韓蕾蕾，王紅霞，李陽(yáng)，張樂(lè)樂(lè)，袁祖麗

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

植物體自身具有響應(yīng)Cd脅迫的機(jī)制，可通過(guò)信號(hào)調(diào)控、酶促和非酶促反應(yīng)等清除過(guò)量ROS，在一定程度上緩解Cd脅迫產(chǎn)生的過(guò)量ROS造成的氧化傷害[14]。類(lèi)黃酮、NO、H2O2既屬于植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的信號(hào)物質(zhì)，也參與植物逆境生理過(guò)程。類(lèi)黃酮(Flavonoid)是一類(lèi)廣泛存在于植物中的多酚類(lèi)次生代謝產(chǎn)物，是活性氧自由基的清除劑，可以直接清除H2O2,·OH,1O2等活性氧分子[15-17]。王宇濤等[18]研究表明，Cd脅迫下擬南芥植株類(lèi)黃酮含量增加，通過(guò)積累的類(lèi)黃酮發(fā)揮其抗氧化作用而提高其對(duì)Cd的耐受性。岳凱等[19]研究表明,在干旱脅迫下藜麥葉片類(lèi)黃酮含量升高，不同程度干旱脅迫下的類(lèi)黃酮對(duì)自由基的清除能力不同，在5%的聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)干旱處理下表現(xiàn)出最強(qiáng)的自由基清除力。

NO是一種可擴(kuò)散的氣態(tài)信號(hào)分子，在植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和抗逆脅迫中起著至關(guān)重要的作用[20]。NR被公認(rèn)為內(nèi)源性NO生物合成的重要酶源，催化亞硝酸鹽還原生成NO；脅迫下，植物光合作用被破壞，電子傳遞受阻，碳代謝與氮代謝的失衡，NR會(huì)利用胞漿中累積的亞硝酸鹽大量合成NO[21]。NO具有清除Cd脅迫產(chǎn)生的過(guò)量H2O2能力[8]。CKAYA等[22]研究顯示，NO通過(guò)加速抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)(ASA-GSH)增強(qiáng)辣椒對(duì)Cd的耐受性。

叢枝真菌是生態(tài)系統(tǒng)中一類(lèi)分布廣泛的內(nèi)生菌根菌，可與大多數(shù)高等植物根系共生，產(chǎn)生叢枝菌根，直接或間接地參與緩解Cd污染對(duì)植物造成的氧化損傷[23]。研究表明，接種叢枝真菌可以提高共生植物的抗氧化酶活性，清除過(guò)積累的ROS；可以提高葉綠素含量，增強(qiáng)葉片光合作用，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)與發(fā)育[24-25]。叢枝真菌在形成菌根共生體的過(guò)程中可以影響植物多種信號(hào)物質(zhì)的合成，如類(lèi)黃酮、NO、H2O2等，通過(guò)類(lèi)黃酮、NO、H2O2的作用緩解逆境傷害[26]。因此，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)Cd污染土壤小麥接種叢枝真菌后類(lèi)黃酮含量、NO含量、NR活性和H2O2含量的研究，探討叢枝真菌對(duì)Cd脅迫小麥幼苗的修復(fù)機(jī)制，為Cd污染土壤小麥栽培的原位修復(fù)技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

小麥(TriticumaestivumL.)品種為百農(nóng)207。叢枝真菌(Arbuscularmycorrhizalfungi,AMF)為摩西球囊霉菌(Glomusmosseae,Gm)。

采用土培的試驗(yàn)方法，營(yíng)養(yǎng)土滅菌后晾干備用。塑料杯消毒，未接種叢枝真菌的杯子裝入120 g已滅菌營(yíng)養(yǎng)土，接種叢枝真菌的杯子裝入115 g營(yíng)養(yǎng)土和5 g菌種。小麥種子用3%的H2O2浸泡消毒20 min，再用蒸餾水沖洗數(shù)次，浸泡30 min。每杯播種36粒種子，將杯子放置光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件設(shè)置為14 h光照/10 h黑暗，溫度為16～25 ℃，相對(duì)濕度為80%，光照度為0～100 μmol·m2·s-1。

種子播種3 d后，對(duì)小麥幼苗進(jìn)行Cd脅迫處理。此后幼苗每2 d澆灌Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液50 mL。每個(gè)處理重復(fù)5次。幼苗生長(zhǎng)至兩葉一心后，將葉片用錫箔紙包裹迅速放液氮冷凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

試驗(yàn)設(shè)計(jì)為6個(gè)處理，分別為：對(duì)照(CK)；對(duì)照接種叢枝真菌(CK+AMF)；5 mg·kg-1Cd脅迫(Cd5)；5 mg·kg-1Cd脅迫接種叢枝真菌(Cd5+AMF)；10 mg·kg-1Cd脅迫(Cd10)；10 mg·kg-1Cd脅迫接種叢枝真菌(Cd10+AMF)。

1.2 研究?jī)?nèi)容與方法

研究檢測(cè)了小麥幼苗葉片類(lèi)黃酮含量、NR活性、NO含量、H2O2含量，分別進(jìn)行3個(gè)重復(fù)。

1.2.1 類(lèi)黃酮含量 小麥幼苗葉片類(lèi)黃酮含量測(cè)定參考董李平等[27]的方法，對(duì)小麥幼苗葉片類(lèi)黃酮含量進(jìn)行檢測(cè)。準(zhǔn)確稱(chēng)取小麥幼苗葉片干粉0.2 g，40%乙醇(pH值為3)室溫提取24 h，用提取溶劑定容至50 mL。取提取液0.5 mL于試管中，依次加入2 mL雙蒸水和5%亞硝酸鈉0.15 mL，靜置5 min；加10%六水氯化鋁0.15 mL，混勻靜置5 min；再加入3 mol·L-1的氫氧化鈉溶液1 mL，靜置15 min，使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)415 nm處檢測(cè)吸光值。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.2 NR活性 NR活性檢測(cè)采用索萊寶公司的硝酸還原酶酶活性檢測(cè)試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書(shū)操作。將新鮮小麥幼苗葉片洗凈，放入誘導(dǎo)劑應(yīng)用液中避光浸泡，2 h后取出，濾紙吸干，-20 ℃冷凍30 min。稱(chēng)取約0.1 g樣本，加入1 mL提取液，冰浴下研磨，在4 ℃下以4 000×g離心10 min，收集上清液待用。按照說(shuō)明書(shū)設(shè)定測(cè)定管和空白管，分別依次加入試劑，使用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)340 nm下的初始吸光值A(chǔ)1，25 ℃反應(yīng)30 min后再次測(cè)定吸光值A(chǔ)2，進(jìn)而計(jì)算酶活性。

1.2.3 NO含量 NO含量測(cè)定參考OKANT等[28]的方法。稱(chēng)取0.5 g試驗(yàn)小麥幼苗葉片，加液氮研磨，然后加入3 mL濃度為50 mol·L-1的冷乙酸緩沖液(pH值為3.6，含有4%二乙酸鋅)，在4 ℃下以10 000×g離心15 min，取上清液。在剩余沉淀中加入1 mL緩沖液，在4 ℃下以10 000×g離心15 min，取其上清液。將2次所取上清液混合，加入0.1 g木炭，渦旋混勻后，在4 ℃下以12 000×g離心10 min，收取最終上清液，待用。取最終上清液1 mL，和1 mL Gress試劑充分混勻，室溫30 min后，使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)540 nm處檢測(cè)樣本的吸光值。通過(guò)與NaNO2的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較計(jì)算NO的含量。

1.2.4 H2O2濃度 H2O2含量測(cè)定參考王浩[29]的方法。取新鮮小麥幼苗葉片0.2 g，加液氮研磨，然后加入4 mL 0.1%的三氯乙酸，研磨成勻漿。在4 ℃下以12 000×g離心10 min，收集上清液。準(zhǔn)備新的離心管，依次向管中加入1 mL上清液，0.5 mL 10 mol·L-1磷酸緩沖液(pH 7)，1 mol·L-1的KI溶液1 mL。混勻后，使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)390 nm處檢測(cè)吸光值。通過(guò)與H2O2標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較計(jì)算H2O2的濃度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2013進(jìn)行基本的數(shù)據(jù)處理，用DPS v 14.10對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行LSD-二因素有重復(fù)試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 叢枝真菌對(duì)Cd脅迫小麥幼苗葉片類(lèi)黃酮含量的影響

如圖1所示，對(duì)照接種叢枝真菌小麥幼苗葉片類(lèi)黃酮含量比對(duì)照小麥幼苗顯著上升12.53%；5和10 mg·kg-1Cd脅迫小麥幼苗與對(duì)照小麥幼苗比較，5和10 mg·kg-1Cd脅迫小麥幼苗葉片類(lèi)黃酮含量有所提高；分別對(duì)5和10 mg·kg-1Cd脅迫小麥接種叢枝真菌，Cd脅迫接種叢枝真菌小麥幼苗葉片類(lèi)黃酮含量與同質(zhì)量濃度Cd脅迫小麥幼苗相比，類(lèi)黃酮含量變化不顯著。結(jié)果表明，接種叢枝真菌可以提高Cd脅迫小麥幼苗葉片類(lèi)黃酮含量。

CK：對(duì)照；CK+AMF：對(duì)照接種叢枝真菌；Cd5：5 mg·kg-1 Cd脅迫；Cd5+AMF：5 mg·kg-1 Cd脅迫接種叢枝真菌；Cd10：10 mg·kg-1 Cd脅迫；Cd10+AMF：10 mg·kg-1 Cd脅迫接種叢枝真菌。不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。CK:Control;CK+AMF:Control inoculation;Cd5:5 mg·kg-1 Cd stress;Cd5+AMF:5 mg·kg-1 Cd stress inoculation;Cd10:10 mg·kg-1 Cd stress;Cd10+AMF:10 mg·kg-1 Cd stress inoculation.The different lowercase letters show the significant differences(P<0.05).The same as below.圖1 叢枝真菌對(duì)Cd脅迫小麥幼苗葉片類(lèi)黃酮含量的影響Fig.1 Effects of arbuscular mycorrhizal fungi on flavonoid content of wheat seedling leaves under Cd stress

2.2 叢枝真菌對(duì)Cd脅迫小麥幼苗葉片NR活性的影響

如圖2所示，對(duì)照接種叢枝真菌小麥幼苗葉片NR活性是對(duì)照小麥幼苗葉片的2.14倍，差異顯著；5和10 mg·kg-1Cd脅迫小麥幼苗葉片的NR活性與對(duì)照小麥幼苗相比，均有所提高，其中10 mg·kg-1Cd脅迫小麥幼苗葉片的NR活性呈5%顯著水平，提高了68.50%；5和10 mg·kg-1Cd脅迫接種叢枝真菌小麥幼苗葉片NR活性分別是同質(zhì)量濃度Cd脅迫小麥幼苗的1.94,2.03倍，差異顯著。結(jié)果表明，接種叢枝真菌可以提高Cd脅迫小麥幼苗葉片NR活性。

圖2 叢枝真菌對(duì)Cd脅迫小麥幼苗葉片NR活性的影響Fig.2 Effects of arbuscular mycorrhizal fungi on nitrate reductase activity in wheat seedling leaves under Cd stress

2.3 叢枝真菌對(duì)Cd脅迫小麥幼苗葉片NO含量的影響

如圖3所示，對(duì)照接種叢枝真菌小麥幼苗NO含量與對(duì)照小麥幼苗相比有所提高，差異不顯著；5和10 mg·kg-1Cd脅迫小麥幼苗與對(duì)照小麥幼苗比較，葉片NO含量均有所提高；而5和10 mg·kg-1Cd脅迫接種叢枝真菌小麥幼苗NO含量分別比同質(zhì)量濃度Cd脅迫小麥幼苗上升50.70%,35.96%，差異顯著。結(jié)果表明，接種叢枝真菌可以提高Cd脅迫小麥幼苗葉片NO含量。

圖3 叢枝真菌對(duì)Cd脅迫小麥幼苗葉片NO含量的影響Fig.3 Effects of arbuscular mycorrhizal fungi on nitric oxide content in wheat seedling leaves under Cd stress

2.4 叢枝真菌對(duì)Cd脅迫小麥幼苗葉片H2O2濃度的影響

如圖4所示，對(duì)照接種叢枝真菌小麥幼苗H2O2濃度比對(duì)照小麥幼苗顯著下降31.57%；5和10 mg·kg-1Cd脅迫小麥幼苗H2O2濃度比對(duì)照小麥幼苗分別顯著上升9.34%，14.19%；5和10 mg·kg-1Cd脅迫接種叢枝真菌小麥幼苗H2O2濃度顯著比同質(zhì)量濃度Cd脅迫小麥幼苗分別下降34.77%,36.07%。結(jié)果表明，接種叢枝真菌會(huì)降低Cd脅迫小麥幼苗葉片H2O2濃度，緩解Cd脅迫對(duì)小麥幼苗造成的氧化傷害。

圖4 叢枝真菌對(duì)Cd脅迫小麥幼苗葉片H2O2濃度的影響Fig.4 Effects of arbuscular mycorrhizal fungi on hydrogen peroxide content in wheat seedling leaves under Cd stress

3 結(jié)論與討論

逆境脅迫下，植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量活性氧自由基，ROS是否會(huì)起到破壞性或信號(hào)分子的作用,取決于ROS產(chǎn)生和清除之間的微妙平衡。植物已經(jīng)進(jìn)化出一個(gè)復(fù)雜的基于ROS合成、清除和信號(hào)物質(zhì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，來(lái)介導(dǎo)生物和非生物脅迫反應(yīng)。類(lèi)黃酮在保護(hù)植物非生物和生物脅迫因素的負(fù)面影響方面發(fā)揮著主要作用[30]。作為抗氧化物質(zhì)的類(lèi)黃酮可直接消除活性氧而保護(hù)細(xì)胞免受氧化傷害[31]。研究顯示，接種叢枝真菌可以提高植物果實(shí)中類(lèi)黃酮(如花青素)水平[32]。本研究結(jié)果表明，5和10 mg·kg-1Cd脅迫對(duì)小麥幼苗葉片類(lèi)黃酮的作用不顯著；Cd脅迫小麥幼苗接種叢枝真菌較同質(zhì)量濃度Cd脅迫小麥幼苗，其類(lèi)黃酮含量有所提高。這與TORRES等[32]研究結(jié)果一致。在5和10 mg·kg-1Cd脅迫下，Cd脅迫小麥幼苗和同質(zhì)量濃度Cd脅迫接種叢枝真菌小麥幼苗葉片相比，10 mg·kg-1Cd脅迫導(dǎo)致小麥幼苗類(lèi)黃酮含量上升趨勢(shì)較5 mg·kg-1Cd脅迫小麥幼苗低，可能因?yàn)?0 mg·kg-1Cd脅迫對(duì)植物的傷害增大，接種叢枝真菌雖能提高植株類(lèi)黃酮含量，但用于清除活性氧的類(lèi)黃酮消耗增大，所以隨著Cd脅迫質(zhì)量濃度的增加，類(lèi)黃酮含量上升趨勢(shì)下降。

本研究結(jié)果表明，5和10 mg·kg-1Cd脅迫均顯著增加小麥幼苗葉片NR活性，且10 mg·kg-1Cd處理高于5 mg·kg-1Cd處理的NR活性；不同質(zhì)量濃度Cd脅迫接種叢枝真菌均可以顯著提高小麥幼苗葉片NR活性。這與CARAVACA等[33]研究結(jié)果一致。由于NR是NO合成的重要酶，其活性提高有助于提高NO含量，后者具有抗氧化功能，可緩解植物的氧化傷害[34]。研究表明，外源NO可降低草莓的MDA(Malondialdehyde)含量和H2O2含量，緩解脅迫造成的氧化傷害[35]，而Cd脅迫使植物內(nèi)源NO含量上升[33]。Cu脅迫也可促進(jìn)大麥幼苗NO的釋放，且NO釋放量最高時(shí)NR活性最高[36]。本研究結(jié)果表明，5和10 mg·kg-1Cd脅迫下，小麥幼苗葉片NR活性和NO含量均有所提高，不同質(zhì)量濃度Cd脅迫接種叢枝真菌小麥幼苗葉片NR活性和NO含量顯著高于同質(zhì)量濃度Cd脅迫未接種處理。說(shuō)明接種叢枝真菌可以提高Cd脅迫小麥幼苗的NO濃度，并且通過(guò)與H2O2發(fā)生反應(yīng)降低H2O2濃度，從而發(fā)揮抗氧化功能，緩解Cd脅迫對(duì)小麥幼苗的氧化傷害[37-38]。

Cd脅迫造成小麥幼苗葉片H2O2濃度顯著升高，且10 mg·kg-1Cd脅迫H2O2濃度高于5 mg·kg-1Cd脅迫，而2種質(zhì)量濃度Cd脅迫小麥幼苗分別接種叢枝真菌后H2O2濃度均顯著下降。說(shuō)明接種叢枝真菌可以降低Cd脅迫造成的氧化傷害。本研究表明，叢枝真菌可以通過(guò)提高類(lèi)黃酮和NO含量，降低Cd脅迫產(chǎn)生的過(guò)量ROS，緩解Cd脅迫造成的氧化傷害。