kg/hm2) of carbon-enrich silicon fertilizer (CESF). The results showed that the application of CESF facilitated the growth and reproduction of FeRB, among which 600kg/hm2treatment had the most significant impact on the growth of FeRB (<0.05). According to the Shannon index, the diversity of FeRB was decreased by the three treatment groups during the jointing stage of late rice. The diversity index of the 300kg/hm2treatment group decreased most significantly, which was 29.4% lower than the control group. In the jointing stage of early and late rice, a total of 5 phyla have been identified in the soils. The total proportion of Proteobacteria, Bacteroidetes and Firmicutes was over 95% on average, and they were the dominant bacteria phyla in paddy fields.After application of CESF, the relative abundance ofin the soil at early rice jointing stage was significantly increased (<0.05), while that ofwas decreased. In addition, environmental factors were correlated with relative abundance of FeRB in the soils. The relative abundance ofwas significantly and positively correlated with soil pH (<0.05). The relative abundance ofwas significantly and positively correlated with soil temperature (<0.05). The above studies concluded that diversity and community structure of FeRB were significantly affected by CESF in paddy fields.

carbon-enrich silicon fertilizer；iron-reducing bacteria；diversity；community structure；paddy field

X53

A

1000-6923(2021)04-1778-12

林美芬(1995-),女,福建泉州人,福建師范大學(xué)碩士研究生,主要從事環(huán)境微生物研究.

2020-08-28

國家自然科學(xué)基金資助項目(42077086;41571287);福建省公益類科研院所基本科研專項(2018R1034-1)

* 責(zé)任作者, 鄭 毅, 副教授,eyizheng@fjnu.edu.cn; 許旭萍, 教授, xuping@finu.edu.cn