王亞楠， 張 文

（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球≥5歲兒童嚴(yán)重肺炎的病死率為8.9%[1]，包括肺炎在內(nèi)的嚴(yán)重急性呼吸道感染是兒童入院和死亡的主要原因[2]。在我國，呼吸道感染占兒科門診的絕大部分，其中80%是呼吸道病毒感染[3]。目前，臨床上常見的病毒主要有流感病毒（influenza virus，Inf）、副流感病毒（parainfluenza virus，PIV）、合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）和腺病毒（adenoviridae，ADV）等[4]。病毒的暴發(fā)性傳染會給公眾，尤其是免疫功能尚不健全的兒童帶來巨大的威脅。如果能對環(huán)境中潛伏的呼吸道病毒進(jìn)行有效的監(jiān)測，及早發(fā)現(xiàn)具有致病性的未知病毒，或已知病毒的變異株，對疫情防控有很高的價(jià)值。

目前，臨床常規(guī)的病毒檢測方法有聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction ，PCR）、細(xì)胞培養(yǎng)法、掃描電鏡檢測法、特異性抗體檢測法[5]，但是傳統(tǒng)方法都各有無法避免的缺點(diǎn)，最大的弊端是只能檢測已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的病毒，很難檢測新型病毒[6]。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，病毒宏基因組學(xué)逐漸成為非培養(yǎng)的高通量病毒核酸檢測的最佳選擇，其突破了傳統(tǒng)方法的局限性，直接以環(huán)境中所有病毒的遺傳物質(zhì)作為研究對象，可快速鑒定出環(huán)境中所有病毒的組成，從而發(fā)現(xiàn)新病毒，監(jiān)測病毒的變異情況。本研究采用病毒宏基因組學(xué)方法，分析上呼吸道感染患兒鼻腔微環(huán)境病毒群落的組成，從而為兒童上呼吸道病毒感染的預(yù)防及臨床治療提供幫助。

1 材料和方法

1.1 樣本收集

收集2013年7月—2014年6月江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院100份1～6歲上呼吸道病毒感染患兒鼻黏膜分泌物拭子樣本。為避免交叉感染，采集過程全部使用一次性用具。用無菌棉簽采集鼻黏膜分泌物后，剪下棉簽頭放置于裝有500 μL不含鈣鎂離子杜氏磷酸鹽緩沖液的1.5 mL離心管內(nèi)充分混勻，然后迅速放入-80 ℃冰箱冷凍保存?；純杭{入標(biāo)準(zhǔn)：近期出現(xiàn)咳嗽、咽痛、打噴嚏、流涕、鼻塞或發(fā)熱（＞37.3 ℃）等上呼吸道感染癥狀的不同年齡段兒童。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）已服用抗菌藥物或抗病毒藥物；（2）細(xì)菌培養(yǎng)檢測出致病菌；（3）無支原體和衣原體等其他非經(jīng)典微生物感染。

1.2 主要儀器及試劑

0.5 mL超濾離心管（美國Millipore公司），QIAamp Viral RNA Mini Kit和PCR產(chǎn)物純化試劑盒（上海Qiagen公司），SuperScript Ⅲ reverse transcriptase（Invitrogen）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA消化酶及RNA消化酶（美國Life technologies公司），Nextera XT DNA Sample Preparation Kit for 96 Samples高通量測序DNA文庫構(gòu)建試劑盒和Nextera XT Index Kit for 96 Indexes DNA文庫接頭添加試劑盒（美國Illumina公司），Agencourt AMPure XP Kit（美國Beckman公司）。高通量測序平臺為美國Illumina公司MiSeq臺式測序儀。

1.3 方法

1.3.1 患兒鼻黏膜分泌物前處理 從-80 ℃冰箱中取出鼻黏膜分泌物懸液，冰上融化并劇烈振蕩5 min，15 000×g4 ℃離心10 min，取上清過濾后收集濾液。

1.3.2 樣本組合設(shè)計(jì) 隨機(jī)將100份樣本分成10組，并分別編號為KYD01～10，每組10份樣本，每份樣本各取40 μL濾液制備成混合懸液，構(gòu)成10個(gè)樣本池。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)方法 （1）本研究鼻黏膜分泌物樣本的核酸酶消化溫度為37 ℃，時(shí)間為60 min。當(dāng)消化反應(yīng)進(jìn)行30 min后，取出酶反應(yīng)溶液輕輕混勻幾次，依次加入反應(yīng)緩沖液、DNA消化酶和RNA消化酶，使呼吸道分泌物懸液至總體積為200 μL；（2）經(jīng)過酶消化后的樣本中主要為病毒核酸，采用QIAamp Viral RNA Mini Kit同時(shí)提取病毒DNA和RNA，混勻后置于冰上備用；（3）逆轉(zhuǎn)錄及合成雙鏈DNA，提取病毒核酸后，以6種堿基隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成RNA病毒的cDNA鏈，利用Klenow酶進(jìn)行反應(yīng)合成cDNA及單鏈DNA病毒的互補(bǔ)鏈，此時(shí)得到的反應(yīng)產(chǎn)物是雙鏈DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?；?）高通量測序文庫的構(gòu)建及文庫擴(kuò)增，取出保存的Klenow產(chǎn)物、ATM、NPM、TD buffer、NT buffer，融化、混勻后離心，按照說明書要求進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物的分布；（5）文庫純化，用Qiaquick PCR purification Kit除去文庫中的引物二聚體，保存?zhèn)溆?，Miseq測序平臺要求文庫DNA長度為300～800 bp，因此本研究需使用Ampure Beads對文庫DNA長度進(jìn)行篩選優(yōu)化，具體操作按照AMPure XP beads說明書進(jìn)行；（6）病毒文庫質(zhì)量檢測及樣本內(nèi)病毒群落分析，在測序前需要使用Agilent Bioanalyzer 2100生物分析儀（德國Agilent公司）對優(yōu)化好的文庫質(zhì)量進(jìn)行檢測，達(dá)到測序標(biāo)準(zhǔn)才能進(jìn)行深度測序，采用Illumina MiSeq測序平臺進(jìn)行測序，高通量測序結(jié)束后，將各樣本的原始數(shù)據(jù)在江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院病毒宏基因組學(xué)分析平臺服務(wù)器內(nèi)進(jìn)行病毒群落分析[7]。

2 結(jié)果

測序結(jié)果顯示，10個(gè)文庫中的9個(gè)文庫（KYD04未檢出病毒）中至少有14個(gè)病毒科，種類豐富，病毒組成基本相似，但是序列數(shù)差異較大（圖1）。上呼吸道感染患兒鼻腔微環(huán)境內(nèi)病毒群落主要由腺病毒科（30.13%）、小RNA病毒科（24.04%）、冠狀病毒科（11.22%）、指環(huán)病毒科（10.58%）、多瘤病毒科（10.58%）、副黏液病毒科（7.37%）等組成，其中腺病毒科和小RNA病毒科處于主導(dǎo)地位。見圖2。

圖1 9個(gè)文庫的病毒群落組成

圖2 10個(gè)文庫中病毒群落的組成

3 討論

本研究采用病毒宏基因組學(xué)技術(shù)對江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院100份上呼吸道病毒感染患兒鼻腔黏膜樣本進(jìn)行初步分析，對其中的病毒類型有了初步了解。本研究結(jié)果表明，鎮(zhèn)江地區(qū)上呼吸道病毒感染患兒鼻腔內(nèi)病毒類型較為豐富，主要為腺病毒科和小RNA病毒科。

腺病毒基因組序列具有高度的重組和變異特點(diǎn)。腺病毒在發(fā)生變異和重組后，易在人群中引起暴發(fā)和流行。另外，腺病毒最常發(fā)生于 6個(gè)月～2歲兒童，是引起兒童呼吸道感染的常見病毒之一，也是兒童社區(qū)獲得性肺炎常見的病原體之一，患兒有較為嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)，肺外并發(fā)癥多，易遺留慢性氣道和肺疾病，病死率高，后遺癥多，是目前造成嬰幼兒肺炎致殘和死亡的重要病因之一[8]。對腺病毒進(jìn)行有效監(jiān)測，有利于及時(shí)發(fā)現(xiàn)腺病毒變異及流行型別變化，從而為控制腺病毒暴發(fā)和流行提供科學(xué)證據(jù)和研究基礎(chǔ)。

小RNA病毒科屬于微小核糖核酸目，由RNA病毒中最小的類群組成，主要為人鼻病毒（human rhinovirus，HRV）和人腸道病毒（human enterovirus，HEV）。HRV是引起人類病毒性呼吸道感染的最常見病原體之一，也是人類普通感冒的主要致病因素。HRV感染全年均可發(fā)生，春秋季較流行，感染后癥狀輕微，易被忽略，但越來越多的證據(jù)表明HRV是引起急性呼吸道感染患兒死亡的主要病原之一，且與肺炎、細(xì)支氣管炎、哮喘急性發(fā)作密切相關(guān)[9]，會引發(fā)嚴(yán)重的后遺癥，極大地影響患者的生活質(zhì)量。HEV主要經(jīng)消化道、呼吸道傳播，兒童為易感人群，高發(fā)于夏秋季，有一定的季節(jié)性，除引起呼吸道感染外，還可引起無菌性腦膜炎綜合征、心肌炎和心包炎、肌炎和關(guān)節(jié)炎、出疹性疾病、手足口病、流行性出血性結(jié)膜炎等多種疾病[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，除一些致病性病毒外，鎮(zhèn)江地區(qū)上呼吸病毒感染患兒鼻腔內(nèi)還有一些植物病毒，如可能來源于食物或環(huán)境中的花椰菜病毒科；另外，冠狀病毒科除其變異種外，較多報(bào)道于動物身上，可能與寵物接觸或者飲食有關(guān)。并不能確定是否有潛在感染性，還需要進(jìn)一步研究。

本研究的文庫3中還發(fā)現(xiàn)了多瘤病毒科（10.58%），但具體是哪種病毒，是否會誘發(fā)腫瘤，還需要進(jìn)一步追蹤，以獲得更多的數(shù)據(jù)。

病毒宏基因組學(xué)目前已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、公共衛(wèi)生、環(huán)境和動物疾病等研究領(lǐng)域[11]。該方法主要利用病毒體積小和病毒的蛋白質(zhì)衣殼對核酸有保護(hù)作用來實(shí)現(xiàn)對病毒的檢測[12]，與傳統(tǒng)方法比較，病毒宏基因組學(xué)在對已知和未知病毒的檢測上均有強(qiáng)大的優(yōu)勢，但也有一些技術(shù)瓶頸和缺點(diǎn)，且因成本較高，還不能在臨床普及。相信隨著生物技術(shù)的發(fā)展，病毒宏基因組學(xué)一定可以展現(xiàn)出更多的優(yōu)勢，更好地造福人類。