張彥聰 竇林波 張風(fēng)河

參與牙胚發(fā)育的細(xì)胞因子數(shù)量非常多，其中以BMP家族，F(xiàn)GF家族與牙胚發(fā)育的關(guān)系最為密切[1-2]。研究表明，PAX9是牙間充質(zhì)早期標(biāo)志物[3-4],并受上皮BMP4和FGF8(fibroblast growth factor,成纖維細(xì)胞生長因子)信號(hào)的調(diào)控, FGF8與BMP4互相拮抗定點(diǎn)了口腔外胚層上皮的成牙位點(diǎn)，并具有時(shí)空依賴性，表達(dá)FGF8但不表達(dá)BMP4的區(qū)域表達(dá)PAX9。在牙胚發(fā)育的前期，口腔上皮首先表達(dá)FGF8，成為牙胚將要發(fā)生的標(biāo)志[5]。同時(shí)，F(xiàn)GF8刺激間充質(zhì)在蕾狀期表達(dá)PAX9，而BMP4抑制PAX9的表達(dá)，因此，來自上皮的FGF8與BMP4信號(hào)互相拮抗，共同決定了間充質(zhì)表達(dá)PAX9的區(qū)域，從而確定了未來牙發(fā)生的位點(diǎn)[6]。反過來，間充質(zhì)內(nèi)被誘導(dǎo)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄因子也反饋調(diào)節(jié)上皮內(nèi)的信號(hào)。最典型的是BMP4循環(huán)反饋。在鼠胚胎E 11.5 d，牙胚上皮蕾狀期，BMP4表達(dá)由上皮轉(zhuǎn)移至間充質(zhì)，成牙潛能也由上皮轉(zhuǎn)移至間充質(zhì)。上皮和間充質(zhì)分泌的BMP4均能激活上皮和間充質(zhì)的WNT通路和BMP通路，使信號(hào)循環(huán)反饋，不斷放大[7]?？梢夿MP4在牙胚發(fā)育過程中起到核心作用，BMP4在合適的時(shí)間表達(dá)增強(qiáng)或減弱，進(jìn)而影響其它信號(hào)的變化最終決定了上皮向牙胚發(fā)育。因此在微環(huán)境材料中引入BMP4多肽可激活BMP-WNT 反饋循環(huán)，從而啟動(dòng)牙上皮分化。

納米纖維與細(xì)胞外基質(zhì)的纖維環(huán)境相似，由于其高表面積和體積比，合成或天然生物聚合物納米纖維已被應(yīng)用于支持多能干細(xì)胞的長期培養(yǎng)。這種納米結(jié)構(gòu)有可能準(zhǔn)確地模擬自然的細(xì)胞外基質(zhì)，并為干細(xì)胞的附著和增殖提供亞細(xì)胞尺度上的最佳空間[8-10]。合成聚合物,如PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)、PCL、PHA具有良好的機(jī)械、生物降解性和穩(wěn)定體內(nèi),容易加工和修飾[11-13]。

本課題擬使用PLGA作為基底材料，通過靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建納米纖維支架材料，結(jié)合不同時(shí)間點(diǎn)BMP4的干預(yù)，將鼠胚胎干細(xì)胞(mouse embryonic stem cells, mES cells)向牙上皮細(xì)胞誘導(dǎo)，為全牙再生的研究提供一定的研究思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 納米纖維的制備

35%的PLGA (v/v)溶于55%N, N -二甲基甲酰胺另加10%乙醇，置于靜電紡絲機(jī)的針形注射器內(nèi)，在12 kV電壓，調(diào)節(jié)參數(shù)，制備取向及非取向納米纖維。將納米纖維剪成六孔板孔徑大小備用。掃描電鏡表征納米纖維形貌，接觸角檢測納米纖維親水性。

1.2 鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)

將凍存的鼠胚胎干細(xì)胞自液氮灌中取出，立即放入37 ℃水槽中并快速搖晃進(jìn)行解凍至米粒大小冰球，快速移入15 mL離心管，逐滴加入5 mL DMEM(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)，離心(1 200 r， 5 min)，去上清。加入1 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Ko-DMEM+15%FBS+1% penicillin/streptomycin+ 1% l-glutamic acid+1 000 U/mL leukemia inhibitory factor (LIF)+1% 2-mercaptoethanol+1%非必需氨基酸)，輕輕吹打。然后移入事先鋪過明膠并加有1 mL培養(yǎng)基的六孔板內(nèi)，用培養(yǎng)基清洗凍存管，清洗液也移入孔板中。輕輕搖勻，放入37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日換液。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形貌。

1.3 鼠胚胎干細(xì)胞向口腔上皮誘導(dǎo)培養(yǎng)

將事先準(zhǔn)備好的置入納米纖維的六孔板用75%酒精浸泡消毒30 min后，于超凈臺(tái)中晾干10 min，用前在生物安全柜內(nèi)紫外消毒30 min，之后F12溶液沖洗3 次后開始細(xì)胞培養(yǎng)。0.05%胰酶-EDTA將mES細(xì)胞消化，誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸，吹打成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105mL，接種于6 孔培養(yǎng)板，每孔2 mL，并在不同的時(shí)間加入LDN193189(簡稱LDN)和BMP4，培養(yǎng)14 d。誘導(dǎo)方案分為4 組：(第1 組)對(duì)照組，普通六孔板鋪明膠，加誘導(dǎo)培養(yǎng)基；(第2 組)支架材料+誘導(dǎo)培養(yǎng)基+LDN(第2～4 天)即在48 h加入LDN，持續(xù)作用48 h；(第3 組)支架材料+誘導(dǎo)培養(yǎng)基+LDN(第2～4 天)+BMP4(第2～4 天)，即48 h加LND，持續(xù)作用48 h后，加入BMP4，繼續(xù)作用48 h；(第4 組)支架材料+誘導(dǎo)培養(yǎng)基+LDN(第2～4 天)+持續(xù)加BMP4(第2 天)，即48 h加LND，持續(xù)作用48 h后，加入BMP4直到培養(yǎng)結(jié)束。 24 h后掃描電鏡觀察細(xì)胞貼壁情況。 14 d取各組樣本免疫熒光檢測成牙相關(guān)蛋白PAX9、PITX2表達(dá)。

1.4 鼠胚胎干細(xì)胞向牙上皮誘導(dǎo)培養(yǎng)

48 h后，向培養(yǎng)基內(nèi)加入30 pmol的BMP4，誘導(dǎo)方案分為4 組： (1)空白對(duì)照組：明膠表面+誘導(dǎo)培養(yǎng)基；(2)材料對(duì)照組：誘導(dǎo)培養(yǎng)基+LDN(第2～4 天) +BMP4(第2～4 天)；(3)取向支架材料+誘導(dǎo)培養(yǎng)基+LDN(第2～4 天)+BMP4(第2～4 天)； (4)非取向支架材料+誘導(dǎo)培養(yǎng)基+LDN(第2～4 天) +BMP4(第2～4 天)。以上方案均誘導(dǎo)14 d。免疫熒光檢測成釉細(xì)胞特異性蛋白AMBN表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 納米纖維形貌及鼠胚胎干細(xì)胞形貌

納米纖維材料成白色薄膜狀，掃描電鏡下顯示納米纖維分為非取向性(圖 1A)平均接觸角約53.5度和取向性(圖 1B),平均接觸角約56.6°。鼠胚胎干細(xì)胞復(fù)蘇2 h后貼壁，細(xì)胞呈集落生長，第2 天開始集落趨于緊密，邊緣清晰明亮、鏡下觀察稍稍隆起，細(xì)胞小且排列緊密，細(xì)胞間沒有明顯的界限， 細(xì)胞核大，可見多個(gè)核仁(圖 2A)。 3 d后集落互相融合達(dá)到 60%以上，5 d可傳代(圖 2B)。

2.2 胚胎干細(xì)胞向牙上皮分化

A： 非取向； B： 取向

圖 2 培養(yǎng)中的mES細(xì)胞(倒置顯微鏡, ×100)

2.2.1 鼠胚胎干細(xì)胞向口腔外胚層分化 以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于培養(yǎng)板， 1 d后支架材料組全部貼壁，掃描電鏡下細(xì)胞成團(tuán)狀生長。第2 天有大量細(xì)胞呈放射狀從細(xì)胞團(tuán)內(nèi)爬出。第3 天有大量上皮樣細(xì)胞爬出。此后上皮樣細(xì)胞不斷增多(圖 3)。

2.2.2 外胚層相關(guān)基因的表達(dá) 誘導(dǎo)7 d后，PCR檢測干性基因及外胚層相關(guān)基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)Oct4表達(dá)下降，細(xì)胞干性水平逐漸降低，表皮特異性基因K14在第3 天表達(dá)上調(diào)， 早期外胚層特異性基因K18表達(dá)在第3 天相對(duì)較低，第5 天表達(dá)上調(diào)。在第3天FGF8表達(dá)上調(diào)，并伴隨著BMP4高表達(dá)(圖 4)。

2.2.3 抑制BMP4的功能可誘導(dǎo)mES細(xì)胞向口腔外胚層分化 在第3 天向培養(yǎng)基內(nèi)加入BMP4的抑制劑LDN193189(LDN)，分別抑制不同的時(shí)長(24、 48 h)，免疫熒光檢測口腔外胚層上皮特異性基因Pitx2的表達(dá)情況, 48 h組可見細(xì)胞團(tuán)內(nèi)出現(xiàn)了不同數(shù)量的Pitx2+細(xì)胞(圖 5)，因此得出結(jié)論，抑制BMP4 48 h最有利于mES細(xì)胞向口腔外胚層分化。

2.2.4 短暫的外源性BMP4刺激可進(jìn)一步誘導(dǎo)口腔外胚層細(xì)胞向牙上皮細(xì)胞分化 48 h后加入30 pmol外源性BMP4刺激，可見第1 組只能見到少量熒光，其余組均有一定的AMBN熒光出現(xiàn)(圖 6)。每組隨機(jī)選取35 個(gè)點(diǎn)進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析，結(jié)果顯示，第3 組AMBN表達(dá)明顯高于其它組(圖 6)。表明短暫的外源性BMP4刺激可促進(jìn)mES細(xì)胞向牙上皮細(xì)胞分化。取向納米纖維支架材料較非取向納米纖維支架材料更有利于mES細(xì)胞向牙上皮細(xì)胞分化。

圖 3 胚胎干細(xì)胞分化過程中形態(tài)變化(倒置顯微鏡)

圖 4 外胚層相關(guān)基因的表達(dá)變化

3 討 論

本研究經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，采用多種方式對(duì)鼠胚胎干細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)，通過檢測早期外胚層特異性基因及表皮特異性基因，最終摸索出了一套能將鼠胚胎干細(xì)胞向牙上皮誘導(dǎo)的方案。用該方案誘導(dǎo)鼠胚胎干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)表皮特異性基因K14在第3 天表達(dá)上調(diào)，而早期外胚層特異性基因K18表達(dá)在第3 天相對(duì)較低，第5 天表達(dá)上調(diào)。同時(shí)在第3 天FGF8表達(dá)上調(diào)，并伴隨著BMP4高表達(dá)。這些現(xiàn)象表明第3 天mES開始向K14陽性的角化上皮分化，而第3 天FGF8表達(dá)很高，其基因的轉(zhuǎn)錄水平與鼠胚胎E 10.5 d的口腔上皮相似。然而不同的是此時(shí)BMP4表達(dá)亦很高，因此我們向培養(yǎng)基內(nèi)加入LDN193189，抑制BMP4的功能，從而使FGF8相對(duì)處于優(yōu)勢，有利于mES細(xì)胞向口腔外胚層分化，口腔外胚層細(xì)胞最終分化為成釉細(xì)胞。在牙齒發(fā)育過程中，牙釉質(zhì)基質(zhì)蛋白(Ameloblastin，AMBN),在維持成釉細(xì)胞的分化狀態(tài)中起著至關(guān)重要的作用。研究表明在Ameloblastin突變的小鼠中，成釉細(xì)胞很快失去極性，增殖，并形成了多個(gè)細(xì)胞層，最終導(dǎo)致牙釉質(zhì)發(fā)育不全[14]。因此AMBN一直以來被作為成釉細(xì)胞分化的特異性標(biāo)志物。當(dāng)口腔外胚層細(xì)胞成功表達(dá)Pitx2后向培養(yǎng)基內(nèi)加入外源性的BMP4，檢測成釉細(xì)胞標(biāo)志性蛋白顯示有AMBN表達(dá)，表明在合適的時(shí)間點(diǎn)先抑制BMP4的功能， 繼而在合適的時(shí)間點(diǎn)加入外源性BMP4可誘導(dǎo)mES細(xì)胞向牙上皮方向分化。

圖 5 Pitx2的表達(dá)

圖 6 AMBN免疫熒光圖

可見BMP4在鼠胚胎干細(xì)胞向牙上皮細(xì)胞分化過程中發(fā)揮了重要的作用。經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)途徑被認(rèn)為在牙胚發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)Wnt信號(hào)被激活后，可抑制β-catenin的磷酸化，非磷酸化的β-catenin不會(huì)被水解并能進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[15-16]。BMP4是影響牙胚發(fā)生和發(fā)育最關(guān)鍵的因子， BMP4和Wnt信號(hào)通路在mES細(xì)胞向牙上皮細(xì)胞分化過程中參與方式有待于進(jìn)一步研究。

該培養(yǎng)體系內(nèi)引入了PLGA納米纖維，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明取向性納米纖維更有利于鼠胚胎干細(xì)胞向牙上皮分化，推測可能是取向性納米纖維更類似于牙胚細(xì)胞外基質(zhì)纖維排列。