黃劍強(qiáng)，魏雯璐 ，鐘如卓，張家煒，楊創(chuàng)業(yè) ,2，王慶恒 ,2

（1廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東湛江524088；2廣東省海水養(yǎng)殖生物育種工程實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江524088）

0 引言

Ritossa[1]首次發(fā)現(xiàn)短暫的熱休克能誘導(dǎo)果蠅唾液腺染色體在3個(gè)區(qū)域出現(xiàn)膨突，該區(qū)帶轉(zhuǎn)錄加強(qiáng)，這一現(xiàn)象被稱(chēng)為“熱休克反應(yīng)(Heat shock response,Hsr)”。1974年，有研究工作者[2]在對(duì)果蠅唾液腺細(xì)胞進(jìn)行熱休克處理后，分離出一種特殊蛋白質(zhì)，并證實(shí)該蛋白的合成能引起果蠅幼蟲(chóng)染色體蓬松的現(xiàn)象，這種在熱刺激下產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，被稱(chēng)為熱休克蛋白(Heat shock proteins,Hsp)。熱休克蛋白70(Heat shock proteins 70,Hsp70)家族，普遍存在于原核及真核生物中，是一類(lèi)高度保守性的蛋白質(zhì)[3]。其結(jié)構(gòu)主要分為多肽結(jié)合區(qū)、ATP酶區(qū)和功能不明區(qū)三部分[4]，參與蛋白質(zhì)正確折疊、環(huán)境抗逆、細(xì)胞凋亡和免疫反應(yīng)等許多重要生理活動(dòng)[5]。Hsp70家族可分為4個(gè)主要的成員：（1）誘導(dǎo)型 Hsp70(72 kDa)；（2）組成型 Hsc70(73 kDa)；（3）位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白（GRP78或Bip，78 kDa）；（4）位于線粒體的Mtp70(75 kDa)[6-7]。其中Hsc70在正常生理和環(huán)境下具有較為穩(wěn)定的表達(dá)，參與了蛋白質(zhì)的成熟[8]、蛋白質(zhì)向細(xì)胞器的轉(zhuǎn)運(yùn)[9]、胞吞作用[10]以及調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[11]等重要過(guò)程。在卵母細(xì)胞中，Hsc70 mRNA的沉默會(huì)導(dǎo)致燈刷染色體轉(zhuǎn)錄可逆性的抑制[12]。此外，Hsc70還參與類(lèi)固醇受體的成熟和信號(hào)傳導(dǎo)[13]。這些研究均表明Hsc70對(duì)性腺乃至卵母細(xì)胞的發(fā)育具有重要的作用。

光裸星蟲(chóng)(Sipunculus nudus)俗稱(chēng)沙蟲(chóng)，味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富[14]，廣泛分布于沿海暖水性潮間帶，為中國(guó)華南地區(qū)重要的珍貴海產(chǎn)品之一，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[15]。近年來(lái)，由于近岸環(huán)境的污染以及破壞式采捕行為，光裸星蟲(chóng)的自然資源量明顯下降，這促使廣東湛江、廣西北海、海南儋州等地沿海地區(qū)逐漸開(kāi)展了光裸星蟲(chóng)的繁殖生物學(xué)研究[16-17]和人工養(yǎng)殖試驗(yàn)[18]。然而，目前光裸星蟲(chóng)苗種的質(zhì)量和產(chǎn)量處于很不穩(wěn)定的狀態(tài)，苗種人工繁殖主要受到了光裸星蟲(chóng)精卵發(fā)生的不同步性制約[19]，且光裸星蟲(chóng)繁殖生物學(xué)的研究主要集中在形態(tài)學(xué)上[16,20]，對(duì)于分子機(jī)制上研究較少。

本研究通過(guò)RACE技術(shù)獲得光裸星蟲(chóng)Sn-hsc70的cDNA全長(zhǎng)，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)及表達(dá)分析，探討Sn-hsc70在光裸星蟲(chóng)卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的作用。研究結(jié)果為深入認(rèn)識(shí)光裸星蟲(chóng)卵母細(xì)胞發(fā)育的分子機(jī)制積累基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用材料來(lái)自湛江市下六鎮(zhèn)，均為有活力、無(wú)損傷、規(guī)格基本一致(12.92±1.68 g)的光裸星蟲(chóng)。

用無(wú)菌海水沖洗光裸星蟲(chóng)體表的泥沙，雌雄分開(kāi)，隨機(jī)選取30尾雌蟲(chóng)，使用2.5 mL無(wú)菌注射器抽取體腔液，分離不同時(shí)期的卵母細(xì)胞，具體方法參考王慶恒等[16]和張家煒[21]，使用100目、150目、300目、500目的細(xì)胞篩將卵母細(xì)胞按照直徑大小分為O1-O4四個(gè)時(shí)期（O1：＜48 μm，卵黃形成初期；O2：48～108 μm，卵黃旺盛合成前期；O3：108～150 μm，卵黃旺盛合成后期；O4：＞150 μm，成熟期），收集到腎管中的卵母細(xì)胞為O5時(shí)期樣品，從腎管中自然排放體外的卵母細(xì)胞為O6時(shí)期樣品。試驗(yàn)在廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室，于2018年6月份進(jìn)行。

1.2 Sn-hsc70基因全長(zhǎng)cDNA克隆

按照Trizol法提取上述實(shí)驗(yàn)樣品的總RNA，NanoDrop 1000微量紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)所提取RNA的濃度和質(zhì)量，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA是否有降解、污染等。選擇經(jīng)過(guò)上述步驟確認(rèn)合格的RNA樣品依據(jù)Reverse Transcriptase M-MLV(NaseH)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20℃保存，備用。利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 6.0，按照引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)Sn-hsc70的引物，見(jiàn)表1。

表1 Sn-hsc70基因克隆及熒光定量的引物序列

1.3 Sn-hsc70序列分析

將測(cè)序結(jié)果導(dǎo)入DNAMAN 8軟件并對(duì)其進(jìn)行拼接，得到Sn-hsc70序列全長(zhǎng)；通過(guò)在線分析工具ORF Finder預(yù)測(cè)Sn-hsc70的開(kāi)放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)和并翻譯出氨基酸序列；ProtParam進(jìn)行蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；ProtScale預(yù)測(cè)蛋白親水性；NCBI Blast進(jìn)行氨基酸序列的同源性分析；Phyer2預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)；Pfam進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；使用Mega X軟件構(gòu)建生物系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。在線工具的網(wǎng)址為：ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)；ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）；NCBI Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)；Phyer2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/html/page.cgi?id=index)； Smart (http://smart.embl-heidelberg.de/)；MEME (http://memesuite.org/index.html)；ProtScale (https://web.expasy.org/protscale/)。

1.4 Sn-hsc70差異表達(dá)分析

以60S-L7作為內(nèi)參基因[19]，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)技術(shù)在Roche LightCycler?96在系統(tǒng)上檢測(cè)Sn-hsc70基因在光裸星蟲(chóng)卵子發(fā)生各個(gè)階段的差異表達(dá)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組重復(fù)，具體PCR流程參照張家煒等[19]。分析熒光定量PCR結(jié)果，SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，顯著性水平P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sn-hsc70基因序列特征分析

Sn-hsc70基因cDNA全長(zhǎng)2516 bp，其中5'UTR為 114 bp；3'UTR 為 429 bp，ORF為 1971 bp，編碼656個(gè)氨基酸。推導(dǎo)的Sn-Hsc70蛋白除了具有3個(gè)Hsp70蛋白家族的3個(gè)特征序列(IDLGTTYS、IFDLGGGTFDVSIL、IVLVGGSTRIPKIQK)外，還具Hsc70蛋白特有的連續(xù)重復(fù)的四肽序列(GGXP)；此外Sn-Hsc70蛋白具有2個(gè)核定位序列(DAKRL、KRKYKKDISDNKRAVRR)以及羧基端（C端）的胞質(zhì)定位序列（EEVD）（圖1）。

圖1 Sn-hsc70 cDNA序列全長(zhǎng)及推導(dǎo)的氨基酸序列

2.2 Sn-Hsc70蛋白序列分析

蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)表明Sn-Hsc70蛋白分子量為71.65 kDa；親水性氨基酸比例遠(yuǎn)高于疏水性氨基酸（圖2），總平均親水性(grand averageofhydropathy,GRAVY)為-0.46，屬于親水性蛋白。信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示Sn-Hsc70蛋白無(wú)信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)。蛋白功能位點(diǎn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，Sn-Hsc70蛋白具有5個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、1個(gè)cAMP和cGMP依賴(lài)的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、5個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、16個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)、20個(gè)N-肉豆蔻酰化位點(diǎn)、1個(gè)酰胺化和1個(gè)ATP/GTP結(jié)合位點(diǎn)。Sn-Hsc70蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)α螺旋、β轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無(wú)規(guī)卷曲分別占整體的40.70%、7.77%、18.14%和33.38%。

圖2 Sn-Hsc70蛋白殘基親水性分布圖

2.3 Hsc70同源蛋白多序列比對(duì)

對(duì)Sn-Hsc70以及武昌魚(yú)(Megalobrama amblycephala,ACC93993.2)、鰱魚(yú)(Hypophthalmichthys molitrix,EU816594.1)、草魚(yú)(Ctenopharyngodon idella,EU816595.1)、智人 (Homo sapiens,CAA68445.1)、萊桑池蛙(Pelophylax lessonae,ACY69995.1)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis,AAH41201.1)、紫海膽(Strongylocentrotus purpuratus,XP_802129.1)、長(zhǎng)牡蠣(Crassostrea gigas,AJ305315.1)的同源Hsc70蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)同源Hsc70蛋白之間共有的3個(gè)Hsp70家族特征序列高度保守。羧基端（C端）具有連續(xù)多次重復(fù)的四肽序列(GGXP)以及胞質(zhì)定位序列(EEVD)（圖3）。

圖3 Hsc70同源蛋白多序列比對(duì)

2.4 Sn-Hsc70蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

分別對(duì)光裸星蟲(chóng)、雙齒圍沙蠶(Perinereis aibuhitensis,ADR66514.1)和櫛孔扇貝(Azumapecten farreri,AAO38780.1)的Hsc70進(jìn)行蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析。結(jié)果顯示3個(gè)Hsc70同源蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)高度保守（圖4）。

圖4 光裸星蟲(chóng)(a)、雙齒圍沙蠶(b)和櫛孔扇貝(c)的Hsc70蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)

2.5 Sn-Hsc70系統(tǒng)發(fā)育和結(jié)構(gòu)域分析

對(duì)13條Hsc70同源蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建和結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。結(jié)果表明Hsc70蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分為無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物兩大支，在無(wú)脊椎動(dòng)物中又細(xì)分為兩支，一支屬于棘皮動(dòng)物，另一支包括了軟體動(dòng)物、星蟲(chóng)動(dòng)物以及環(huán)節(jié)動(dòng)物。光裸星蟲(chóng)先與雙齒圍沙蠶聚為一支，再與可口革囊星蟲(chóng)聚為一支（圖5）。13條Hsc70同源蛋白均具有一個(gè)Hsp70蛋白家族結(jié)構(gòu)域，除了長(zhǎng)牡蠣結(jié)構(gòu)域較短外，其余12條Hsc70同源蛋白的位置及長(zhǎng)度較為一致。

圖5 同源Hsc70的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)及結(jié)構(gòu)域

2.6 Sn-hsc70表達(dá)模式分析

利用qRT-PCR檢測(cè)了Sn-hsc70在卵母細(xì)胞6個(gè)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，Sn-hsc70在光裸星蟲(chóng)卵母細(xì)胞發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，整體表達(dá)模式呈單峰型。在體腔液發(fā)育時(shí)期(O1-O4)表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，其中O3和O4時(shí)期Sn-hsc70表達(dá)量顯著高于其他時(shí)期(P＜0.05)。進(jìn)入腎管后(O5)Sn-hsc70表達(dá)量迅速下降，直到卵母細(xì)胞的外排后(O6)Sn-hsc70的表達(dá)維持在較低的水平，O5和O6無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

3 討論

Hsp70家族蛋白包含4個(gè)主要成員，其中誘導(dǎo)型的Hsp70與組成型的Hsc70兩者在序列和功能上具有較高的相似性[22]。研究表明，Hsc70與Hsp70均具有Hsp70蛋白家族的3個(gè)特征序列(IDLGTTYS、IFDLGGGTFDVSIL、IVLVGGSTRIPKIQK)，不同的是Hsc70蛋白C端具有多個(gè)連續(xù)重復(fù)的四肽序列(GGXP)，而Hsp70在大多數(shù)情況下僅有一個(gè)GGXP序列[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)Sn-Hsc70蛋白具有Hsp70家族的3個(gè)特征序列，C端具有4個(gè)連續(xù)重復(fù)的GGXP序列，這些證據(jù)表明本研究所克隆獲得的cDNA序列為hsc70基因。

生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Sn-Hsc70屬于親水性蛋白，在功能位點(diǎn)的搜索中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)及糖基化位點(diǎn)。研究表明蛋白質(zhì)磷酸化在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用，糖基化在蛋白質(zhì)折疊，寡聚化，質(zhì)量控制，分類(lèi)和運(yùn)輸中具有重要的功能[25]。這與Hsc70蛋白參與了類(lèi)固醇受體的成熟與信號(hào)傳導(dǎo)以及蛋白質(zhì)的折疊、組裝和運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程相吻合[26-27]。

圖6 Sn-hsc70在卵母細(xì)胞各發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量

在正常條件下，Hsc70存在于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中，它有助于胞質(zhì)蛋白（如細(xì)胞周期蛋白D1）的入核轉(zhuǎn)運(yùn)，因此Hsc70蛋白被認(rèn)為能在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間移動(dòng)[28-30]。本研究對(duì)包括Sn-Hsc70在內(nèi)的9條Hsc70同源蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)所有Hsc70同源蛋白均具有胞質(zhì)定位序列(EEVD)和兩個(gè)核定位序列；這與Hsc70介導(dǎo)胞質(zhì)蛋白入核轉(zhuǎn)運(yùn)功能相吻合。Sn-Hsc70同時(shí)具有胞質(zhì)及細(xì)胞核定位序列，推測(cè)Sn-Hsc70可能介導(dǎo)了卵母細(xì)胞質(zhì)中一些胞質(zhì)蛋白的入核轉(zhuǎn)運(yùn)。此外，EEVD通過(guò)靜電相互作用介導(dǎo)熱休克蛋白組織蛋白(Hsp-organizing protein,Hop)與Hsc70和Hsp90的結(jié)合，有助于轉(zhuǎn)錄因子、激酶以及類(lèi)固醇激素等底物的組裝和成熟[31]。Sn-Hsc70末端的EEVD序列可能通過(guò)與分子伴侶的結(jié)合參與某些蛋白的組裝與成熟過(guò)程。

研究表明hsc70在人卵巢和胚胎中具有豐富表達(dá)，其表達(dá)水平遠(yuǎn)超肌動(dòng)蛋白和微管蛋白[32]，這暗示了hsc70對(duì)性腺和胚胎發(fā)育具有重要的作用。光裸星蟲(chóng)生殖方式較為特別，無(wú)肉眼可見(jiàn)的性腺，卵母細(xì)胞游離于體腔液中發(fā)育，當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累完成后，卵母細(xì)胞被腎管收集，進(jìn)行短暫的儲(chǔ)存后由腎口排放于海水中[29]。本研究檢測(cè)了Sn-hsc70在卵母細(xì)胞6個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量，結(jié)果表明在體腔液發(fā)育過(guò)程中(O1-O4)Sn-hsc70的表達(dá)逐漸上升，其中從卵黃合成初期進(jìn)入卵黃旺盛合成期時(shí)(O2-O3)表達(dá)量顯著上調(diào)。研究表明光裸星蟲(chóng)卵母細(xì)胞在體腔液發(fā)育過(guò)程中可能經(jīng)歷了G1-P I期（減數(shù)分裂間期的G1、S、G2和第一次減數(shù)分裂前期P I）[21]，而該減數(shù)分裂過(guò)程是在一些性激素的調(diào)控下啟動(dòng)的[33]。有研究表明hsc70會(huì)響應(yīng)雌激素和孕激素的刺激而表達(dá)量上升[34]。這暗示了體腔液中性激素的刺激可能是導(dǎo)致Sn-hsc70在O1-O4時(shí)期表達(dá)量上升的原因之一。

一般來(lái)說(shuō)卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程一般會(huì)經(jīng)歷1～2次停滯過(guò)程；第一次停滯發(fā)生在PI期，此時(shí)形成燈刷染色體(lampbrush chromosome)，并進(jìn)行旺盛的轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程，為后期胚胎發(fā)育積累充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、卵源mRNA以及酶等的物質(zhì)[35]。有研究表明hsc70參與了卵母細(xì)胞燈刷染色體的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)[12]以及新生蛋白的折疊、組裝、轉(zhuǎn)移等過(guò)程[12]。在光裸星蟲(chóng)卵母細(xì)胞體腔液發(fā)育過(guò)程中，卵黃等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的大量積累[16]，這可能與Sn-hsc70在O3和O4時(shí)期的大量表達(dá)有關(guān)，說(shuō)明Snhsc70可能對(duì)卵黃形成具有重要作用，而與燈刷染色體之間的關(guān)系還有待深入研究。

光裸星蟲(chóng)脫離體腔液后，卵母細(xì)胞失去了體腔液營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，蛋白的合成減弱；此時(shí)卵母細(xì)胞停滯在第一次減數(shù)分裂的中期，燈刷染色體凝縮，轉(zhuǎn)錄也減弱。本研究發(fā)現(xiàn)，光裸星蟲(chóng)卵母細(xì)胞脫離體腔液后(O5-O6)Sn-hsc70的表達(dá)大幅下降，且表達(dá)量顯著低于其他時(shí)期(P＜0.05)。這可能與卵母細(xì)胞脫離體腔液環(huán)境、轉(zhuǎn)錄與蛋白質(zhì)合成減弱等過(guò)程有關(guān)。

4 結(jié)論

Sn-hsc70基因全長(zhǎng)2516 bp，具有3個(gè)Hsp70家族特征序列，2個(gè)核定位序列，1個(gè)胞質(zhì)定位序列，以及4次連續(xù)重復(fù)的GGXP序列。胞質(zhì)定位序列與核定位序列與Hsc70在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間穿梭的功能相吻合；連續(xù)重復(fù)的GGXP以及3個(gè)Hsp70特征序列是鑒定Hsc70蛋白的重要依據(jù)。Sn-hsc70在體腔液發(fā)育時(shí)期的快速上升可能對(duì)卵黃積累具有重要作用；脫離體腔液后，Sn-hsc70表達(dá)量顯著下調(diào)可能與卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄與蛋白質(zhì)合成減弱等有關(guān)。