高 璐 何怡雯 韓雪源

(紹興文理學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 紹興 312000)

0 引言

青梅，又稱為酸梅、果梅，是我國亞熱帶特產(chǎn)水果，主要種植于廣東、福建和浙江等地.青梅果實清脆爽口，含多種營養(yǎng)物質(zhì)，不僅含有對人體有益的維生素、氨基酸、有機(jī)酸，還含有鉀、鐵、鈣等多種礦物質(zhì)元素[1].在藥用價值方面，青梅備受矚目，《神農(nóng)本草》中記載：梅性味甘平，可入肝、脾、肺、大腸，有收斂生津作用.

青梅酒作為青梅的主要產(chǎn)品，發(fā)展歷史悠久，底蘊深厚.根據(jù)制作工藝不同，分為浸泡青梅酒和發(fā)酵青梅酒.浸泡型主要采用白酒或者黃酒浸泡新鮮青梅果而制得，也可以用青梅汁與白酒勾兌而成，發(fā)酵型主要利用青梅汁或者果實發(fā)酵而制得.生產(chǎn)中，多數(shù)選用浸泡法來釀造青梅酒，而大多數(shù)發(fā)酵青梅酒仍處于試驗階段[2]，但浸泡酒由于雜醇油濃度較高、口感粗糙、氣味刺鼻，不適合直接飲用[3].與浸泡相比，發(fā)酵將促進(jìn)原材料功能成分的溶解，促進(jìn)生物活性成分(色氨酸、褪黑素、酪醇、谷胱甘肽和羥酪醇)的合成和釋放，使之更具有生物可吸收性[4]，而微生物的代謝將積累廣泛的風(fēng)味化合物，包括醇類、酯類、萜烯類、醛類、有機(jī)酸和呋喃等[5-7].因此，發(fā)酵青梅酒不僅具有更好的感官特性，而且營養(yǎng)價值也有所提高.

青梅果含有大量的維生素、類黃酮和酚類等功能成分，但是有機(jī)酸含量較高，果味偏酸，原料在加工制作過程中受到限制.許多因素影響發(fā)酵果酒質(zhì)量，如原料、醇母菌種和發(fā)酵條件等[8].本研究中，采用降酸酵母(Saccharomycescerevisiae，Lalvin71B)進(jìn)行發(fā)酵，以期降低果酒酸度.眾所周知，糯米作為黃酒發(fā)酵的主要原料，在糖化過程中會釋放大量的單糖以及生物活性物質(zhì)，為改善青梅酒的口感和品質(zhì)，本研究嘗試采用糯米代替蔗糖作為碳源來發(fā)酵制作青梅酒.對蔗糖和糯米兩種不同的糖源發(fā)酵而成的青梅酒進(jìn)行理化性質(zhì)的對比和抗氧化性的分析，為生產(chǎn)口感飽滿，香味濃郁并且營養(yǎng)豐富的青梅酒開辟蹊徑.

1 材料與方法

1.1 青梅汁壓榨

于紹興王壇東村，選取成熟度一致，大小基本一致，無病蟲害、無損傷的青梅果實，將青梅果洗凈后置于-20 ℃冷凍48 h，然后在室溫下解凍，直至中心溫度為0 ℃.再將解凍后的青梅果放入螺旋榨汁機(jī)，經(jīng)過二次壓榨后收集果汁.

1.2 發(fā)酵

1.2.1 糯米青梅酒(RGW)

將1.25 L青梅果汁、1.25 L蒸餾水、1.5 kg熟糯米、3.0 g糖化酶和0.25 g乳酸鏈球菌素，以及0.6 g活化的降酸酵母(Saccharomycescerevisiae， Lalvin71B)(約占0.6 g/kg生糯米)加入5.0 L的發(fā)酵容器中，環(huán)境溫度保持在22 ± 1 ℃.發(fā)酵期間，每天用Erma手持折射儀測定白利糖度(°Brix)，在發(fā)酵第10天，白利糖度基本穩(wěn)定.于16 ℃進(jìn)行后發(fā)酵.后發(fā)酵完成，將酒樣進(jìn)行壓榨澄清.

1.2.2 蔗糖青梅酒(SGW)

用蔗糖(0.85 kg)代替RGW中的糯米，其余發(fā)酵條件與RGW相同.

1.3 理化指標(biāo)測定

1.3.1 酒精度

采用蒸餾法測定.量取一定量的待測液加入Gibertini DEEPV(Super DEE， GIBERTINI， 意大利)蒸餾儀器中，蒸餾后定容，再使用Gibertini Densimat/Alcomat2 (AlcoMat-2， GIBERTINI， 意大利)酒精度測試儀，即可測得酒精度.

1.3.2 可溶性固形物含量

采用手持折光儀測定.對手持折光儀進(jìn)行校準(zhǔn)后，取待測酒樣數(shù)滴置于檢測棱鏡上，轉(zhuǎn)動目鏡調(diào)節(jié)手輪，使視場的藍(lán)白分界線清晰，分界線的刻度值即為溶液的可溶性固形物含量.

1.3.3 總酸含量

參照國標(biāo)[9]，采用酸堿滴定法，結(jié)果以酒石酸當(dāng)量表示.

1.3.4 總糖含量

參照國標(biāo)[10]，采用斐林試劑方法，以葡萄糖溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.3.5 總蛋白含量

采用Bradford法[11]，以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn).考馬斯亮藍(lán) G-250染料試劑與蛋白質(zhì)結(jié)合，呈現(xiàn)藍(lán)黑色，在595 nm處測得吸光度.

1.3.6 抗壞血酸含量測定

參照2，6 -二氯酚靛酚鈉滴定法[12].移取0.1 mL青梅酒于10 mL容量瓶中，加入0.5 mL的偏磷酸乙酸，以及0.5 mol/L磷酸二氫鉀溶液約5 mL稀釋至刻度，然后充分搖勻，于70 ℃水浴反應(yīng)30 min，避光2 h后，再加入5 mL的鄰苯二胺，振動搖勻.在紫外波長420 nm處測定吸光度.通過抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中其含量.

1.4 總酚含量測定

采用福林酚法[13]進(jìn)行測定.取酒樣0.5 mL到加塞比色管中，加入稀釋了10倍的福林酚試劑2.5 mL，靜置5 min后再加入7.5%(w/v)Na2CO3溶液2 mL，加蓋混勻，于50 ℃水浴反應(yīng)5 min.在760 nm處測定溶液的吸光度.以沒食子酸溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以沒食子酸當(dāng)量表示(GAE)/mL酒樣.

1.5 總黃酮含量測定

參照李淑珍等[14]方法進(jìn)行測定，并稍作調(diào)整.取1 mL酒樣于10 mL比色管中，加入1%AlCl3溶液4 mL，用無水乙醇定容至10 mL，充分搖勻，于40 ℃水浴反應(yīng)60 min，在284 nm處測得吸光度.以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以蘆丁當(dāng)量表示(RE)/mL酒樣.

1.6 揮發(fā)性化合物分析

通過FlavourSpec?靜態(tài)頂空(SHS)氣相色譜-離子遷移譜(GC-IMS)設(shè)備(Gesellschaft für Analytische Sensorsysteme mbH (G.A.S.)， Dortmund， 德國)對酒樣揮發(fā)性化合物進(jìn)行分析.設(shè)備配置自動進(jìn)樣器(PAL RSI， CTC Analytics AG， Zwingen， 瑞士).色譜柱為MXT-WAX 毛細(xì)管柱(30 m × 0.53 mm ID， 1 μm)(CS-Chromatographie Service GmbH， Düren， 德國).采用不分流進(jìn)樣模式.在60 ℃下，于頂空瓶中孵育酒樣(1 mL)10 min.詳細(xì)分析參數(shù)如下：總分析時間30 min，柱溫60 ℃，載氣N2，IMS溫度45 ℃，進(jìn)樣體積100 μL，進(jìn)樣口溫度85 ℃.詳細(xì)的化合物離子化和漂移程序參數(shù)同Li等[15].

在陽離子模式下，對IMS數(shù)據(jù)進(jìn)行采集，通過LAV?軟件(G.A.S.)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，包括Reporter， Gallery繪圖和動態(tài)PCA插件.并通過GC-IMS Library Search?軟件(G.A.S.)對化合物進(jìn)行鑒定，包括NIST和IMS數(shù)據(jù)庫.此外，通過一個3D地形圖展示化合物在GC柱和IMS漂移管中的雙重分離，其中每個特征峰均由保留時間、漂移時間和峰強(qiáng)度值來定義.

1.7 DPPH自由基清除能力測定

參照Brand-Williams等[16]的方法，并稍作調(diào)整.用95%的乙醇配制濃度為0.1 mmol/L的DPPH醇溶液.酒樣稀釋10倍待用.于比色管中加入2 mL DPPH醇溶液，2 mL稀釋的青梅酒樣，搖勻，室溫下于黑暗環(huán)境內(nèi)放置30 min.取出后于517 nm處測量吸光度(AS).用95%乙醇取代DPPH醇溶液，重復(fù)操作，測得對照樣的吸光度(A0).用蒸餾水代替青梅酒樣，重復(fù)操作，測得空白樣的吸光度(Ab).并以抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的自由基清除能力為參照.DPPH自由基清除率按以下公式計算：

DPPH自由基清除率(%)

=[1-(AS-A0)/Ab]×100

式中，AS，酒樣和DPPH溶液的吸光度；A0，95%乙醇和酒樣的吸光度；Ab，蒸餾水和DPPH溶液的吸光度.

1.8 ABTS+ 自由基清除能力測定

參照Re等[17]，應(yīng)用改進(jìn)的ABTS陽離子自由基脫色法，并稍作調(diào)整. 將88 μL 140 mmol/L過硫酸鉀溶液加入到5 mL 7 mmol/L ABTS+溶液中，混勻，于室溫避光條件下靜置12 h，制得ABTS+·儲備液.儲備液不能直接使用，在使用前需用無水乙醇將儲備液稀釋成工作液，確保工作液在734 nm處的吸光度為0.70±0.02.于比色管中加入2 mL ABTS+·工作液，以及2 mL稀釋青梅酒樣，混勻，室溫下于黑暗環(huán)境內(nèi)放置10 min.取出后于734 nm處測量吸光度(AS).用無水乙醇代替ABTS+·溶液，重復(fù)操作，測得對照樣的吸光度(A0).用蒸餾水代替青梅酒樣，重復(fù)操作，測得空白樣的吸光度(Ab).并以抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的自由基清除能力為參照.ABTS+自由基清除率按如下公式計算：

ABTS+·清除率/%=[1-(AS-A0)/Ab]×100

式中，AS為酒樣和ABTS+·溶液的吸光度；A0為無水乙醇和酒樣的吸光度；Ab為蒸餾水和ABTS+·溶液的吸光度.

1.9 總抗氧化能力測定

參照總抗氧化能力測定試劑盒(T-AOC)(南京建城生物工程研究所，南京，中國)說明書進(jìn)行.于520 nm處測定吸光度值，總抗氧化能力按如下公式計算：

式中，ODM為測量管的吸光度；ODC為對照管的吸光性；N為反應(yīng)液稀釋倍數(shù)(反應(yīng)溶液總體積/采樣量)；n為樣品測試前稀釋倍數(shù).

1.10 感官評價

由10名經(jīng)驗豐富的品評員(5名女性和5名男性)從外觀(顏色和渾濁度)、香氣(酒精、水果和谷物)、口味/味道(甜、酸、苦)和口感(澀味、延續(xù)感和飽滿感)等方面對酒樣的感官特征進(jìn)行評價.所有樣本被放置在20 ± 1 ℃的感官評價室中，單獨并隨機(jī)地呈現(xiàn)給品評員.酒樣放置于不透明的一次性塑料杯中，每個樣品重復(fù)評價三次.每個感官的描述進(jìn)行強(qiáng)度量化，評級從0到9(0：無；1-2：很差；3-4：較差；5-6：中等；7-8：良好；9：優(yōu)秀)[18].此外，根據(jù)ISO標(biāo)準(zhǔn)，采用100分評價法，進(jìn)行評價總得分計算，其中顏色(5分)、透明度(5分)、香氣(30分)、味道(40分)和典型(20分)[19].

1.11 統(tǒng)計分析

所有試驗至少進(jìn)行三次生物學(xué)重復(fù).數(shù)據(jù)用平均值加上或減去標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示.采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行最小顯著性差異(LSD)檢驗，p值小于0.05或0.01，分別用“*” 或“**”表示差異顯著性.

2 結(jié)果與討論

2.1 青梅酒基本理化指標(biāo)

青梅作為果酒釀造原料，具有獨特風(fēng)味.青梅酒營養(yǎng)價值高，含有豐富的有機(jī)酸、礦物質(zhì)、酚類、氨基酸等[20]，而且功效良多，具有潛在的健康益處[21]，如抗癌和抗氧化性等[22]，使它成為一種很受歡迎的果酒.本研究以蔗糖和糯米為碳源，結(jié)合青梅汁發(fā)酵，得到兩種干型青梅酒(總糖含量<15 g/L， 酒精度>8.0%)，其可溶性固形物含量較低，口感都較清爽.但兩種青梅酒在總糖、總酸、酒精含量、總蛋白和抗壞血酸含量等指標(biāo)都存在差異.SGW和RGW具體理化指標(biāo)的分析比較詳見表1.糯米作為中國黃酒發(fā)酵的主要原料之一，其糖化過程中能夠產(chǎn)生大量的單糖，并將許多生物活性成分釋放到發(fā)酵液中[23].以糯米為原料發(fā)酵生產(chǎn)的青梅酒，其總酸、可溶性固形物和總糖含量略低.而其酒精含量、抗壞血酸含量和總蛋白含量較高.總酸含量在一定程度上反映了果酒的品質(zhì)，是果酒最重要的質(zhì)量指標(biāo)之一.總酸含量對發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味和香氣有重要影響，其含量可作為貨架期的指標(biāo)[24].然而，即使應(yīng)用降酸酵母，由于青梅汁含酸量較高，兩種酒樣的總酸含量都較高.

表1 青梅酒理化性質(zhì)

2.2 總酚和總黃酮含量

為進(jìn)一步評價青梅酒的功能價值，對酒樣的總酚和黃酮類化合物含量進(jìn)行比較.以沒食子酸和蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)物，分別得到標(biāo)準(zhǔn)曲線.結(jié)果顯示(圖1)，蔗糖發(fā)酵的青梅酒，其總酚和黃酮類化合物含量均顯著高于糯米發(fā)酵的青梅酒.其中，RGW的總酚含量為23.15±1.7 mg GAE/L，SGW的總酚含量為33.89±3.56 mg GAE/L.并且，在總黃酮含量分析中，兩種青梅酒呈現(xiàn)出極顯著差異.據(jù)報道，酚類和黃酮類物質(zhì)具有很高的抗氧化活性和多種健康益處[25].

圖1 青梅酒樣中總酚和總黃酮含量(LSD顯著性差異分析，p = 0.05)

2.3 揮發(fā)性化合物分析

香氣物質(zhì)是酒類產(chǎn)品的重要特征指標(biāo).通過GC-IMS技術(shù)分析比較兩種青梅酒的揮發(fā)性化合物成分.GC-IMS技術(shù)結(jié)合了氣相色譜的高分離效率和離子遷移譜的快速響應(yīng)、高靈敏度，具有無樣品預(yù)處理(無損)、簡單、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點，特別適用于揮發(fā)性有機(jī)化合物的分析.結(jié)果如圖2，以一個3D地形圖反映化合物數(shù)據(jù)，其中z軸為用于定量的峰強(qiáng)度，y軸和x軸分別為氣相色譜分離保留時間和離子遷移時間.圖2表明，兩種青梅酒的揮發(fā)性化合物成分基本相似，但是在化合物峰強(qiáng)度和個別揮發(fā)性成分上存在差異.

圖2 酒樣GC-IMS分析3D地形圖

為進(jìn)一步比較分析，得到3D地形圖的俯視圖(圖3)，并對反應(yīng)離子峰和遷移時間進(jìn)行歸一化處理，圖中每一個點代表一種揮發(fā)性化合物.大部分信號出現(xiàn)在保留時間100～120 0 s和相對漂移時間1.0～2.0范圍內(nèi).圖中顏色代表化合物的信號強(qiáng)度，顏色越深，強(qiáng)度就越強(qiáng).紅色表示高信號強(qiáng)度，白色表示低信號強(qiáng)度.兩種青梅酒中共檢測出44種揮發(fā)性化合物，其中通過GC-IMS庫檢索，成功鑒定出26種揮發(fā)性化合物，包括10種酯類化合物，見圖3和表2.某些化合物由于其濃度不同而產(chǎn)生多個斑點或信號(單體或二聚體).酯類、醇類和醛類是青梅酒中主要的揮發(fā)性化合物，但它們的濃度因發(fā)酵糖源的不同而明顯不同.

圖3 3D地形圖的俯視圖(數(shù)字代表被成功鑒定的化合物；A，SGW;B，RGW)

表2 揮發(fā)性化合物的GC-IMS綜合參數(shù)

為更直接地比較兩種青梅酒中揮發(fā)性化合物的差異，利用化合物指紋圖譜(見圖4)對青梅酒進(jìn)行定性定量表征.其中，正己醇和苯甲醛僅在RGW中檢測到.苯甲醛是青梅酒的典型香氣物質(zhì)[26].據(jù)報道，以苦蕎麥(Fagopyrumtataricum)代替糯米為原料，黃酒的風(fēng)味物質(zhì)將被顯著影響[27].本研究中，RGW中的2-庚醇、庚醇、1-戊醇、丙二酮、乙酸丁酯和2-甲基丙酯的含量高于SGW.與RGW相比，SGW中乙酸、辛酸乙酯、乙酸丙酯和丁酸乙酯的含量較高.總體而言，以糯米發(fā)酵的青梅酒中酯類和醇類的含量高于以蔗糖發(fā)酵的青梅酒.酯類一方面來源于醇和脂肪酸的酯化，另一方面來源于微生物的合成代謝[28].以上結(jié)果表明，RGW比SGW具有更豐富的揮發(fā)性物質(zhì)和較好的整體風(fēng)味協(xié)調(diào)性.

圖4 揮發(fā)性化合物信號峰指紋圖

2.4 自由基清除和總抗氧化能力

為進(jìn)一步評價兩種青梅酒的潛在抗氧化性能，以不同濃度Vc為參照，比較分析酒樣DPPH自由基清除能力.得到Vc濃度和清除率標(biāo)曲為y=11.741x+0.1853(R2=0.998 9).青梅酒樣DPPH自由基清除率結(jié)果顯示(圖5)，SGW的清除能力極顯著強(qiáng)于RGW. 其中， RGW的DPPH自由基清除率為66.25±1.94%(Vc當(dāng)量5.63 μg/mL)，SGW的DPPH自由基清除率為82.86±0.188%(Vc當(dāng)量7.04 μg/mL).

圖5 自由基清除率和總抗氧化性

以不同濃度Vc為參照，比較分析兩種青梅酒的ABTS+自由基清除能力.得到Vc濃度和清除率標(biāo)曲為y=20.857x+4.45(R2=0.998 5).結(jié)果與DPPH·不同，RGW的ABTS+自由基清除率為35.92±0.56%(Vc當(dāng)量1.51 μg/mL)，SGW的ABTS+自由基清除率為27.87±0.61%(Vc當(dāng)量1.12 μg/mL).前者的清除能力強(qiáng)于后者，并且兩者呈現(xiàn)極顯著差異(圖5).

以鐵離子還原能力為基礎(chǔ)，應(yīng)用試劑盒，比較分析兩種青梅酒的總抗氧化能力.結(jié)果如圖5，SGW的總抗氧化能力(56.40±4.41 U/mL)顯著強(qiáng)于RGW(47.91±3.64 U/mL).與DPPH·清除能力一致，蔗糖發(fā)酵的SGW具有更強(qiáng)的抗氧化能力.這與SGW的總酚和總黃酮含量高于RGW相對應(yīng).

2.5 感官評價

從表觀、香氣、味道和典型性等方面對青梅酒進(jìn)行感官評價.如圖6，RGW色澤明亮，酒體澄清，醇香飽滿，并帶有谷物香，味道濃郁，酒體協(xié)調(diào).然而，SGW色澤偏暗，底部略有沉淀，其酸澀味明顯，后味較苦，整體協(xié)調(diào)性較差.在百分制總體評價中，SGW得分為74.50±3.33，RGW得分為84.50±3.0.在酒類感官評價中，一般認(rèn)為80分以上的樣本為可接受、良好樣本，70～80分之間的樣本一般為可接受樣本，70分以下的樣本為不可接受樣本.

圖6 青梅酒感官評價

3 結(jié)論

本試驗通過研究不同發(fā)酵糖源對青梅酒理化特征和抗氧化成分的影響，對青梅酒的各項品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行系統(tǒng)的測定分析.結(jié)果表明，RGW的酒精含量、抗壞血酸含量和總蛋白含量高于SGW.但在功能成分方面，SGW中總酚和類黃酮含量較高，其抗氧化能力也略高于RGW.香氣成分分析顯示，RGW比SGW具有更豐富的揮發(fā)性物質(zhì)和較好的整體風(fēng)味協(xié)調(diào)性.感官評價方面，RGW在外觀、香氣、味道和典型性方面優(yōu)于SGW，有較高的感官評分.綜合考慮以上結(jié)果，認(rèn)為以糯米為糖源發(fā)酵的青梅酒更能夠提高發(fā)酵青梅酒的品質(zhì).