陶林林，李國(guó)臻，楊志偉，耿亞松，戴芳芳，郭鈺英，霍志欣，鄭波

隨著輔助生殖技術(shù)的不斷發(fā)展，如何提高妊娠率、降低多胎率是生殖工作者一直在研究的問題。影響輔助生殖技術(shù)妊娠率的因素有很多，包括卵子質(zhì)量、精子質(zhì)量、促排卵方案及胚胎培養(yǎng)環(huán)境等，其中精液質(zhì)量的好壞直接影響臨床妊娠結(jié)局[1]，影響精液質(zhì)量的因素有很多，如年齡、取精環(huán)境、季節(jié)、禁欲天數(shù)等[2-3]。關(guān)于禁欲天數(shù)對(duì)于精液質(zhì)量及宮腔內(nèi)人工授精(intrauterine insemination，IUI)妊娠結(jié)局的影響，國(guó)內(nèi)外均有大量的研究，但禁欲天數(shù)對(duì)于體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)的影響等鮮有報(bào)道，本研究將禁欲天數(shù)分為兩組，比較不同禁欲天數(shù)對(duì)體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植(in vitro fertilization,IVF/intro cytoplasmic sperm injection-embryo transfer ，ICSI-ET)胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局的影響，旨在探討禁欲天數(shù)與IVF/ICSI-ET妊娠結(jié)局之間的關(guān)系，為臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性分析在邢臺(tái)不孕不育專科醫(yī)院生殖中心2017年1月至2019年12月行IVF或ICSI治療的患者，共2 167個(gè)周期，包括1 699個(gè)IVF周期(A組)和468個(gè)ICSI周期(B組)。分別根據(jù)男方禁欲天數(shù)的不同各分為兩個(gè)亞組：A1組，IVF禁欲天數(shù)1～3 d，共806個(gè)周期；A2組，IVF禁欲天數(shù)4～7 d，共893個(gè)周期；B1組，ICSI禁欲天數(shù)1～3 d，共217個(gè)周期；B2組，ICSI禁欲天數(shù)4～7 d，共251個(gè)周期，分析不同禁欲天數(shù)對(duì)IVF和ICSI胚胎發(fā)育和妊娠結(jié)局的影響。

納入標(biāo)準(zhǔn):① 女方年齡<40歲；② 獲卵數(shù)≥6枚；③ 促排卵方案為長(zhǎng)方案。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 經(jīng)皮附睪精子抽吸術(shù)及睪丸精子抽吸術(shù)助孕患者；② 患有精神疾患等禁忌證及女方縱隔子宮、雙子宮等子宮畸形、子宮肌瘤、子宮息肉、輸卵管積水、盆腔炎癥、內(nèi)膜異常等疾病；③ 解凍精子助孕的患者；④ 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)，既往有不良孕產(chǎn)史。本研究符合《赫爾辛基宣言》。

1.2 卵母細(xì)胞獲取

應(yīng)用常規(guī)長(zhǎng)方案促排卵，B超監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育，待1/3卵泡直徑≥18 mm時(shí)，當(dāng)晚肌肉注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG，珠海麗珠制藥)5 000～10 000 U，36.5 h左右行超聲引導(dǎo)下卵泡穿刺取卵術(shù)，卵丘卵母細(xì)胞取出后洗滌2～3遍立即放到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 精液獲取及受精

取卵當(dāng)日手淫取精獲取精液，詢問患者禁欲天數(shù)并記錄，所有精液經(jīng)密度梯度離心處理洗滌后留取高活率的精子沉淀物及其約0.3～0.5 mL的上清液，放置培養(yǎng)箱備用，精液處理前后觀察精液參數(shù)，精液量、精子密度、精子活率、前向運(yùn)動(dòng)精子百分比等，根據(jù)患者病情行常規(guī)IVF或ICSI方式授精。

1.4 胚胎培養(yǎng)

受精后17～20 h后倒置顯微鏡下觀察受精情況，并記錄原核(pronucleus,PN)數(shù)目：2PN為正常受精；受精后D2和D3評(píng)估卵裂期胚胎形態(tài)，記錄胚胎細(xì)胞數(shù)、碎片比例、細(xì)胞大小是否均勻，根據(jù)患者及胚胎情況于受精后第3 d、第4 d或第5 d選擇1～2枚質(zhì)量較好的胚胎移植，出現(xiàn)孕酮高、過度刺激、內(nèi)膜厚度異常及無可用胚胎的患者則取消移植，行胚胎冷凍。移植后2周測(cè)血hCG，移植后28 d B超監(jiān)測(cè)觀察妊娠情況，見孕囊確定臨床妊娠，記錄妊娠囊個(gè)數(shù)。

1.5 胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分

在受精后第2 d和第3 d，采用Gardner評(píng)分方法對(duì)胚胎進(jìn)行評(píng)分。

可用卵裂胚評(píng)分：細(xì)胞數(shù)≥6枚，胚胎級(jí)別為3級(jí)及以上，無多核證據(jù)。

第4 d可用胚胎評(píng)分：胚胎發(fā)育速度為部分融合及以上。

可用囊胚評(píng)分：囊胚至少發(fā)育到囊胚完全擴(kuò)張充滿整個(gè)胚胎。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)：形態(tài)規(guī)則，直徑在60 μm以上，細(xì)胞大小均勻。融合或形態(tài)不規(guī)則，直徑在60 μm以上，細(xì)胞大小不勻，有相當(dāng)一部分沒有融合。滋養(yǎng)細(xì)胞層：沿囊胚“赤道面”分布可看到少量或大量卵裂球，大小均勻或不均勻，囊胚底面的細(xì)胞形態(tài)清晰或難以辨認(rèn)，滋養(yǎng)細(xì)胞與透明帶之間有或無碎片殘留。

1.6 評(píng)價(jià)指標(biāo)

2 PN可用胚率=2 PN可用胚數(shù)/2 PN卵裂數(shù)；可用胚胎率=可用胚胎數(shù)/卵裂數(shù)；可用囊胚形成率=可用囊胚數(shù)/養(yǎng)囊胚數(shù)；妊娠率=妊娠患者數(shù)/移植患者數(shù)；種植率=種植胚胎數(shù)/移植胚胎數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組男方精液參數(shù)分析

男方精液參數(shù)分析包含IVF和ICSI的患者，禁欲4～7 d組男方精液量顯著高于禁欲1～3 d組(P<0.001)，兩組精液DFI無顯著差異，兩組偶見活動(dòng)精子及無法統(tǒng)計(jì)精液參數(shù)的患者占比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，排除這部分患者，對(duì)兩組剩余患者進(jìn)行精液參數(shù)對(duì)比分析。禁欲4～7 d組和禁欲1～3 d組精液處理前密度、活率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，禁欲1～3 d組處理前前向運(yùn)動(dòng)精子率顯著高于禁欲4～7 d組(P<0.05)，禁欲4～7 d組的前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)顯著高于禁欲1～3 d組(P<0.05)。精液處理后兩組密度、活率、前向運(yùn)動(dòng)精子率及前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。處理后精液活率及前向運(yùn)動(dòng)精子率等均遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于精液處理前，詳見表1。

2.2 體外受精和卵胞漿內(nèi)單精子注射兩亞組患者基本資料

IVF和ICSI兩個(gè)亞組患者的女方年齡、男方年齡、不孕年限、不孕類型、不孕因素占比、基礎(chǔ)激素值包括促卵泡生成素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)，黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、hCG日激素值包括LH，雌二醇(estrogen，E2)，孕酮(progesterone，P)、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)等比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，詳見表2、表3。

2.3 體外受精和卵胞漿內(nèi)單精子注射兩亞組患者的胚胎情況及妊娠結(jié)局比較

IVF和ICSI周期兩亞組的2 PN受精率、2 PN卵裂率、可用胚胎率、可用囊胚形成率、不同移植天數(shù)周期占比、移植胚胎數(shù)目及內(nèi)膜厚度等均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，A2組妊娠率及種植率均顯著高于A1組(P<0.05)，B1組和B2組的妊娠率及種植率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，B2組有高于B1組的趨勢(shì)，詳見表4、表5。

表1 兩組男方精液參數(shù)分析

表2 IVF兩亞組患者基本資料比較

表3 ICSI兩亞組患者基本資料比較

表4 IVF兩亞組患者胚胎情況及妊娠結(jié)局比較

表5 ICSI兩亞組患者胚胎情況及妊娠結(jié)局比較

3 討論

禁欲時(shí)間對(duì)精液質(zhì)量的影響國(guó)內(nèi)外研究較多，對(duì)于精液中精液參數(shù)，目前大部分研究者認(rèn)為隨著禁欲時(shí)間的延長(zhǎng)，精液量、精子密度和精子總數(shù)增加，但精子活率下降[4-5]。但最佳的禁欲時(shí)間尚沒有明確結(jié)論。賈紅軍等[1]研究表明禁欲時(shí)間2～≤7 d的精子濃度和活力比禁欲時(shí)間<2 d、>7 d顯著升高，禁欲時(shí)間4～<6 d時(shí)前向運(yùn)動(dòng)精子百分比最高，而在禁欲6～≤7 d時(shí)，前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)達(dá)到最高。劉彩霞等[6]根據(jù)禁欲天數(shù)將研究對(duì)象分為1、2、3、4、5、6、7 d七個(gè)組，比較各組精液參數(shù)及IUI妊娠率，結(jié)果是禁欲時(shí)間越長(zhǎng)，精子活動(dòng)率及前向運(yùn)動(dòng)精子越低，而精子量、精子密度及前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)等數(shù)值越高。本研究與此相似，禁欲天數(shù)1～3 d前向運(yùn)動(dòng)精子率顯著高于禁欲天數(shù)4～7 d，禁欲4～7 d組精液量及前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)均顯著高于禁欲天數(shù)1～3 d組，兩組精子密度及活率等均無顯著差異。精液經(jīng)過密度梯度離心+上游法洗精后，提高了精液密度、活率及前向運(yùn)動(dòng)精子等，兩組之間均無顯著差異，即兩組在受精前的精液參數(shù)是一致的，精液參數(shù)并不是影響妊娠結(jié)局的影響因素。

禁欲時(shí)間對(duì)精液參數(shù)的影響有了一定的共識(shí)，研究表明禁欲較長(zhǎng)時(shí)間(>7 d)的精子濃度和活力顯著降低[1]，原因可能是睪丸及附睪中的精子保存時(shí)間較長(zhǎng)后會(huì)對(duì)精子質(zhì)量產(chǎn)生影響，精子形態(tài)異常、精子功能受損等，進(jìn)而影響胚胎發(fā)育甚至不能成功妊娠。禁欲時(shí)間較長(zhǎng)的附睪中的部分精子已經(jīng)失去受精能力，后來睪丸形成而補(bǔ)給的是有受精能力的，這可能是隨著禁欲時(shí)間的延長(zhǎng)，精液量、精子密度和精子總數(shù)增加，但精子活率下降的原因。因此不建議行IVF-ET胚胎移植的男方患者禁欲天數(shù)超過7 d，第五版《WHO人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》[7]推薦精液常規(guī)檢查的禁欲天數(shù)為2～7 d，本研究患者禁欲天數(shù)均<8 d，有部分患者忘記了醫(yī)囑而在助孕前1 d同房。

精液參數(shù)會(huì)隨著禁欲天數(shù)改變而有所改變，精子質(zhì)量會(huì)隨著禁欲天數(shù)改變有怎樣的改變以及是否會(huì)對(duì)輔助生殖技術(shù)妊娠結(jié)局有一定的影響，是輔助生殖臨床專家應(yīng)該重視的問題。目前7 d內(nèi)禁欲天數(shù)對(duì)IUI及IVF妊娠結(jié)局影響的相關(guān)研究并不多，有報(bào)道禁欲時(shí)間越長(zhǎng)，精子DNA碎片指數(shù)越高[8-10]，但目前禁欲時(shí)間對(duì)DNA碎片的影響尚無定論，有研究表明禁欲天數(shù)1 d和2 d的精子DNA碎片最低，與對(duì)照組有顯著差異[11]，可能是因?yàn)榫娱L(zhǎng)時(shí)間暴露于精漿氧化應(yīng)激微環(huán)境中，損傷了精子DNA。但并沒有直接證據(jù)證明DNA碎片率與妊娠結(jié)局及活產(chǎn)率有關(guān)，體外受精過程中無論IVF或ICSI，均對(duì)精子有選擇的過程，可能會(huì)弱化DNA碎片對(duì)妊娠結(jié)局的影響。梁曉東等[12]研究表明在排除女方基礎(chǔ)條件影響的前提下，精液DNA完整性對(duì)第1個(gè)完整周期的妊娠率及活產(chǎn)率無明顯影響，其累積活產(chǎn)率也比較相近，可能與DNA完整性來源于未經(jīng)處理的精液以及移植前胚胎經(jīng)過挑選有關(guān)。本研究?jī)山M精液DNA碎片無顯著差異，禁欲天數(shù)對(duì)本研究人群精液DNA碎片無影響，因此兩組妊娠結(jié)局的比較不受DNA碎片的影響。輔助生殖專家研究禁欲天數(shù)對(duì)于妊娠結(jié)局的影響結(jié)果不一，Borges E等[13]研究了818例IVF周期，發(fā)現(xiàn)與射精禁欲>4 d組比較，射精禁欲≤4 d組不會(huì)降低精子DNA碎裂指數(shù)，能夠提高受精率，第3 d可用胚胎率、囊胚形成率、種植率和妊娠率。與禁欲時(shí)間2～4 d相比，禁欲1 d的種植率顯著增高，妊娠率有增高的趨勢(shì)。何連利等[14]的研究中，IVF受精患者禁欲天數(shù)4～7 d組妊娠率(47.5%)與禁欲天數(shù)2～3 d組(37.5%)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但從數(shù)據(jù)來說禁欲天數(shù)4～7 d組有增高的趨勢(shì)。本研究與其研究結(jié)果相似，禁欲天數(shù)1～3 d與禁欲天數(shù)4～7 d比較，受精率、卵裂率、可用胚胎率及囊胚形成率等均無顯著差異，IVF周期禁欲天數(shù)4～7 d妊娠率和種植率顯著高于禁欲天數(shù)1～3 d，ICSI周期兩組之間無顯著差異，但禁欲天數(shù)4～7 d妊娠率與種植率有增高的趨勢(shì)。ICSI周期無差異的原因可能與ICSI受精繞過了自然選擇的過程，減弱了禁欲天數(shù)對(duì)妊娠結(jié)局的影響。本研究中兩亞組精液參數(shù)及DNA碎片均無顯著性差異，表明妊娠結(jié)局的比較不受精液參數(shù)和DNA碎片的影響。劉睿智等[15]研究表明禁欲天數(shù)1～5 d時(shí)，頂體酶活性是穩(wěn)定的，而禁欲10 d時(shí)頂體酶活性明顯下降，與禁欲1 d時(shí)頂體酶活性比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此本研究?jī)山M頂體酶活性是無差異的。禁欲天數(shù)4～7 d妊娠結(jié)局較好的原因可能與精子核蛋白轉(zhuǎn)型有關(guān)，核蛋白轉(zhuǎn)型障礙可影響精子核染色質(zhì)的正常凝聚和穩(wěn)定性，核染色質(zhì)易受損傷影響妊娠結(jié)局。在核蛋白組型轉(zhuǎn)換半定量值正?；颊咧?，禁欲時(shí)間<3 d對(duì)精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換半定量值有影響[16]，會(huì)影響患者后期妊娠結(jié)局，因此建議輔助生殖技術(shù)禁欲天數(shù)選擇>3～7 d。但本研究中禁欲天數(shù)4～7 d妊娠結(jié)局較好的確切機(jī)理尚不明確。

綜上所述，在IVF-ET胚胎移植技術(shù)中，男方禁欲天數(shù)在4～7 d能夠顯著提高IVF妊娠率及種植率，ICSI有增高的趨勢(shì)，但本研究樣本量較少，且導(dǎo)致該原因的內(nèi)在機(jī)理尚不明確，仍需要大樣本量隨機(jī)對(duì)照及分子機(jī)理研究進(jìn)行深入分析，本文旨在提醒臨床專家禁欲天數(shù)對(duì)妊娠結(jié)局是有一定影響的，各中心可根據(jù)本身的數(shù)據(jù)結(jié)合理論選擇合適的禁欲天數(shù)，以期改善妊娠結(jié)局。