張美玲，王 新，李 波，王志杰，郭曉玲，王鳳艷，修玉才*，王天儀,3*

（1. 承德醫(yī)學院研究生院，河北承德 067000； 2. 中國人民解放軍聯勤保障部隊第九八一醫(yī)院脊柱外科；3. 河北省神經損傷與修復重點實驗室； 4. 中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院骨科； 5. 承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院兒內科；6. 中國人民解放軍聯勤保障部隊第九八一醫(yī)院神經內科）

脊髓損傷（spinal cord injury, SCI）是一種嚴重的致殘性疾病[1]，直接損害脊髓組織[2]，導致運動、感覺和自主神經功能障礙[3]。SCI后的感覺障礙往往表現出感覺遲鈍、錯亂、消失和慢性神經痛等癥狀，嚴重影響患者的生存質量。后索由初級感覺神經元軸突組成，是脊髓感覺傳導通路主要成分之一，負責本體感覺與精細觸覺傳導[4]。目前臨床尚無有效的治療方法改善SCI后的感覺異常[5]。

骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell, BMSC）可以調節(jié)脊髓損傷后的微環(huán)境，可在一定程度上修復受損的神經[6]，但是BMSC存在致瘤性、免疫原性、低存活率等缺陷[7]，使BMSC的應用受到了限制[8]。BMSC的修復能力在很大程度上由其分泌的外泌體（BMSCEXO）介導[6]。本團隊前期進行體外實驗證實了BMSCEXO可調控STAT3/GAP43通路，促進初級感覺神經元軸突生長[9]。本研究在此基礎上進行體內研究，探索BMSCEXO對脊髓后索損傷大鼠感覺功能恢復的調控作用，為治療SCI后感覺功能障礙提供新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 分組

從中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所動物中心購入實驗所需的42只健康成年雌性Wistar大鼠（250±10g），并將其飼養(yǎng)于光照明暗交替（12/12 h）的動物房內。室溫23～25℃，濕度適宜。大鼠可自由獲取食物與水。動物飼養(yǎng)及相關實驗流程符合ARRIVE準則和美國國立衛(wèi)生研究院實驗動物的護理和使用指南。6只用于BMSC和BMSC-EXO的提取、培養(yǎng)及鑒定。剩余36只用于體內實驗，隨機分為假手術（Sham）組、PBS對照組及BMSC-EXO組（每組12只）。其中假手術組僅進行T10椎板切除術，PBS對照組及BMSC-EXO組在后索損傷造模的基礎上分別通過尾靜脈注射PBS和BMSC-EXO。

1.2 BMSC培養(yǎng)及鑒定

大鼠脫頸處死后置于75%乙醇中浸泡消毒10min，取出脛骨和股骨，無菌生理鹽水沖洗并剪掉干骺端，充分暴露骨髓腔，然后使用DMEM培養(yǎng)基多次沖洗骨髓腔，用膠頭吸管輕輕吹打沖洗下來的骨髓組織。收集細胞置于離心管中（1000r/min，5min），離心后去上清。新配制的DMEM（含10%FBS，美國Gibco公司）培養(yǎng)基用來重懸細胞。細胞于T75培養(yǎng)瓶中（1×109/瓶）適宜條件下（恒濕、37℃、5% CO2）進行培養(yǎng)。每24h觀察細胞的狀態(tài)，必要時更換培養(yǎng)基并傳代。

BMSC鑒定：待培養(yǎng)的BMSC約70%～80%匯合時，進行免疫熒光染色鑒定其表面抗原CD29、CD90的表達情況。去除培養(yǎng)基，PBS清洗，用4%多聚甲醛固定，4℃過夜。PBS清洗3次，分別加入適量熒光標記的CD29、CD90抗體孵育90min，PBS洗3次，BMSC細胞核使用DAPI（美國Abcam公司）染色，室溫放置5min后清洗，用50%甘油緩沖液封片，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.3 BMSC-EXO的提取及鑒定

收集BMSC培養(yǎng)液，4℃條件下300g離心10min，取上清。4℃條件下10000g離心30min，并通過0.22μm過濾膜去除細胞碎片，取上清。4℃條件下100000g離心70min，棄上清，沉淀即為BMSC-EXO。將收集到的外泌體重懸于200μl無菌PBS中，-80℃冰箱保存。

外泌體的鑒定：用透射電鏡對所得外泌體進行形態(tài)鑒定。Western Blot法用來檢測BMSC-EXO特征性標志物HSP70與Alix蛋白的表達情況，內參蛋白為β-actin（美國Abcam公司）。

1.4 后索損傷造模及尾靜脈注射

10%水合氯醛腹腔內注射麻醉大鼠，以T10棘突為中心，沿大鼠背部切開3cm切口并分離皮下組織及肌肉。微型咬骨鉗去除T10棘突及雙側椎板，微型剪小心剪開硬脊膜。以T10節(jié)段兩側脊神經后根入脊髓處為左右邊界，微型鑷刺入脊髓后索組織2mm并夾閉10s。逐層縫合，腹腔注射頭孢哌酮0.3ml預防感染。造模后30min，BMSC-EXO組尾靜脈注射200μl外泌體（200μl/min），PBS對照組尾靜脈注射等量PBS。造模后每3d重復一次尾靜脈注射，共注射5次。

1.5 膠帶移除實驗（tape removal test，TRT）

將膠帶粘附至大鼠后爪，不接觸毛發(fā)。記錄大鼠感應到膠帶及去除膠帶的時間。TRT在造模的-1 w，-1 d，1 w，2 w，3 w，4 w，5 w，6 w，7 w和8 w幾個時間點進行。若記錄時間超過120s，則將120s記錄為延遲時間，不再記錄更長時間。

1.6 體感誘發(fā)電位（somatosensory evoked potential，SSEP）

將刺激電極針插入距梨狀孔0.5cm處的肌肉中。將記錄電級插入大鼠頭部皮下，參考電極放在鼻根，背部插入接地電極。刺激強度設置為2.5 mA，4.1 Hz，記錄SSEP波形并從200次刺激中取平均值。記錄并分析N1峰潛伏期和N1-P1峰電位差，以反映脊髓的感覺傳導功能。

1.7 取材及組織免疫熒光

各組大鼠在造模8周后取材，10%水合氯醛對大鼠進行麻醉，4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液灌注。原切口顯露T10節(jié)段脊髓，并取出以損傷部位為中心長度為1.5cm的脊髓標本及L4～6背根神經節(jié)。10%多聚甲醛固定脊髓樣本，然后進行冰凍切片（16μm），10%兔血清封閉切片后，使用NF-200抗體孵育。隨后使用cy3標記的熒光二抗孵育切片（美國Abcam公司）。后在熒光顯微鏡下拍照觀察。

1.8 Western Blot

RIPA裂解液裂解背根神經節(jié)組織后，提取總蛋白進行定量。蛋白上樣之后進行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉移到PVDF膜上，封閉后進行一抗孵育（STAT3，GAP43，GAPDH，美國Abcam公司），隨后使用辣根過氧化物酶偶聯的二抗孵育，最后進行曝光并拍照。

1.9 統(tǒng)計分析

應用Graphpad Prism 6.0對所得數據進行統(tǒng)計分析，所有數據記錄并計算平均值±標準誤（SEM）。實驗分組均為完全隨機化分組，數據資料分布特征符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析（ANOVA）和 Tukey 多重比較檢驗進行差異分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 BMSC鑒定

在光鏡下觀察所提取的BMSC呈多角形和長梭形。所培養(yǎng)的細胞經免疫熒光染色顯示CD29與CD90雙陽性，證實所提取的細胞為BMSC，如圖1：

圖1 BMSC免疫熒光染色鑒定（×200）

2.2 外泌體鑒定

BMSC-EXO組HSP70和Alix表達顯著高于Control組（P＜0.05），證明所提取的沉淀為BMSC-EXO，如圖2：

圖2 外泌體鑒定

2.3 BMSC-EXO促進后索損傷大鼠感覺功能恢復

免疫熒光染色顯示，BMSC-EXO組NF-200陽性神經元累積光密度較PBS對照組大，但仍小于假手術組（圖3A）。體感誘發(fā)電位的結果顯示，假手術組波形正常，而PBS對照組中沒有可識別的波形。盡管與假手術組相比，N1峰潛伏期被延遲，且N1-P1電位差較小，但BMSC-EXO組存在可檢測到的波形（圖3B～D）。膠帶移除實驗顯示假手術組大鼠感知和移除膠帶的潛伏期都很短。與假手術組相比，PBS對照組及BMSC-EXO組的等待時間均延遲（P＜0.05）。與PBS對照組相比，BMSC-EXO組的感知、移除潛伏期均有明顯改善（P＜0.05）（圖3E，F）。以上結果表明，BMSC-EXO可以促進后索損傷大鼠脊髓感覺傳導功能的恢復。

圖3 BMSC-EXO促進SDCL后感覺傳導功能的恢復

2.4 BMSC-EXO通過STAT3/GAP43通路發(fā)揮作用

相比于PBS對照組，BMSC-EXO組STAT3和GAP43蛋白的表達明顯升高。見圖4：

圖4 Western Blot檢測背根神經節(jié)中STAT3與GAP43蛋白表達

3 討論

脊髓損傷作為一種嚴重的中樞神經系統(tǒng)疾病，具有高發(fā)病率、高致殘率以及高花費的流行病學特點[10]，對患者健康、生活質量和預期壽命有顯著影響[11]。SCI的病理生理機制十分復雜，盡管許多治療策略都試圖緩解SCI，但目前臨床上的治療仍局限于支持性措施[12]。研發(fā)新的治療手段具有十分重要的意義。

骨髓間充質干細胞已被認為是治療中樞神經系統(tǒng)損傷的種子細胞[13]。有證據表明，BMSC可在一定程度上促進神經元軸突再生[6]。但BMSC移植治療方法具有致瘤性、免疫原性和低存活率等弊端[7]。最新觀點認為，BMSC治療SCI的作用歸功于其旁分泌的外泌體等多種生物活性成分[6]。與移植骨髓間充質干細胞相比，外泌體不具有細胞毒性，且含有多種生長因子[14]、抗炎因子[15]，更易儲存及移植（存儲于-80℃的外泌體超過兩年都不會失去生物活性）[16]，體積小不易堵塞微血管，且具有先天穩(wěn)定性、靶向特異性、較長半衰期[17]、低致癌性、低免疫性、高載藥量、高傳遞效率的優(yōu)勢。外泌體可經藥物途徑（靜脈注射等）自由通過血腦屏障[18]、血脊髓屏障進入中樞神經系統(tǒng)，進行長時間、遠距離的運輸，達到治療效果[19,20]。外泌體治療避免了BMSC移植弊端，同時具有傳遞BMSC有效成分的功能，是一種具有很大應用前景的治療方式。

本團隊前期已使用提取的BMSC-EXO與初級感覺神經元共培養(yǎng)，發(fā)現BMSC-EXO可以通過激活STAT3/GAP43通路顯著促進神經元軸突生長[9]。而本研究所提取培養(yǎng)的BMSC經鑒定證實其狀態(tài)好且純度高，收集的BMSC-EXO含有外泌體特異性標志物HSP70與Alix。BMSC-EXO組大鼠STAT3與GAP43蛋白的表達明顯升高。免疫熒光證實BMSC-EXO組NF-200染色陽性神經元累積光密度更大。體感誘發(fā)電位的結果顯示BMSC-EXO組存在可檢測到的波形，膠帶移除實驗顯示BMSC-EXO組的感知、移除潛伏期均有明顯改善，表明BMSC-EXO在一定程度上可通過調控STAT3/GAP43通路促進后索損傷大鼠的感覺功能恢復。

綜上所述，本研究證實BMSC-EXO可通過調控STAT3/GAP43通路促進脊髓后索損傷大鼠的感覺傳導功能恢復，提示BMSC-EXO作為新的治療方法，在用于恢復脊髓損傷后感覺傳導功能方面具有廣闊的應用前景。