詹宏青，孫麗芳，謝石寶，溫露，陳鋼,2,3

（廣東藥科大學(xué)1.藥學(xué)院；2.廣東省藥物新劑型重點實驗室；3.廣東省局部精準(zhǔn)遞藥制劑工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510006）

世界衛(wèi)生組織2021年《世界聽力報告》顯示，目前全球五分之一的人聽力受損，嚴(yán)重影響了人們的生存質(zhì)量[1-2]。目前的臨床藥物可以緩解聽力損失，但不能完全治愈，因此探索治療聽力損失的新方法已經(jīng)成為醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點[3]。內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷是發(fā)生聽力損失的重要原因，且哺乳動物的感覺毛細(xì)胞不能再生，因此靶向內(nèi)耳毛細(xì)胞給藥至關(guān)重要，但目前將藥物遞送至內(nèi)耳毛細(xì)胞仍十分困難[4]。

細(xì)胞穿膜肽（cell-penetrating-peptides，CPPs）即蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域（PTD），是一類由5～30 個氨基酸組成的短肽，能高效地穿過生物屏障，因此被廣泛地用于各種大分子和納米結(jié)構(gòu)化系統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)遞送。低分子量魚精蛋白（low molecular weight protamine，LMWP）是FDA 批準(zhǔn)的藥物魚精蛋白的酶消化產(chǎn)物，由Yang 教授的研究團隊發(fā)現(xiàn)，是目前研究較廣泛的CPP[5]。同時，他們還對LMWP 修飾的PLGA 納米?？朔橄侔┠退幮赃M行研究，結(jié)果顯示該遞藥系統(tǒng)具有良好的治療效果，且無可檢測到的毒性[6]。除了強大的滲透力，LMWP 的安全性也在體外實驗和嚙齒動物及狗中得到證明[7-9]。本課題組之前的研究表明，通過改變PLGA 納米粒的大小能夠提高藥物在內(nèi)耳的分布，并且將該PLGA 納米粒與LMWP 和其他3 種穿膜肽TAT、Penetratin 和R8 分別混合，與LMWP 混合的PLGA 納米粒在耳蝸中顯示更強的攝取[10-11]。因此，本文利用LMWP 修飾PLGA 納米粒，通過2 種體內(nèi)動物模型的研究，考察該納米粒的分布特性，為內(nèi)耳毛細(xì)胞的藥物遞送提供新思路。

1 儀器與材料

1.1 儀器

JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；GL-2型磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；TDL80-2B 離心機（飛鴿牌）；DelsaTMNano C Zeta 電位儀（美國Beckman coulter 公司）；Nano S90 激光粒度儀（英國馬爾文公司）；LSM 710激光掃描共聚焦熒光顯微鏡（德國卡爾蔡司股份公司）；FIBO 小動物活體熒光成像（韓國NeoScience公司）。

1.2 材料

PLGA（LA∶GA=75∶25，相對分子質(zhì)量10 000，山東省醫(yī)療器械研究所）；香豆素-6（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，美國Sigma-Aldrich公司）；尼羅紅（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，廣州市齊云生物科技有限公司）；低分子量魚精蛋白及羅丹明B-低分子量魚精蛋白（氨基酸序列VSRRRRRRGGRRRR，上海吉爾生化有限公司）；DASPI（Sigma）；細(xì)胞骨架藍色熒光探針（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）。

HEI-OC1 細(xì)胞，源自于美國House Ear Institute（HEI），是從新生小鼠耳蝸Corti 氏器中分離培養(yǎng)得到的永生化貼壁細(xì)胞。野生型（wildtype，WT）AB 系的斑馬魚（Danio rerio），購自南京一樹梨花生物科技有限公司。FMMU 品系的普通級豚鼠，體質(zhì)量200～300 g，雌雄不限，購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，合格證號：SCXK（粵）2017-0125。

2 方法

2.1 LMWP修飾PLGA 納米粒的制備

稱 取30 mg 的PLGA 和1 mg 香 豆 素-6 或 尼 羅紅，溶于1 mL的乙酸乙酯和二氯甲烷的混合溶劑中（體積比3∶7），得到有機相。配制質(zhì)量濃度為3%的PVA 溶液5 mL 作為水相。將有機相加入到水相。在冰浴的條件下，探頭超聲30次（工作5 s，間隙5 s，功率190 W）；用15 mL 0.5%的PVA溶液稀釋，磁力攪拌3 h，揮發(fā)有機溶劑，低速離心（3 000 r/min，10 min），隨后進行超高速離心（18 000 r/min，30 min），蒸餾水復(fù)溶沉淀得到未修飾的PLGA納米粒。

將一定量的LMWP 用適量的PBS 溶液溶解，再與未修飾的PLGA 納米粒溶液混合，置搖床中冰浴振蕩3 h（100 r/min），期間每30 min 更換1 次冰水，即得LMWP 修飾的PLGA 納米粒溶液，以2%的甘露醇為凍干保護劑，凍干備用。

2.2 LMWP修飾PLGA 納米粒的表征

取適量LMWP修飾的PLGA 納米粒溶液用蒸餾水稀釋到合適的濃度，潤洗比色皿3 次，取1 mL 體積的納米溶液于激光粒度儀測定粒度分布和多分散系數(shù)，另取納米粒溶液于電位分析儀檢測電位。

取LMWP 修飾的PLGA 納米粒溶液適量，滴加到圓形銅網(wǎng)上，自然風(fēng)干后用0.2%的磷鎢酸染色，室溫條件下晾干，置于80 kV 的透射電鏡下觀察納米粒的形態(tài)。

2.3 細(xì)胞毒性實驗

稱取適量LMWP 修飾的PLGA 納米粒凍干粉末，用培養(yǎng)基稀釋至質(zhì)量濃度為15.625、31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 000、4 000 μg/mL 的溶液。將HEI-OC1 細(xì)胞接種于96 孔板中培養(yǎng)24 h，分別加入上述不同質(zhì)量濃度的納米粒懸液100 μL，共孵育24 h 后棄去含藥的培養(yǎng)基，隨后加入MTT 試劑共孵育4 h，小心棄去上清，每孔加100 μL的DMSO，恒溫震蕩10 min。用酶標(biāo)儀測定490 nm 處的吸光度值，按照下列公式計算細(xì)胞存活率：

細(xì)胞活力/%=[A加藥-A空白]/[A不給藥-A空白]×100%A加藥：具有細(xì)胞、MTT 溶液和藥物溶液的孔的吸光度；A空白：具有培養(yǎng)基和MTT 溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度；A不給藥：具有細(xì)胞、MTT溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度。

2.4 斑馬魚攝取實驗

將斑馬魚幼魚（6 dpf）用吸管轉(zhuǎn)移至96孔板內(nèi)，每孔4尾幼魚，3個復(fù)孔。設(shè)置LMWP修飾與未修飾的PLGA 納米粒組，孵育一定時間后吸棄藥液，加入多聚甲醛固定12 h，棄去固定液，胚胎培養(yǎng)液洗3次，再加入0.005%的DASPEI染色15 min，胚胎培養(yǎng)液清洗3 次。甘油鋪片，指甲油封片以防甘油漏出導(dǎo)致樣品移位。命名后放入切片盒，于冰箱4 ℃放置保存待激光共聚焦拍照。在激光掃描共聚焦熒光顯微鏡觀察斑馬魚的頭部、尾部和毛細(xì)胞，并在相應(yīng)的激光通道下進行呈像。

2.5 豚鼠體內(nèi)分布實驗

2.5.1 納米粒的熒光成像 將豚鼠隨機分為3組，分別為生理鹽水組、未修飾的PLGA 納米粒組，LMWP修飾的PLGA 納米粒組，給藥方式為耳后注射3 μL溶液。30 min 后，腹腔注射過量20%烏拉坦溶液使豚鼠深度麻醉，斷頭處死并取出聽泡。用PBS 沖洗聽泡表面殘余的納米粒溶液，放置在表面皿上進行熒光成像（濾光片），并用軟件NEO image for FOBI統(tǒng)計各個耳蝸的熒光強度。

2.5.2 納米粒在基底膜的分布 隨機將豚鼠分為未修飾的PLGA 納米粒組、LMWP 修飾的PLGA 納米粒組，每組6只豚鼠。豚鼠麻醉后，單側(cè)耳后注射3 μL納米粒溶液。分別于給藥30 min 后深度麻醉處死豚鼠，取聽泡，隨后從鼓室下方剪開聽泡，用尖鑷在蝸尖鉆一小孔，取出鐙骨刺破圓窗膜，用1 mL 注射器吸取4%多聚甲醛固定液從蝸尖灌流固定，固定過夜。第2 天在體式顯微鏡下進行耳蝸基底膜取材，隨后將取得的內(nèi)耳組織用0.1%的Triton X-100溶液洗滌3 次，于工作液中避光染色70 min。染色時間到后，吸棄染色液，PBS 洗3 次。將染色完畢的組織放置于滴有甘油的載玻片上，將基底膜纖毛面朝上，鋪片完畢再封固蓋玻片4 周，存放于4 ℃的冰箱中。使用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照記錄。

3 結(jié)果

3.1 納米粒的表征

從未修飾與LMWP修飾的PLGA納米粒的粒徑分布及電位檢測結(jié)果（圖1A、B）可見，在25 ℃的溫度條件下，測得未修飾的PLGA 納米粒的粒徑為143.9 nm，多分散系數(shù)（PDI）為0.093，帶負(fù)電（-7.07 mV）；經(jīng)LMWP修飾的PLGA 納米粒的粒徑為153.6 nm，多分散系數(shù)（PDI）為0.112，帶正電（+6.56 mV），表明制備得到的納米粒子粒徑大小適宜，分布均勻，體系一般穩(wěn)定。從未修飾與LMWP修飾的PLGA 納米粒的TEM 結(jié)果（圖1C、D）可見，修飾前后的納米粒形態(tài)基本一致，制得的納米粒子近似球形，粒徑略小于實際測量值，分散性良好，幾乎無團聚現(xiàn)象。

3.2 細(xì)胞毒性實驗結(jié)果

LMWP 修飾PLGA 納米粒的體外細(xì)胞毒性結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，LMWP 修飾的PLGA 納米粒具有較低的細(xì)胞毒性，僅在高濃度時（≥2 000 μg/mL），LMWP 修飾的PLGA 納米粒才顯示出一定的細(xì)胞毒性。

3.3 斑馬魚的體內(nèi)分布結(jié)果

圖3 為未修飾的PLGA 納米粒的斑馬魚攝取結(jié)果，可見，未修飾的PLGA 納米粒溶液在頭部、尾部和側(cè)線毛細(xì)胞的紅色通道具有明顯的熒光，表明未修飾的PLGA 納米粒能夠被斑馬魚攝取，并到達側(cè)線毛細(xì)胞。圖4 為LMWP 修飾的PLGA 納米粒組的斑馬魚攝取結(jié)果，可以看到斑馬魚全身有大量的尼羅紅的熒光分布，與未修飾的PLGA 納米粒組相比，側(cè)線毛細(xì)胞的熒光強度更強，表明LMWP 修飾的PLGA 納米粒能夠有效地被斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞攝取，LMWP的修飾提高了對納米粒的攝取量。

3.4 豚鼠的體內(nèi)分布結(jié)果

以豚鼠為實驗動物模型，通過熒光成像考察LMWP 修飾的PLGA 納米粒與未修飾的PLGA 納米粒經(jīng)局部給藥在內(nèi)耳的總體攝取量，結(jié)果見圖5。可見，LMWP 修飾的PLGA 納米粒比起未經(jīng)修飾的PLGA 納米粒在耳蝸的熒光強度顯著增強（P＜0.05），表明LMWP可以促進納米粒進入內(nèi)耳。

圖1 未修飾或LMWP修飾的PLGA納米粒的表征Figure 1 Characterization of unmodified PLGA NPs and LMWP-PLGA NPs

圖2 LMWP修飾PLGA納米粒與HEI-OC1細(xì)胞共孵育24 h的細(xì)胞存活率Figure 2 Cell viability of LMWP-PLGA NPs after incubated with HEI-OC1 cells for 24 h

圖3 未修飾的PLGA 納米粒與斑馬魚共孵育的體內(nèi)分布結(jié)果Figure 3 In vivo distribution of unmodified PLGA NPs after co-incubation with zebrafish

圖4 LMWP修飾PLGA 納米粒與斑馬魚共孵育的體內(nèi)分布結(jié)果Figure 4 In vivo distribution of LMWP-PLGA NPs after co-incubation with zebrafish

未修飾的PLGA 納米粒經(jīng)耳后注射后在豚鼠耳蝸基底膜的分布結(jié)果見圖6。結(jié)果顯示，耳蝸基底膜三回毛細(xì)胞排列整齊，無缺失，染色情況良好，在紅通道未見熒光，表明未修飾的PLGA 納米粒無紅色熒光干擾。未修飾的PLGA 納米粒在綠通道中顯示出較弱的熒光，基底膜底回幾乎未見綠色熒光，基底膜中回和頂回具微弱熒光。LMWP 修飾的PLGA納米粒經(jīng)耳后注射后在豚鼠耳蝸基底膜的分布結(jié)果見圖7。結(jié)果顯示，該納米粒經(jīng)局部給藥后在耳蝸基底膜三回均有分布，表明經(jīng)LMWP 修飾后的PLGA 納米粒能夠進入耳蝸并且被毛細(xì)胞攝取。底回的紅色和綠色熒光較弱，表明納米粒分布較少，結(jié)合熒光共定位來看，納米粒在中回和頂回的攝取明顯增加，說明LMWP 能有效地促進納米粒在中回和頂回毛細(xì)胞的攝取。

圖5 未修飾與LMWP修飾的PLGA納米粒的熒光成像及熒光強度統(tǒng)計結(jié)果Figure 5 Fluorescence imaging and intensity statistics of unmodified and LMWP-PLGA NPs

圖6 未修飾的PLGA納米粒在耳蝸基底膜的分布Figure 6 Distribution of unmodified PLGA NPs in cochlear basilar membrane

4 討論

在過去的十多年，基于納米系統(tǒng)的遞送策略將藥物有效遞送到內(nèi)耳被認(rèn)為是最有吸引力的方法之一，引起了學(xué)者極大的興趣[12]。納米遞送系統(tǒng)展現(xiàn)出了高效、靶向、降低毒性等優(yōu)勢，是目前研究比較熱門的遞送體系。美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）和歐洲藥品管理局（EMA）已經(jīng)批準(zhǔn)聚乳酸-羥基乙酸共聚物[（Poly(lactic-co-glycolic acid），PLGA]納米粒用于注射給藥[13]。有研究指出，PLGA納米粒經(jīng)局部給藥后主要分布在耳蝸圓窗膜、外淋巴、基底膜、血管紋以及Corti器官內(nèi)，但關(guān)于納米粒靶向分布至內(nèi)耳毛細(xì)胞的研究報道較少。與此同時，為了增強藥物在內(nèi)耳的遞送，有必要尋找一種“促透劑”，將“促透劑”與載體材料PLGA 結(jié)合，達到一個協(xié)同促進藥物遞送至內(nèi)耳毛細(xì)胞的目的。

圖7 LMWP修飾的PLGA 納米粒在耳蝸基底膜的分布Figure 7 Distribution of LMWP-PLGA NPs in the cochlear basilar membrane

穿膜肽是一類具有穿透各種生物膜功能的多肽分子，可以促進蛋白質(zhì)、多肽、納米粒等各種大分子進入細(xì)胞。因此，本研究將LMWP 修飾在PLGA納米粒表面，考察其應(yīng)用于內(nèi)耳遞送的分布特性。本文結(jié)果顯示，所制備的LMWP 修飾的PLGA 納米粒為形狀圓整的類球形，粒徑約為150 nm，具有合適的粒徑和分散性。經(jīng)LMWP 修飾后PLGA 納米粒帶正電，猜測可能是LMWP 吸附在PLGA 納米粒上使它荷正電[6]。此外，基于本課題組之前的研究[11]，該納米粒的凍干粉末在室溫下應(yīng)能穩(wěn)定儲存長達2個月。體外細(xì)胞毒性結(jié)果表明，該納米粒具有良好的細(xì)胞相容性，只有在高濃度才顯示出毒性。文星星等[14]研究結(jié)果表明，質(zhì)量濃度為0～25 mg/mL 的PLGA 納米粒與HEI-OC1 細(xì)胞共孵育24 h 沒有明顯毒性，故猜測LMWP 可能由于自身帶正電荷而引起輕微的細(xì)胞毒性。斑馬魚具有生長周期短、繁殖能力強、基因與人類基因相似度達到87%等生物學(xué)特性。另外，斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞與內(nèi)耳感覺毛細(xì)胞功能及分子結(jié)構(gòu)極為相似，被廣泛作為研究內(nèi)耳科學(xué)領(lǐng)域的實驗動物模型[15]。此外，豚鼠耳殼大，存在明顯的聽覺耳廓反射，聽力十分敏銳，常被作為研究聽覺和內(nèi)耳疾病的動物模型。本研究采用這兩種動物模型，研究證實LMWP 的修飾顯著增加PLGA納米粒在毛細(xì)胞的分布，提示LMWP 修飾的PLGA納米粒在內(nèi)耳藥物遞送方面具有較大的潛力。研究表明，納米粒表面帶正電荷將促進其細(xì)胞攝取，而且納米粒的攝取主要是由網(wǎng)格蛋白內(nèi)吞作用介導(dǎo)[16-17]。因此，推測經(jīng)LMWP 修飾的PLGA 納米粒通過表面的正電荷與負(fù)電的細(xì)胞膜相互作用，以網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞方式進入內(nèi)耳毛細(xì)胞。綜上，本研究為優(yōu)化內(nèi)耳毛細(xì)胞遞送系統(tǒng)的處方設(shè)計提供參考，為將LMWP 修飾的納米粒用于防治聽力損失的藥物遞送奠定實驗基礎(chǔ)。