張孝春，汪 萌，黃卓然，徐成振，張興旺，張 強(qiáng)，吳曉敏

（1.淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院污染物敏感材料與環(huán)境修復(fù)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，淮北235000；2.伊犁師范大學(xué)生物與地理科學(xué)學(xué)院，伊寧835000；3.淮北師范大學(xué)計(jì)算機(jī)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，淮北235000）

蛋白質(zhì)天然態(tài)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定形成是發(fā)揮其生物功能的生物物理基礎(chǔ)，研究蛋白質(zhì)殘基間相互作用與其結(jié)構(gòu)折疊形成的關(guān)系一直是結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究重點(diǎn)。蛋白質(zhì)折疊、穩(wěn)定以及功能的發(fā)揮均與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中關(guān)鍵氨基酸殘基密切相關(guān)，而這些殘基的缺失或突變替換等都會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生顯著破壞。如鐮刀型貧血癥就是由于血紅蛋白（HbA）結(jié)構(gòu)中β 鏈第6 位氨基酸谷氨酸突變?yōu)槔i氨酸形成了異常的血紅蛋白S（HbS）［1］。p53 是突變頻率最高的一種腫瘤抑制蛋白，其結(jié)構(gòu)中第220 位酪氨酸殘基突變?yōu)榘腚装彼釙?huì)引起結(jié)構(gòu)親水性空腔變大，最終導(dǎo)致p53 蛋白變性且抑癌功能喪失［2］。因此，研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中哪些殘基在其折疊和功能中發(fā)揮重要作用對(duì)多肽設(shè)計(jì)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)優(yōu)化、藥物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)等研究都具有重要的指導(dǎo)意義。殘基點(diǎn)突變被看作是探測(cè)所突變殘基在其結(jié)構(gòu)中是否發(fā)揮重要作用的最直接有效方法［3］，但是通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)突變來構(gòu)建突變體，一方面工作量大成本高，另一方面觀察到的蛋白結(jié)構(gòu)折疊轉(zhuǎn)變時(shí)間和空間分辨率均受到限制。分子動(dòng)力學(xué)（Molecular dynamics，MD）模擬計(jì)算隨著近年來計(jì)算機(jī)軟硬件的迅速發(fā)展，模擬計(jì)算的精度和時(shí)間尺度都迅速提升，已成為研究蛋白結(jié)構(gòu)折疊和藥物篩選設(shè)計(jì)的重要工具［4］。通過MD 模擬可為常規(guī)實(shí)驗(yàn)提供理論指導(dǎo)，大大降低實(shí)驗(yàn)的工作量，提高實(shí)驗(yàn)突變的準(zhǔn)確率。在蛋白質(zhì)受體?配體的模擬計(jì)算中，可通過結(jié)合自由能分解確定殘基是否在結(jié)合過程中發(fā)揮重要作用［5］。但在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，常用的方法是對(duì)殘基所形成的不同類型相互作用（如疏水、靜電、氫鍵以及鹽橋等）和殘基特性（如電荷、疏水和極性等）進(jìn)行綜合評(píng)判，再通過MD模擬與實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。然而殘基側(cè)鏈在結(jié)構(gòu)中的位置取向并未被足夠重視。

模型蛋白Trp?cage 是在模仿腸降血糖素藥物艾塞那肽Exenatide 的基礎(chǔ)上人工設(shè)計(jì)提出的［3］，該模型蛋白憑借僅由20 個(gè)殘基組成的典型結(jié)構(gòu)和非?？斓恼郫B速度成為驗(yàn)證蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)問題的理想模型［6?7］。目前對(duì)該蛋白模擬計(jì)算所采用的力場(chǎng)涵蓋了現(xiàn)有的常用力場(chǎng)如OPLSAA/L［8］、AMBER 系列［9］、CHARMM 系列［10］以及近年來相關(guān)課題組優(yōu)化開發(fā)的各種分子力場(chǎng)等［11］。盡管能夠很好地利用這些分子力場(chǎng)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，然而經(jīng)驗(yàn)勢(shì)函數(shù)對(duì)原子間非鍵相互作用的描述精度還不夠高，尤其是對(duì)相互作用龐大復(fù)雜的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，隨著原子相互作用數(shù)目增大而計(jì)算誤差迅速積累，會(huì)導(dǎo)致模擬計(jì)算結(jié)果錯(cuò)誤。為此吳云東課題組對(duì)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB）中不在二級(jí)結(jié)構(gòu)內(nèi)部的卷曲殘基進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到的殘基固有局部構(gòu)象偏好與常用力場(chǎng)OPLSAA/L 給出的殘基側(cè)鏈構(gòu)象分布（骨架二面角φ、ψ 與側(cè)鏈扭轉(zhuǎn)角χi）存在明顯差異。基于PDB 構(gòu)建的局部構(gòu)象偏好卷曲庫（Coil library）［12］，通過引入特殊局部非鍵相互作用對(duì)OPLSAA/L 力場(chǎng)優(yōu)化得到新的RSFF1 力場(chǎng)［13］。該力場(chǎng)可得到與PDB 統(tǒng)計(jì)相一致的φ，ψ，χi 分布，且MD 模擬得到的結(jié)構(gòu)與PDB結(jié)構(gòu)偏差（RMSD）更?。?3?14］。

因此，本文利用更為精確描述側(cè)鏈位置特性的RSFF1力場(chǎng)對(duì)野生態(tài)模型蛋白及其兩個(gè)絲氨酸突變體研究其各自折疊過程，并揭示該殘基側(cè)鏈位置特性對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)折疊的影響，進(jìn)一步為蛋白結(jié)構(gòu)改造和優(yōu)化設(shè)計(jì)提供理論指導(dǎo)。使用全原子MD 模擬，以模型蛋白Trp?cage 為例，首先研究其野生態(tài)結(jié)構(gòu)從變性態(tài)構(gòu)象到其天然態(tài)構(gòu)象的折疊轉(zhuǎn)變過程，并將其作為對(duì)照。在殘基突變點(diǎn)的選擇方面并未選取早期研究中［15］已證明對(duì)其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定形成具有重要影響的殘基如Y3、W6、P12 和P19 等或是形成鹽橋的殘基D9／R16，而是選擇310?螺旋結(jié)構(gòu)上的兩個(gè)相鄰的絲氨酸殘基（S13和S14），其中殘基S13側(cè)鏈朝向外側(cè)溶劑，而殘基S14 側(cè)鏈朝向蛋白內(nèi)部疏水核心結(jié)構(gòu)，這為研究殘基的位置取向與其折疊之間的關(guān)系提供了重要基礎(chǔ)。分別對(duì)該蛋白結(jié)構(gòu)上殘基S13 和S14 進(jìn)行甘氨酸點(diǎn)突變，構(gòu)建了S13G 和S14G 突變體，并采用與野生態(tài)MD模擬一致的計(jì)算參數(shù)對(duì)其進(jìn)行折疊模擬，通過對(duì)比這兩個(gè)突變體的折疊模擬過程與野生態(tài)之間的差異，研究殘基S13和S14分別在結(jié)構(gòu)折疊過程中的貢獻(xiàn)差異，進(jìn)而深入理解殘基側(cè)鏈位置特性對(duì)其結(jié)構(gòu)折疊轉(zhuǎn)變的影響。

1 模擬計(jì)算體系與方法

1.1 模擬計(jì)算體系

模型蛋白Trp?cage（TC5b）的晶體結(jié)構(gòu)來自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/），PDB ID 為1L2Y，其氨基酸序列為NLYIQ WLKDG GPSSG RPPPS［16］。將該晶體結(jié)構(gòu)中的第一幀作為其天然態(tài)構(gòu)象，如圖1（a）所示，并在之前的工作中［17］通過溫控分子動(dòng)力學(xué)（TC?MD）模擬獲得了該蛋白的變性態(tài)結(jié)構(gòu)，如圖1（b）所示，該結(jié)構(gòu)呈錯(cuò)誤塌縮狀。以此變性態(tài)結(jié)構(gòu)作為野生態(tài)Trp?cage 的模擬起始構(gòu)象，并對(duì)變性態(tài)結(jié)構(gòu)中的殘基S13 和S14 分別進(jìn)行甘氨酸點(diǎn)突變優(yōu)化獲得突變體S13G 和S14G 的起始構(gòu)象具體如圖1（c）和圖1（d）。為更好地模擬蛋白質(zhì)在細(xì)胞正常生理環(huán)境條件，將構(gòu)建好的起始結(jié)構(gòu)分別置于長(zhǎng)約43 ? 的正方體盒子中，并向其中填充約2 545 個(gè)TIP4p?Ew 溶劑水分子［18］，為確保體系的電中性，使用2 個(gè)Na+和3 個(gè)Cl-共替換5 個(gè)水分子獲得0.05 mol/L 的離子濃度，模擬體系環(huán)境pH 設(shè)置為7。體系構(gòu)建完成后，分別進(jìn)行2 ns 的最陡下降（Steepest decent，SD）能量最小化和5 ns 的位置限制MD 模擬來消除蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的不良接觸并優(yōu)化整個(gè)體系。

1.2 分子動(dòng)力學(xué)（MD）模擬參數(shù)

野生態(tài)Trp?cage 及其S13G 和S14G 突變體1.0?μs的MD 模擬均使用GROMACS 2016 軟件包［19］完成，模擬過程中采用RSFF1 力場(chǎng)和TIP4p?Ew 水模型，并使用V?rescale 和Berendsen 算法分別耦合溫度和壓力為300 K 和1.0 atm；LINCS 算法約束所有含有氫原子的共價(jià)鍵；PME（Properties?method?event）方法計(jì)算長(zhǎng)程靜電相互作用；庫侖力和范德華相互作用的截?cái)喟霃骄O(shè)置為9.0 ?。每個(gè)體系的模擬時(shí)長(zhǎng)均為1 000 ns，每500 ps保存一次構(gòu)象。

1.3 實(shí)驗(yàn)軌跡數(shù)據(jù)分析

使用GROMACS 2016 和VMD 1.9.3 軟件對(duì)所有MD模擬軌跡進(jìn)行分析，并通過骨架結(jié)構(gòu)的均方根偏差（RMSD_BD）；α?螺旋的均方根偏差（RMSD_α?helix）；310?螺旋的均方根偏差（RMSD_310?helix）；骨架結(jié)構(gòu)的回旋半徑（Rg）；疏水核心的回旋半徑（Rgcore）；天然接觸的形成概率（Q）和Cα原子的均方根波動(dòng)（RMSF）等參數(shù)來描述模型蛋白Trp?cage及其突變體的結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)特征。均方根偏差和天然接觸的計(jì)算都是以NMR實(shí)驗(yàn)測(cè)定得到的天然態(tài)結(jié)構(gòu)為基準(zhǔn)計(jì)算。并通過gmx do_dssp命令調(diào)用DSSP程序計(jì)算模擬過程中二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成情況。同時(shí)為更清晰地獲得結(jié)構(gòu)的折疊轉(zhuǎn)變路徑，使用RMSD和Q 兩個(gè)參數(shù)構(gòu)建了結(jié)構(gòu)的自由能地形圖。文中所有結(jié)構(gòu)圖像均采用開源的蛋白質(zhì)圖像顯示軟件Pymol 繪制。參數(shù)Q將通過以下公式［20］計(jì)算：

其中：i 和j 為至少間隔3 個(gè)殘基的所有非氫原子對(duì)；天然態(tài)結(jié)構(gòu)中i和j原子之間的接觸距離（r0ij）＜4.5 ?將被判定為形成天然接觸；β設(shè)置為5.0，λ設(shè)置為1.4。

2 結(jié)果與討論

2.1 殘基S13和S14突變對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)形成的影響

圖1 野生態(tài)模型蛋白Trp?cage的天然態(tài)（a）和變性態(tài)起始結(jié)構(gòu)（b）及其兩個(gè)突變體S13G（c）和S14G（d）的變性態(tài)起始結(jié)構(gòu)Figure 1 Schematic diagram of the natively folded state（a）and starting denatured state（b）of Trp?cage structure and its two starting denatured states of the S13G（c）and S14G（d）mutations

圖2 野生態(tài)模型蛋白Trp?cage及其S13G和S14G突變體的α?螺旋（a）和310?螺旋（b）的RMSD隨時(shí)間的變化Figure 2 The time?evolution RMSD curves of α?helix（a）and 310?helix（b）of Trp?cage and its S13G and S14G mutations as functions of simulation time

如圖2（a）所示，野生態(tài)Trp?cage 及其S13G 和S14G 突變體的α?螺旋RMSD 值在模擬結(jié)束時(shí)都已達(dá)到平衡且分別穩(wěn)定在3.2 ?、3.4 ? 和3.2 ?。但是α?螺旋的折疊穩(wěn)定性在不同的結(jié)構(gòu)體系中存在一定的差異，如：野生態(tài)與突變體S14G 的α?螺旋RMSD 曲線在模擬起始后快速上升后下降，然后保持小幅的波動(dòng)，并分別在500 ns 和400 ns 后達(dá)到穩(wěn)定；而變體S13G 的α?螺旋RMSD 曲線雖然在模擬的前200 ns 內(nèi)一直處于頻繁的波動(dòng)中，但是在200 ns 后保持穩(wěn)定。這些結(jié)果與DSSP 所繪制的二級(jí)結(jié)構(gòu)保持一致（圖3）。

模型蛋白Trp?cage 的另一個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)310?螺旋的RMSD 隨時(shí)間的變化如圖2（b）所示，野生態(tài)結(jié)構(gòu)在模擬過程中一直穩(wěn)定在2.4 ? 左右，結(jié)合其二級(jí)結(jié)構(gòu)變化圖表明其310?螺旋在結(jié)構(gòu)中一直保持穩(wěn)定。這同時(shí)也說明野生態(tài)Trp?cage 能夠在模擬早期快速形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，這與先前的實(shí)驗(yàn)與模擬中發(fā)現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)在模擬早期快速形成保持一致［21?24］。突變體S13G的310?螺旋RMSD 值與其α?螺旋相似，均在模擬的前200 ns 出現(xiàn)增長(zhǎng)，表明其二級(jí)結(jié)構(gòu)處于解折疊狀態(tài)。其310?螺旋結(jié)構(gòu)在600 ns 后穩(wěn)定在2.1 ?，但是圖3（c）的DSSP 結(jié)果卻顯示其310?螺旋結(jié)構(gòu)并未形成，這與野生態(tài)結(jié)構(gòu)的310?螺旋RMSD 值為2.4 ? 且DSSP 顯示其310?螺旋結(jié)構(gòu)形成出現(xiàn)矛盾。通過分析發(fā)現(xiàn)，突變體S13G 結(jié)構(gòu)中組成310?螺旋的殘基（G10?S14）中同時(shí)存在兩個(gè)限制螺旋形成的殘基（P12 和G13），這兩個(gè)殘基的存在可能導(dǎo)致了組成310?螺旋結(jié)構(gòu)殘基的RMSD 雖然小于野生態(tài)的RMSD 但仍未被判定形成310?螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。突變體S14G 的310?螺旋RMSD 曲線在模擬的前600 ns 內(nèi)一直在2.1～3.9 ? 范圍內(nèi)波動(dòng)，這意味著組成310?螺旋結(jié)構(gòu)的殘基構(gòu)象一直處于頻繁轉(zhuǎn)換中。盡管其RMSD 值在600 ns 后達(dá)到穩(wěn)定（3.6 ?），但是突變體S14G 結(jié)構(gòu)中組成310?螺旋的殘基未能形成，且與天然態(tài)構(gòu)象相差較大，這與圖3 的DSSP 結(jié)果相一致。通過上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白野生態(tài)的二級(jí)結(jié)構(gòu)在模擬早期就可快速穩(wěn)定形成，而突變體S13G 和S14G 的α?螺旋結(jié)構(gòu)折疊穩(wěn)定性發(fā)生不同程度下降；在310?螺旋結(jié)構(gòu)的折疊形成中，殘基S13 突變并未產(chǎn)生較高的影響，但是殘基S14 突變將導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)無法正確形成，這說明殘基S14 對(duì)于310?螺旋結(jié)構(gòu)的形成至關(guān)重要。這主要是由于殘基S14 的側(cè)鏈朝向結(jié)構(gòu)內(nèi)部容易與其他殘基發(fā)生相互作用，而殘基S13 側(cè)鏈朝向溶劑更容易與溶劑水分子發(fā)生作用而出現(xiàn)側(cè)鏈擺動(dòng)。相同側(cè)鏈由于位置朝向和鄰近空間特征的不同導(dǎo)致對(duì)于螺旋結(jié)構(gòu)折疊穩(wěn)定性貢獻(xiàn)程度產(chǎn)生明顯差異，這對(duì)于螺旋結(jié)構(gòu)特征的多肽類抑制劑藥物如細(xì)胞內(nèi)雌激素受體多肽抑制劑［25］和β?淀粉樣蛋白等多肽抑制劑［26］結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的優(yōu)化提供重要參考。

圖3 DSSP計(jì)算的野生態(tài)模型蛋白Trp?cage及其S13G和S14G突變體的二級(jí)結(jié)構(gòu)隨時(shí)間的變化Figure 3 The time?evolution secondary structure of Trp?cage and its S13G and S14G mutations obtained by DSSP calculation

2.2 殘基S13和S14突變對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)形成的影響

如圖4 所示，在模擬結(jié)束前的350 ns 內(nèi)野生態(tài)及其S13G 和S14G 突變體的Rg值分別約為6.8 ?、6.6 ?和6.5 ?，Rgcore值約為5.4 ?、5.8 ? 和5.9 ?，這表明所有模擬結(jié)構(gòu)在模擬結(jié)束時(shí)都已完成折疊過程且體系平衡。與二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化類似，三級(jí)結(jié)構(gòu)的折疊塌縮雖然相似，但是在折疊轉(zhuǎn)變過程和最終形成的結(jié)構(gòu)狀態(tài)仍存在明顯差異。其中突變體S13G 的Rg和Rgcore值在模擬的前400 ns 內(nèi)小范圍波動(dòng)，并在214 ns 時(shí)出現(xiàn)一次峰值（Rg=14.1 ?，Rgcore=16.0 ?），此時(shí)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)完全解折疊，通過對(duì)比該時(shí)刻前后的構(gòu)象發(fā)現(xiàn)該解折疊事件是突變體S13G 折疊過程中由錯(cuò)誤折疊態(tài)調(diào)整至折疊態(tài)結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵步驟。突變體S14G 的Rg和Rgcore值在模擬前600 ns 內(nèi)的變化同其310?螺旋的RMSD 變化一致，均出現(xiàn)較大范圍的波動(dòng)。這說明突變體S14G 結(jié)構(gòu)在折疊／解折疊之間不斷頻繁轉(zhuǎn)換。雖然在模擬結(jié)束時(shí)突變體S14G 的Rg和Rgcore值與野生態(tài)相近，但是結(jié)合構(gòu)象分析發(fā)現(xiàn)其三級(jí)結(jié)構(gòu)仍處于錯(cuò)誤塌縮狀態(tài)。這表明了殘基S14 所發(fā)生的氫鍵相互作用（S14?OH→O=C?D9 和R16?NH→OH?S14）的缺失也導(dǎo)致了蛋白整體結(jié)構(gòu)折疊穩(wěn)定性下降且結(jié)構(gòu)不能正確折疊形成天然態(tài)構(gòu)象。

圖4 野生態(tài)模型蛋白Trp?cage及其S13G和S14G突變體的Rg和 隨時(shí)間的變化Figure 4 The time?evolution Rg and Rg core curves of Trp?cage and its S13 and S14 mutations as functions of simulation time

2.3 殘基S13和S14突變對(duì)其折疊過程的影響

野生態(tài)模型蛋白及其突變體S13G 和S14G 結(jié)構(gòu)的骨架RMSD 和Q 隨時(shí)間的變化如圖5所示，野生態(tài)Trp?cage 的骨架RMSD 并未像其二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)在模擬早期達(dá)到穩(wěn)定，而是在500 ns之后達(dá)到穩(wěn)定，并且在模擬最后的100 ns 再次下降，結(jié)合構(gòu)象分析發(fā)現(xiàn)此時(shí)主要為殘基S14?R16 構(gòu)象的細(xì)微調(diào)整。模擬過程中骨架RMSD 最小為0.67 ?（圖6），這表明野生態(tài)Trp?cage結(jié)構(gòu)最終折疊至天然態(tài)構(gòu)象，同時(shí)也說明通過PDB 卷曲庫優(yōu)化后獲得的RSFF1 力場(chǎng)能夠很好地描述Trp?cage 的折疊形成，這與蔣帆等［11，13，20］的研究結(jié)果一致。但是野生態(tài)Trp?cage 的Q 值在模擬結(jié)束時(shí)僅為0.7 左右，這與天然態(tài)構(gòu)象的1.0 仍有一定差距。通過結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，野生態(tài)Trp?cage 雖然在骨架上與天然態(tài)之間的差異非常小，但是在側(cè)鏈上仍然存在一定的差異，特別是未參與疏水相互作用的殘基側(cè)鏈，如殘基Q5和K8 等，它們的側(cè)鏈朝向溶劑且在溶劑中不斷擺動(dòng)，這是Q 值較低的主要原因。突變體S13G 的骨架RMSD曲線變化同野生態(tài)類似，均在500 ns時(shí)穩(wěn)定在1.9 ?左右，但是其在模擬后期并未能如野生態(tài)進(jìn)一步折疊，且其RMSD 曲線也在214 ns 時(shí)出現(xiàn)峰值（10.18 ?），即此時(shí)結(jié)構(gòu)解折疊，這與其Rg和Rgcore曲線一致。突變體S14G 的骨架RMSD 曲線同樣與其二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)參數(shù)保持一致，在模擬的前600 ns 內(nèi)處于劇烈波動(dòng)中，之后穩(wěn)定在3.8 ? 左右，表明在模擬結(jié)束時(shí)，突變體S14G 結(jié)構(gòu)仍處于錯(cuò)誤的折疊狀態(tài)。且通過結(jié)構(gòu)對(duì)比發(fā)現(xiàn)其310?螺旋和C?端殘基與野生態(tài)構(gòu)象存在較大差異。如圖5（c）的RMSF 所示，突變體S14G 在整個(gè)折疊過程中結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換幅度較大，明顯高于野生態(tài)和突變體S13G。

圖5 野生態(tài)模型蛋白Trp?cage及其S13G和S14G突變體的RMSD、Q和RMSF隨時(shí)間的變化Figure 5 The time?evolution RMSD，Q and RMSF curves of Trp?cage and its S13 and S14 mutations as functions of simulation time

2.4 野生態(tài)Trp?cage 及其S13G 和S14G 突變體的折疊路徑

通過結(jié)構(gòu)序參數(shù)比較發(fā)現(xiàn)，通過均方根偏差（RMSD）和天然接觸（Q）構(gòu)建的自由能地形圖能夠準(zhǔn)確描述其折疊形成轉(zhuǎn)變路徑[27-28]。如圖7 所示，野生態(tài)的折疊由變性態(tài)（D）開始折疊至具有正確構(gòu)象的第一個(gè)中間態(tài)（I1），盡管此時(shí)RMSD 有所下降，但Q 并未增長(zhǎng)，此時(shí)二級(jí)結(jié)構(gòu)基本形成，但是三級(jí)結(jié)構(gòu)并未正確塌縮。直至折疊形成第二個(gè)中間態(tài)（I2），其疏水核心正確塌縮折疊，并且I2的構(gòu)象與天然態(tài)非常相似，這種與天然態(tài)相似的中間態(tài)在之前的研究中也有所發(fā)現(xiàn)[22,24,29]。之后結(jié)構(gòu)進(jìn)一步調(diào)整至近天然態(tài)（N）構(gòu)象。野生態(tài)Trp?cage 的二級(jí)結(jié)構(gòu)率先形成，疏水核心再形成的折疊過程與先前研究中發(fā)現(xiàn)的擴(kuò)散?碰撞模型相一致［21?24］。

突變體S13G 同樣由變性態(tài)D 開始，與野生態(tài)不同之處在于其結(jié)構(gòu)折疊過程中存在一個(gè)過渡態(tài)（Ts），這在其結(jié)構(gòu)參數(shù)上均有所體現(xiàn)。該過渡態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生解折疊和水合作用，其疏水核的解折疊導(dǎo)致了Rgcore和Rg的增大，促進(jìn)了殘基側(cè)鏈與溶劑水分子的相互作用，并引起了疏水殘基的旋轉(zhuǎn)和正確再折疊，經(jīng)過Ts后，RMSD和Rg值分別急劇下降至2.5 ? 和6.9 ?，形成其中間態(tài)（I1），隨后該結(jié)構(gòu)又進(jìn)一步調(diào)整至近天然態(tài)（N’）構(gòu)象。盡管突變體S14G 的α?螺旋在結(jié)構(gòu)折疊過程中較為穩(wěn)定，但其310?螺旋和C?端結(jié)構(gòu)始終未正確形成，這在各結(jié)構(gòu)態(tài)的代表性構(gòu)象中均有所體現(xiàn)，并且最終的錯(cuò)誤折疊構(gòu)象與天然態(tài)構(gòu)象相差甚遠(yuǎn)，這表明殘基S14 所參與形成的氫鍵作用對(duì)其在折疊過程中關(guān)鍵天然接觸的形成發(fā)揮重要作用，尤其是310?螺旋結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確折疊，而310?螺旋結(jié)構(gòu)的消失對(duì)于疏水核心結(jié)構(gòu)殘基L7和P12 的準(zhǔn)確塌縮也產(chǎn)生一定影響，這也再次表明蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)折疊形成的協(xié)同性［30］。在對(duì)Trp?cage（TC5b）的穩(wěn)定性模擬計(jì)算中同樣發(fā)現(xiàn)具有相同側(cè)鏈的S13 和S14 由于其側(cè)鏈所處位置的不同導(dǎo)致其對(duì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的貢獻(xiàn)程度存在差異［15］，同樣也發(fā)現(xiàn)殘基S14對(duì)模型蛋白的折疊影響明顯高于殘基S13，這主要是因?yàn)椋簜?cè)鏈朝向結(jié)構(gòu)內(nèi)部的殘基S14 與D9、R16 的側(cè)鏈形成了較強(qiáng)的內(nèi)部氫鍵（S14?OH→O=C?D9和R16?NH→OH?S14）和天然接觸（S14?D9，S14?G10，S14?G11，S14?P12，S14?R16）；而側(cè)鏈朝向溶劑的殘基S13 僅僅通過骨架的羰基氧與G10 的氨基氮原子和溶劑水分子發(fā)生氫鍵作用，且受到溶劑水分子的運(yùn)動(dòng)而波動(dòng)，相比殘基S14 對(duì)其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和折疊轉(zhuǎn)變影響要小。除了模擬計(jì)算之外，Andersen 課題組［3］通過圓二色譜（CD）和核磁共振實(shí)驗(yàn)（NMR）研究發(fā)現(xiàn)：該模型蛋白（TC10b）突變體S13A 增加了其結(jié)構(gòu)折疊穩(wěn)定性（折疊率為91%，野生態(tài)TC10b 的折疊率為90%），這說明處于蛋白結(jié)構(gòu)表面的極性基團(tuán)如絲氨酸S13 側(cè)鏈上的羥基外置不利于結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定；而模型蛋白（TC9b）突變體S14allo?T 的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性沒有明顯降低（折疊率為82%），S14T 的穩(wěn)定性略有降低（折疊率為76%），說明同樣側(cè)鏈內(nèi)置絲氨酸變?yōu)樘K氨酸后，羥基朝向位置的調(diào)整對(duì)其結(jié)構(gòu)折疊穩(wěn)定性可產(chǎn)生一定影響，L?別?型蘇氨酸略高于L?型蘇氨酸。在TC10b 突變體S14A 結(jié)構(gòu)中，S14 側(cè)鏈的羥基被丙氨酸的甲基取代后導(dǎo)致該內(nèi)置羥基所形成的氫鍵網(wǎng)絡(luò)和天然接觸全部消失，徹底破壞了該模型蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，折疊率僅為44%。實(shí)驗(yàn)和計(jì)算結(jié)果都表明殘基側(cè)鏈結(jié)構(gòu)化學(xué)特性的改變會(huì)徹底破壞其參與形成殘基間相互作用網(wǎng)絡(luò)，側(cè)鏈位置朝向的不同也會(huì)引發(fā)其發(fā)生殘基相互作用的改變。在基于蛋白?蛋白相互作用的藥物設(shè)計(jì)中，除了研究殘基側(cè)鏈本身的電荷、疏水、極性等化學(xué)特性外，還要充分考慮到殘基側(cè)鏈所處鄰近的空間特征和自身朝向位置特性，這為艾塞那肽藥物（模型蛋白Trp?cage 的前體Exendine?4）的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性優(yōu)化和多肽成藥性的提高提供重要理論參考。

圖7 野生態(tài)模型蛋白Trp?cage及其S13G和S14G突變體的自由能地形圖和各結(jié)構(gòu)態(tài)的代表性構(gòu)象Figure 7 The free energy landscapes of Trp?cage and its S13 and S14 mutations and representative conformations corresponding to different states

3 結(jié)論

利用更為精確描述側(cè)鏈位置特性的RSFF1力場(chǎng)使用全原子MD 模擬研究野生態(tài)模型蛋白Trp?cage 及其S13G 和S14G 突變體的折疊過程。結(jié)果表明，野生態(tài)Trp?cage 能夠在模擬開始后快速形成二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，并在結(jié)構(gòu)折疊過程中形成了與天然態(tài)相似的中間態(tài)結(jié)構(gòu)和近天然態(tài)構(gòu)象，其結(jié)構(gòu)折疊路徑為D ?I1 ?I2 ?N，其折疊機(jī)制符合擴(kuò)散?碰撞折疊模型。突變體S13G 的折疊路徑為D ?Ts ?I1 ?N’，雖然這與野生態(tài)的折疊路徑存在一定差異，但其N’結(jié)構(gòu)RMSD比N高，這說明殘基S13 突變僅對(duì)其結(jié)構(gòu)折疊產(chǎn)生一定影響。與側(cè)鏈朝向相反的殘基S14 則不同，其突變體S14G 的折疊路徑為D ?I1 ?I2 ?I3 ?M，由于其側(cè)鏈朝向結(jié)構(gòu)疏水核內(nèi)部，并與D9 和R16 形成氫鍵相互作用。在突變體S14 中側(cè)鏈的羥基被氫原子所替代，導(dǎo)致穩(wěn)定螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)的這些氫鍵受到破壞，因此該突變體的N端α?螺旋局部結(jié)構(gòu)解旋松散、310?螺旋結(jié)構(gòu)消失，二級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞也引發(fā)三級(jí)疏水核心結(jié)構(gòu)的錯(cuò)誤塌縮。

致謝：本模擬計(jì)算實(shí)驗(yàn)的完成是以北京大學(xué)吳云東院士課題組提供RSFF1 力場(chǎng)的參數(shù)文件為基礎(chǔ)的，在此感謝吳云東院士課題組對(duì)實(shí)驗(yàn)的大力支持和論文撰寫方面的指導(dǎo)。