周 影 王 芹 張俊輝 劉 娟 錢 琨 王大雨

(吉林省蠶業(yè)科學(xué)研究院，吉林吉林 132000)

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)又稱北冬蟲夏草，主要寄生在鱗翅目、鞘翅目等昆蟲蛹體上的真菌，屬子囊菌亞門，麥角菌科，蟲草屬。蛹蟲草含有蟲草素、蟲草多糖、噴司他丁、麥角甾醇等多種活性成分[1]，在抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、抗菌抗炎等方面具有很好的藥理作用[2]。由于其多種生理活性，在國內(nèi)外廣泛用作天然藥物和民間滋補(bǔ)食品[3]。它與野生的冬蟲夏草的活性成分、營養(yǎng)價(jià)值及藥用功能均非常相似，并且已經(jīng)實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)，價(jià)格相對(duì)較低，是野生冬蟲夏草的最佳替代品。2009年，中華人民共和國衛(wèi)生部將蛹蟲草列為新資源食品，2019年入選《中華人民共和國農(nóng)業(yè)植物品種保護(hù)名錄(第十一批)》，是一種具有廣闊市場(chǎng)前景的食用藥菌。

但是，蛹蟲草菌株在繼代培養(yǎng)和保藏過程中非常容易退化[4]，菌株退化會(huì)導(dǎo)致子實(shí)體畸形、變少、甚至不產(chǎn)生子實(shí)體[5]，降低了子實(shí)體品質(zhì)和產(chǎn)量，帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失，影響蛹蟲草行業(yè)的發(fā)展。蛹蟲草菌株的退化是蛹蟲草行業(yè)持續(xù)發(fā)展亟待解決的關(guān)鍵問題。本文對(duì)蛹蟲草退化后生物學(xué)特征的變化，引起退化的外界因素、自身遺傳因素和防治措施作一綜述，以期對(duì)今后蛹蟲草菌株的退化研究有所啟發(fā)，為蛹蟲草退化菌株的甄別提供依據(jù)。

1 蛹蟲草退化菌株的概況

1.1 形態(tài)特征

大多數(shù)絲狀真菌，經(jīng)多次繼代培養(yǎng)后，菌株會(huì)出現(xiàn)退化的現(xiàn)象。菌株的退化時(shí)，其菌落形態(tài)會(huì)發(fā)生變化，主要表現(xiàn)在菌落發(fā)生角變，在培養(yǎng)基上出現(xiàn)扇形、半月形和放射形等形狀，其中以扇形為主，菌落的邊緣出現(xiàn)白色絨狀的角突變[6]，如圖1。

A正常菌株菌落；B角變菌株菌落；C退化菌株菌落

蛹蟲草菌株在發(fā)生退化時(shí)，其菌落顏色也會(huì)發(fā)生變化。菌落顏色由橙色變成杏黃色或者由杏黃色變成淡檸檬色及白色，顏色逐漸變淺。并且，退化菌株出現(xiàn)見光后轉(zhuǎn)色慢或不轉(zhuǎn)色現(xiàn)象，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)黃色滲出液[7]。退化菌株的菌絲體形態(tài)也會(huì)發(fā)生變化，用顯微鏡觀察蛹蟲草退化與未退化菌株的菌絲，未退化菌株的菌絲粗壯挺立、分生孢子表現(xiàn)為念珠狀；而退化的菌絲較細(xì)，呈彎曲交錯(cuò)狀，分生孢子聚集在一起成頭狀[8]。

1.2 理化性質(zhì)

蛹蟲草退化菌株的生長速度變慢，產(chǎn)孢能力降低[9]，菌絲生長速度整體呈下降趨勢(shì)。與正常菌株相比，退化菌株的纖維酶活性、淀粉酶活性、過氧化氫酶、脫氫酶等活性降低，以及胞外多糖含量也出現(xiàn)了降低[10]。

蛹蟲草退化菌株的脫色能力降低。MAGAE等[11]和劉洋等[12]研究發(fā)現(xiàn)在加入BTB(溴麝香草酚藍(lán))的液體培養(yǎng)基中，退化菌株脫色能力相對(duì)較差，與未退化菌株相比，退化菌株的脫色率下降、液體培養(yǎng)基的pH升高。

2 蛹蟲草菌株退化機(jī)理

蛹蟲草菌株發(fā)生退化原因主要包括遺傳變異和外界環(huán)境的原因，其中遺傳變異引起退化的決定性因素。

2.1 環(huán)境因素

在生產(chǎn)中，生長子實(shí)體優(yōu)良的蛹蟲草菌株，隨著菌株無性繁殖轉(zhuǎn)管次數(shù)的增加，保藏時(shí)間的加長，保藏溫度的差別，保藏培養(yǎng)基成份的差異，菌株都會(huì)出現(xiàn)不同程度的退化現(xiàn)象[13]，光照、濕度等因素也會(huì)對(duì)菌株產(chǎn)生影響。礦質(zhì)元素對(duì)蛹蟲草菌株退化有影響，如Mn2+和Mg2+會(huì)加速蛹蟲草等的退化[14]。保藏方法對(duì)蛹蟲草退化有重要影響，蛹蟲草菌株在4 ℃保藏超過2個(gè)月，子實(shí)體產(chǎn)量開始下降；菌株傳代次數(shù)超過3代，開始出現(xiàn)退化現(xiàn)象[15]。光照對(duì)蛹蟲草菌絲生長產(chǎn)生抑制作用，長時(shí)間光照會(huì)導(dǎo)致氣生菌絲不發(fā)達(dá)，引起菌株退化[16]。

2.2 遺傳因素

2.2.1 交配型分析

蛹蟲草是一種由交配型基因控制的有性生殖的異宗真菌。汪虹等[17]研究發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草的正常菌株同時(shí)含有MAT-HMG(MAT1-2-1)和MAT-alpha(MAT1-1-1和MAT1-1-2)兩種交配型基因，為異核體，這種情況才能進(jìn)行有性生殖，形成子實(shí)體；退化菌株只含有MAT-HMG或MAT-alpha其中一種交配型基因，為同核體，只能進(jìn)行無性生殖，不能形成子實(shí)體，由此推斷核相的改變可能是導(dǎo)致蛹蟲草退化的原因。然而，另一研究表明，只含一種交配型基因或者兩種交配型基因的蛹蟲草菌株可以產(chǎn)生子實(shí)體，而同時(shí)含有兩種交配型基因的蛹蟲草菌株則不能產(chǎn)生子實(shí)體[18]。兩者研究結(jié)果相反，可能是由于交配型產(chǎn)生偏分離造成的，不同交配型的孢子和菌絲生長能力不同，在多次無性繁殖后，產(chǎn)生偏分離現(xiàn)象，所以導(dǎo)致研究結(jié)果產(chǎn)生差異[19]，對(duì)于交配型的改變是造成退化的原因，還需進(jìn)一步研究。

2.2.2 堿基變異分析

食用菌細(xì)胞分裂周期短、生長速度快，以及無性繁殖的無限性，這都加大了堿基發(fā)生變異的幾率，從而導(dǎo)致菌株發(fā)生退化。Yin等[20]對(duì)蛹蟲草的配型基因和ITS1+5.8S+ITS2、28S、18S進(jìn)行分析，研究發(fā)現(xiàn)蛹蟲草發(fā)生退化后ITS1+5.8S+ITS2、28S區(qū)域未發(fā)生變化，但是18S區(qū)域發(fā)生了7處堿基突變；其交配型基與野生型菌株相比，MAT1-1-1片段發(fā)生了3處堿基突變，但未影響氨基酸序列，MAT1-1-2片段在發(fā)生1處堿基突變，使氨基酸發(fā)生改變，從甘氨酸變?yōu)槔i氨酸，這些堿基變異導(dǎo)致不能形成子實(shí)體；同時(shí)CmMAT1-1-1和CmMAT1-1-2基因的表達(dá)顯著下調(diào)至7.5%和4.4%。蛹蟲草正常菌株和其退化菌株的ITS 區(qū)域堿基序列進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)退化菌株的ITS序列中有個(gè)別堿基位點(diǎn)發(fā)生了變化，說明這兩者在DNA水平產(chǎn)生了明顯的遺傳變異，這種變異可能與蛹蟲草菌株退化相關(guān)[8,21]。

2.2.3 光受體基因分析

有研究表明，蛹蟲草菌種光受體基因Cmwc-1和Cmcry-DASH的缺失可能與退化現(xiàn)象存在一定關(guān)系。光對(duì)于蛹蟲草子實(shí)體的生長至關(guān)重要，Cmwc-1基因與Cmcry-DASH都是蛹蟲草藍(lán)光受體基因，將正常的蛹蟲草菌株敲除Cmwc-1和Cmcry-DASH基因后，ΔCmwc-1菌株的菌絲見光后不變色，ΔCmwc-1菌株也沒有形成原基和子實(shí)體；ΔCmcry-DASH菌株可以形成原基，但子實(shí)體矮小，生長周期變長[22]。所以，若蛹蟲草菌株光受體基因受損，將造成蛹蟲草質(zhì)量和產(chǎn)量下降，出現(xiàn)退化現(xiàn)象。

2.2.4 轉(zhuǎn)錄組分析

近年來，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在真菌抗逆性和退化方面研究越來越多。通過組織分離的菌株具有很多類型的菌絲，不能確保菌源來源的同一性。馮玉杰[23]以單分生孢子進(jìn)行繼代培養(yǎng)，將第1代、第3代和第5代雜交原基形成階段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，共發(fā)現(xiàn)3 229個(gè)顯著差異表達(dá)基因，嚴(yán)重退化菌株中有2 346個(gè)DEGs，從結(jié)果看來，第3代是菌株退化的節(jié)點(diǎn)，且隨著蛹蟲草菌株的退化，差異表達(dá)基因的數(shù)目也逐漸增多。DEGs在生物過程中的GO富集大部分表現(xiàn)在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程，以及表現(xiàn)在毒素生物合成過程和代謝過程、霉菌毒素生物合成過程和代謝過程、次生代謝產(chǎn)物生物合成過程和次生代謝過程，這說明菌株退化可能與這些生物過程有關(guān)。通過對(duì)比正常菌株與退化菌株，DEGs在分子功能中的GO富集主要表現(xiàn)在四吡咯結(jié)合、血紅素結(jié)合和鐵離子結(jié)合等，以及表現(xiàn)在轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)、輔酶結(jié)合、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合、蛋白質(zhì)-精氨酸脫亞胺酶活性、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、信息素受體活性、G蛋白偶聯(lián)受體活和G蛋白偶聯(lián)肽受體活性等，由此可見，菌株發(fā)生退化可能與這些過程有關(guān)。對(duì)篩選得到的DEGs進(jìn)行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草菌株的退化可能與氨基糖和核苷酸糖的代謝、酪氨酸代謝、淀粉和蔗糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、淀粉和蔗糖代謝、谷胱甘肽代謝和苯丙氨酸代謝、次生代謝物的生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化、苯丙氨酸代謝、糖酵解/糖異生、抗生素的生物合成、谷胱甘肽代謝等代謝通路有關(guān)系。

2.3 胞內(nèi)有害物質(zhì)的累積

在生物體的生長發(fā)育的過程中，氨基酸起到重要的作用，不但給生物體提供必須的氮源，合成生物體的組織蛋白，也還參與酶、激素、一部分維生素的合成，對(duì)生物體的生理代謝過程有著重大影響。在苯丙氨酸和酪氨酸代謝過程中，銅胺氧化酶家族基因催化伯胺類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醛，同時(shí)產(chǎn)生過氧化氫和氨，導(dǎo)致蛹蟲草菌株內(nèi)活性氧的增加[24]?；钚匝?ROS)的細(xì)胞積累對(duì)蛹蟲草菌株的退化有直接影響，生物體內(nèi)的活性氧平衡通過谷胱甘肽、氧化氫酶等體系維持，其中的谷胱甘肽具有超強(qiáng)的清除自由基和抗氧化功能[25]。 Sun等[26]將構(gòu)巢曲霉的谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)克隆基因轉(zhuǎn)化到產(chǎn)子實(shí)體菌株和退化菌株中進(jìn)行過量表達(dá)，結(jié)果顯示突變株具有更高的GPX活性和更強(qiáng)的清除細(xì)胞ROS的能力，退化菌株恢復(fù)產(chǎn)子實(shí)體能力，然而，在連續(xù)傳代10次時(shí)，退化菌株的突變體再次發(fā)生退化，喪失了產(chǎn)子實(shí)體的能力，而正常菌株的突變體仍能穩(wěn)定地產(chǎn)生子實(shí)體。這說明蛹蟲草菌株的退化與細(xì)胞中ROS的累積相關(guān)。

3 菌株退化的防治措施

預(yù)防菌株退化的發(fā)生，可采取減少傳代次數(shù)、4 ℃保藏菌種、選育優(yōu)良菌種、菌種復(fù)壯等。在大規(guī)模生產(chǎn)中，盡量減少傳代次數(shù)，傳代次數(shù)不超過3次。蛹蟲草菌種選擇4 ℃保藏，產(chǎn)子實(shí)體的能力維持在1 a以上[27]。菌種復(fù)壯是最常用的方法來應(yīng)對(duì)菌種退化，包括蠶蛹回接法、子囊孢子分離法、分生孢子分離法、基內(nèi)菌絲分離法，實(shí)驗(yàn)證明前兩種復(fù)壯效果較好[28]。改變培養(yǎng)基營養(yǎng)成分可延緩或恢復(fù)其退化現(xiàn)象，比如在培養(yǎng)基中添加組氨酸和賴氨酸[29]，及K+、Ca2+、Zn2+離子。選育優(yōu)良菌株一直是應(yīng)對(duì)退化的最佳方法，主要包括選育優(yōu)良的蛹蟲草進(jìn)行組織分離，采用誘變的方式來篩選高產(chǎn)菌株等，還可以通過菌株雜交來獲得高產(chǎn)菌株。另外，通過基因工程改造法，將谷胱甘肽過氧化物酶克隆基因轉(zhuǎn)化到退化菌種中表達(dá)，可使退化菌種恢復(fù)產(chǎn)子實(shí)體能力。

4 總結(jié)與展望

上述研究表明，蛹蟲草菌株在發(fā)生退化時(shí)，其生物學(xué)特征及理化性質(zhì)會(huì)出現(xiàn)明顯的變化，可以通過這些現(xiàn)象來甄別出退化菌株，從而降低生產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)。目前對(duì)蛹蟲菌株退化的研究主要集中在外界環(huán)境原因和遺傳因素方面，其中遺傳變異是導(dǎo)致菌種退化的決定性因素。蛹蟲草退化的原因復(fù)雜，蛹蟲草菌株退化的機(jī)制眾說紛紜，到目前為止還未能定論。揭示蛹蟲草菌株退化機(jī)制是從根本上解決菌株退化的前提條件，在未來研究中不僅要側(cè)重利用基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行研究，探索堿基突變與退化的關(guān)系，找出差異基因進(jìn)行功能研究等，還要在基因工程改造蛹蟲草菌株方面進(jìn)行鉆研，選育克隆出穩(wěn)定的菌種，從而徹底地解決菌株退化問題。