朱星卓 趙董步甲 鄭懿烜 寧 炫 苑 昊 吳春生

(西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物物理學(xué)系醫(yī)學(xué)工程研究所，西安 710061)

引言

呼氣分析技術(shù)是一種無(wú)創(chuàng)診斷技術(shù)，具有快速、易于被患者接受等優(yōu)勢(shì)，有著廣闊的應(yīng)用前景和商業(yè)化價(jià)值，已經(jīng)成為一個(gè)熱點(diǎn)研究領(lǐng)域，在世界各國(guó)正越來(lái)越被重視。呼氣分析技術(shù)通過(guò)檢測(cè)人體呼吸氣體中的揮發(fā)性有機(jī)氣體成分來(lái)進(jìn)行分析和篩選。古時(shí)中醫(yī)就有通過(guò)患者口腔、分泌物、痰液等散發(fā)的氣味來(lái)辨別虛實(shí)寒熱的方法，但大都依賴醫(yī)生的主觀判斷，缺乏客觀指標(biāo)[1]。1971年，Pauling等[2]通過(guò)氣相色譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)人呼出氣體中包含有上百種痕量揮發(fā)性有機(jī)物(volatile organic compounds, VOCs)。20世紀(jì)90年代，Phillips等[3]采用類似方法確定了肺癌患者呼出氣體中有22種VOCs(均為烷烴類和苯的衍生物)，作為判別肺癌的標(biāo)志性氣體成分。此后，相關(guān)學(xué)者對(duì)健康人和患者的呼出氣體樣本進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)通過(guò)分析呼出氣體中成分的特征性變化能夠?qū)Ψ伟⑷橄侔┑榷喾N疾病進(jìn)行診斷鑒別[4]。20世紀(jì)末，電子鼻技術(shù)得到飛速發(fā)展，能夠做到對(duì)特定氣味信號(hào)的定性和定量識(shí)別，進(jìn)一步促進(jìn)了呼氣分析技術(shù)的發(fā)展[5]。

相較于傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室檢查或病理組織切片，呼氣分析具有無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)捷、易實(shí)現(xiàn)等優(yōu)點(diǎn)，有很大潛力應(yīng)用于相關(guān)疾病的大規(guī)模篩查和早期檢測(cè)[4]。呼氣分析作為一種極具發(fā)展前景的技術(shù)手段，受到了國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多的重視，但仍存在缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)、樣本量過(guò)小等難題，限制了其在臨床診斷中的應(yīng)用。

下面通過(guò)總結(jié)呼氣分析技術(shù)的多種檢測(cè)方法，重點(diǎn)圍繞其在疾病診斷中的應(yīng)用，就該方法當(dāng)前的局限性和應(yīng)用前景進(jìn)行綜合分析和討論。

1 呼出氣體的采集

人體的呼出氣體一部分是內(nèi)源性氣體，經(jīng)過(guò)肺泡-血液交換作用而產(chǎn)生，其中包括反映機(jī)體代謝狀態(tài)的揮發(fā)性有機(jī)物。VOCs指在常溫下以氣態(tài)形式存在于空氣中的揮發(fā)性有機(jī)物的總稱，其成分和濃度的改變蘊(yùn)含著人體健康狀態(tài)信息。另一部分為外源性氣體，是呼吸道解剖無(wú)效腔部分的氣體，這部分氣體不參與氣-血交換。因此，能夠有效收集反映機(jī)體代謝狀態(tài)的內(nèi)源性呼出氣體，是完成呼吸診斷的前提。文獻(xiàn)報(bào)道中使用的呼出氣體收集方法主要有兩種：氣袋收集和呼出氣體冷凝液收集。

1.1 氣袋收集法

氣袋收集法具有操作筒單、效率高等優(yōu)點(diǎn)，主要有潮氣呼吸收集法、最大呼氣收集法、CO2監(jiān)測(cè)肺泡氣收集法等[6]。呼氣研究中，可靠的氣體樣品收集和儲(chǔ)存方法是保證呼氣檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性與可靠性的關(guān)鍵。這要求氣袋具有能夠?qū)怏w樣品與外界空氣隔絕的密封性，不吸收也不釋放任何VOCs，從而保證袋內(nèi)氣體樣品成分的穩(wěn)定性。Tedlar(泰德拉)PVF材質(zhì)采樣袋，是目前國(guó)際上呼氣采樣使用最廣泛的采樣袋，可用于高精度分析采樣。PVF聚氟乙烯材質(zhì)具有優(yōu)異的化學(xué)惰性、抗腐蝕性、抗污染性、吸附性低、氣體滲透率低等特性，同時(shí)還具有能保存氣體的穩(wěn)定性，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道其儲(chǔ)存VOCs的穩(wěn)定時(shí)間長(zhǎng)達(dá)10 h[7]。

1.2 呼出氣體冷凝液收集法

呼出氣體冷凝液(exhaled breath condensate, EBC)的收集，是一種簡(jiǎn)單、可多次利用、完全無(wú)創(chuàng)的獲得呼吸道標(biāo)本的技術(shù)。EBC所含成分通常包括呼吸道中氣態(tài)、液態(tài)、半固態(tài)物質(zhì)等，通過(guò)檢測(cè)EBC的變化而反映呼吸道是否處于病理狀態(tài)。EBC收集過(guò)程中制冷效果的不同，可能會(huì)導(dǎo)致冷凝物收集量的差異。為了實(shí)現(xiàn)EBC采集技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化，德國(guó)Eric Jaeger公司生產(chǎn)的EcoScreen冷凝器能夠維持收集過(guò)程中-20℃恒溫，囑測(cè)試驗(yàn)者以正常呼吸頻率和潮氣量持續(xù)呼吸20～30 min，成功獲得1～3 mL的呼氣冷凝液置-70℃冷凍保存待測(cè)[8]。但目前EBC收集儲(chǔ)存技術(shù)尚未標(biāo)準(zhǔn)化，多數(shù)研究者使用自制裝置收集EBC，裝置的管道和收集室由玻璃、鋁、硅酮、聚苯乙烯等不同材料制成，因不同材料對(duì)待測(cè)物的吸附性不一，可能會(huì)干擾EBC實(shí)際檢測(cè)值[9]。

1.3 固相微萃取收集法

固相微萃取(solid-phase microextraction, SPME)技術(shù)是由Pawliszyn于20世紀(jì)90年代初提出，適用于萃取分析揮發(fā)性和非揮發(fā)性物質(zhì)的新型樣品前處理技術(shù)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，SPME涌現(xiàn)出新的操作模式：外涂纖維SPME(fiber SPME)、薄膜微萃取、毛細(xì)管內(nèi)微萃取(in-tube SPME)，以fiber SPME 和 in-tube SPME應(yīng)用范圍最廣[10]。Fiber SPME是以聚合物固定相涂覆在熔融石英纖維的末端1 cm處而制得，可將目標(biāo)物吸附聚集在纖維表面。其操作簡(jiǎn)便，可集吸附、富集、解吸、進(jìn)樣于一體，通常與氣相色譜和高效液相色譜等儀器聯(lián)用，如Zou等[11]在利用Tedlar袋收集樣品后，采用固相微萃取技術(shù)于對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)富集并提取解吸，最后與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)聯(lián)用，以分析篩選肺癌的揮發(fā)性標(biāo)志物，并排除了非惡性肺部疾病對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

2 常用的檢測(cè)方法

2.1 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)是通過(guò)氣相色譜使復(fù)雜的物質(zhì)分離，再利用質(zhì)譜作為檢測(cè)器進(jìn)行定性和定量分析的分離檢測(cè)儀器。兼具氣相色譜能使樣品分子在流動(dòng)相與固定相瞬間達(dá)到平衡的高效率特性，以及質(zhì)譜法能分析微克級(jí)別樣品的高靈敏特性。該技術(shù)是分離、檢測(cè)和量化生物樣本中VOCs的有效方法。

2.2 質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)質(zhì)譜

質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)質(zhì)譜(proton transfer reaction-mass spectrometry, PTR-MS)是在選擇離子流動(dòng)管質(zhì)譜的基礎(chǔ)上，結(jié)合化學(xué)電離法和流動(dòng)漂移管模型技術(shù)開發(fā)的在線VOCs檢測(cè)技術(shù)。主要由進(jìn)樣系統(tǒng)、離子源、漂移管、質(zhì)量分析器、監(jiān)測(cè)系統(tǒng)5部分組成[12]，具有響應(yīng)迅速、操作簡(jiǎn)單、無(wú)需標(biāo)定等優(yōu)點(diǎn)，成為痕量氣體分析的潛在手段。通過(guò)對(duì)人體呼出氣體的分析，可發(fā)展成為以篩選疾病標(biāo)志物為目標(biāo)的輔助診斷方法。

2.3 選擇性離子流管質(zhì)譜

選擇性離子流管質(zhì)譜(selected ion flow tube mass spectrometry, SIFT-MS)是基于流動(dòng)管技術(shù)、化學(xué)電離技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)對(duì)呼出氣體中的VOCs進(jìn)行定性定量分析的方法[13]。通過(guò)四級(jí)質(zhì)量過(guò)濾器從微波放電產(chǎn)生的離子混合物中選擇出前體離子(H3O+、NO+或O2+)并將其注入快速流動(dòng)的氦載氣中。所選擇的前體離子用于電離以穩(wěn)定流速注入的空氣或呼吸樣品中的痕量氣體。樣品中的前體離子和痕量化合物之間的反應(yīng)產(chǎn)生了可識(shí)別化合物種類的特征產(chǎn)物離子，而且其計(jì)數(shù)率可以量化。SIFT-MS有兩種操作模式:全掃描模式(full scan, FS)與多離子監(jiān)測(cè)模式(multi-ion monitoring, MIM)。SIFT-MS作為快速在線實(shí)時(shí)分析技術(shù)，其檢測(cè)極限范圍從ppbv到pptv，且無(wú)需對(duì)樣品預(yù)處理，具有很高的靈敏度和分辨率，適合于呼吸分析[14]。

2.4 離子遷移譜

離子遷移譜(ion mobility spectrometry, IMS)的原理基于氣體代謝物的電離作用。在周圍環(huán)境壓力下，氣體代謝物在長(zhǎng)度僅數(shù)厘米長(zhǎng)的漂移管中被短脈沖(10～100 μs)分離，在法拉第板上產(chǎn)生的非常小的電流(nA～pA)形成了離子運(yùn)行時(shí)間的光譜。IMS與氣相色譜柱的結(jié)合可以保證氣體代謝物在進(jìn)入漂移管之前的預(yù)分離。但是，IMS無(wú)法識(shí)別氣體中的未知化合物。IMS的主要優(yōu)點(diǎn)是無(wú)需進(jìn)行任何預(yù)濃縮即可檢測(cè)極低濃度的化合物(ng/L ～ pg/L, ppmv ～ pptv)，并且分析時(shí)間短[15]。

2.5 光譜分析

光譜分析是一種基于分子特征光譜對(duì)呼出氣體進(jìn)行的定性和定量分析的技術(shù)。光譜分析主要的分析方法有傅里葉變換紅外光譜分析(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)、可調(diào)諧激光吸收光譜(tunable diode laser absorption spec-troscopy, TDLAS)、光聲光譜(photo-acoustic spectroscopy, PAS)、光腔衰蕩光譜(cavity ring-down spectroscopy, CRDS)等[16-18]。在實(shí)際應(yīng)用中，因激光具有單色性好、亮度高、方向性強(qiáng)和相干性強(qiáng)等特點(diǎn)而被視為理想光源。激光光譜技術(shù)在靈敏度、選擇性和響應(yīng)時(shí)間等方面有著巨大的優(yōu)勢(shì)。而且，激光光譜分析技術(shù)不需要對(duì)呼出氣體樣品預(yù)處理，具有響應(yīng)快、靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)、選擇性好、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)該項(xiàng)技術(shù)成本相對(duì)較低，有著廣闊的應(yīng)用前景[19]。

2.6 石英晶體微天平

石英晶體微天平對(duì)氣體分子沒(méi)有選擇性，通常需要涂覆敏感材料，目標(biāo)氣體與敏感涂層在電場(chǎng)中相互作用引起壓電材料質(zhì)量改變，進(jìn)而使聲波信號(hào)的頻率、波速等參數(shù)發(fā)生變化，由此獲得目標(biāo)氣體的質(zhì)量和濃度等相關(guān)信息。相比于傳統(tǒng)的金屬氧化物半導(dǎo)體傳感器，質(zhì)量型傳感器具有可在常溫操作、穩(wěn)定性好、靈敏度高、檢測(cè)限低、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。修飾質(zhì)量型傳感器的敏感材料種類主要有：金屬氧化物半導(dǎo)體材料、高分子聚合物材料、納米材料以及復(fù)合材料等[20]。

2.7 電子鼻

電子鼻(eNose)是通過(guò)模擬哺乳動(dòng)物的嗅覺(jué)功能而建立的精密人工嗅覺(jué)儀器，主要通過(guò)氣味指紋圖譜對(duì)VOCs等進(jìn)行定性或定量分析。電子鼻由氣敏傳感器陣列、信號(hào)預(yù)處理單元和模式識(shí)別系統(tǒng)等三大部分組成，分別對(duì)應(yīng)哺乳動(dòng)物的嗅覺(jué)系統(tǒng)3個(gè)層次的神經(jīng)元[21]。氣敏傳感器陣列將氣體信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，并進(jìn)行綜合判斷，通過(guò)電信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)反映氣體的濃度和成分；信號(hào)預(yù)處理單元對(duì)氣敏傳感器陣列產(chǎn)生的信號(hào)進(jìn)行放大、轉(zhuǎn)換、采集和傳輸，從而得到合理的數(shù)據(jù)模型，以便進(jìn)一步的分析；模式識(shí)別相當(dāng)于哺乳動(dòng)物的大腦皮層，它通過(guò)主成分分析(principal component analysis, PCA)、線性分析(linear discriminant analysis, LDA)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等算法對(duì)電信號(hào)進(jìn)行模式識(shí)別，實(shí)現(xiàn)對(duì)被檢氣體的辨別[22]。利用傳感器陣列可實(shí)現(xiàn)對(duì)混合復(fù)雜氣體的處理和分析。此外，電子鼻還具有響應(yīng)廣泛、操作簡(jiǎn)捷、價(jià)格低廉、儀器便攜等優(yōu)點(diǎn)使其廣泛用于食品檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)和醫(yī)療衛(wèi)生等行業(yè)[23-25]。

3 臨床應(yīng)用

已有的檢測(cè)方法可靈敏地感知呼出氣體中反應(yīng)人體代謝情況的痕量物質(zhì)變化，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)開展了相關(guān)的臨床研究，發(fā)現(xiàn)呼氣分析在癌癥早期檢測(cè)和傳染病篩查等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

3.1 癌癥診斷

癌癥是全球共同面臨的健康衛(wèi)生問(wèn)題，預(yù)計(jì)將成為21世紀(jì)限制預(yù)期壽命提高的主要障礙[26]。目前臨床中主要通過(guò)實(shí)驗(yàn)室、影像學(xué)、病理學(xué)等檢測(cè)方法對(duì)癌癥進(jìn)行診斷。

傳統(tǒng)的血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)、痰細(xì)胞學(xué)檢測(cè)、以及X線射片等檢查方式在其機(jī)制上存在較高的假陽(yáng)性率且無(wú)法實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期篩查，而CT掃描無(wú)法確定腫塊性質(zhì)，從而造成大量假陽(yáng)性結(jié)果，導(dǎo)致不必要的組織活檢[27]。另外，考慮到癌癥檢測(cè)結(jié)果對(duì)患者及其家屬的重要性，尋求快捷、準(zhǔn)確、多樣化的檢測(cè)方法已經(jīng)成為現(xiàn)階段癌癥診斷新的熱點(diǎn)問(wèn)題。目前，呼氣分析技術(shù)在癌癥診斷中得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，逐漸成為解決上述問(wèn)題的潛在有效手段。表1簡(jiǎn)述了近年來(lái)有關(guān)呼氣檢測(cè)技術(shù)在癌癥診斷中的研究報(bào)道，發(fā)現(xiàn)呼氣檢測(cè)在肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等多種癌癥檢測(cè)中有著良好的靈敏性和特異性。

表1 呼氣分析技術(shù)在癌癥檢測(cè)中的研究概述Tab.1 Exhaled breath analysis in cancer detection

續(xù)表1

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，也有文獻(xiàn)報(bào)道人工智能結(jié)合影像學(xué)、人工智能結(jié)合病理學(xué)對(duì)癌癥進(jìn)行檢測(cè)[51-53]，并取得一定成效。期待能將人工智能與呼氣檢測(cè)相結(jié)合，從而成為一種新型無(wú)創(chuàng)檢測(cè)方法，發(fā)揮出更大潛力。

3.2 非癌癥疾病

除癌癥以外，呼氣分析技術(shù)在其他疾病的診斷中也發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用，尤其在消化系統(tǒng)疾病、肺部疾病以及血液系統(tǒng)疾病方面進(jìn)行了較多嘗試。

3.2.1肺部疾病

WHO公布的數(shù)據(jù)顯示2018年全球約有1 000萬(wàn)人感染結(jié)核病，其中主要以肺結(jié)核患者為主，且耐藥性結(jié)核逐漸增多[54]?？焖俸?jiǎn)便的檢測(cè)方法將有助于開展大規(guī)模篩查，發(fā)現(xiàn)潛在感染者并進(jìn)行預(yù)防性治療。Phillips等[55]通過(guò)體外培養(yǎng)結(jié)合GC-MS技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了130種不同的揮發(fā)性有機(jī)物，可能由結(jié)核分枝桿菌或其引起機(jī)體氧化應(yīng)激而產(chǎn)生。通過(guò)初步的臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)呼出氣體進(jìn)行分析能有效識(shí)別肺部結(jié)核感染。此后相關(guān)學(xué)者也開展了系列的臨床研究，表2簡(jiǎn)要總結(jié)了近年來(lái)呼氣分析在肺結(jié)核診斷上的相關(guān)報(bào)道。

塵肺病是由于在生產(chǎn)活動(dòng)中長(zhǎng)期吸入粉塵而引起，是我國(guó)影響范圍最廣、最嚴(yán)重的職業(yè)病。目前尚無(wú)特異性診斷措施，主要根據(jù)職業(yè)接觸史結(jié)合臨床表現(xiàn)，在排除其它肺部疾病后作出診斷。

Hsiao-Yu Yang等[63]利用GC-MS技術(shù)對(duì)25例患者和154例對(duì)照呼出氣體進(jìn)行分析，結(jié)合主成分分析進(jìn)行預(yù)測(cè)，AUC為0.88。次年，該團(tuán)隊(duì)又利用電子鼻對(duì)34例患者和64例對(duì)照的呼出氣體中揮發(fā)性有機(jī)物進(jìn)行分析[64]，其中80%用于建立模型，20%用于驗(yàn)證。最終訓(xùn)練組靈敏性、特異性、準(zhǔn)確率為67.9%、88.0%、80.8%，驗(yàn)證組為66.7%、71.4%、70.0%。這說(shuō)明呼氣分析在塵肺病診斷中具有著潛在的應(yīng)用價(jià)值，但目前仍需進(jìn)行更深入的實(shí)驗(yàn)研究，進(jìn)一步提高檢驗(yàn)性能。

另外，慢性阻塞性肺疾病、哮喘以及上呼吸道感染等疾病相關(guān)研究也取得了一定進(jìn)展。

3.2.2肝臟疾病

肝臟是人體最大的消化腺和物質(zhì)代謝的重要器官，以肝硬化為代表的肝臟病理?yè)p傷能夠?qū)е缕浯x活動(dòng)的改變，從而產(chǎn)生不同種類的異常VOCs。隨著呼氣檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，許多學(xué)者嘗試將這種無(wú)創(chuàng)、便捷的技術(shù)運(yùn)用于肝臟疾病的診斷與鑒別中。Dadamio等[65]利用GC-MS技術(shù)對(duì)肝硬化患者和健康志愿者的肺泡氣進(jìn)行分析，通過(guò)線性判別分析建立模型，最終能夠有效區(qū)分兩組人群。秦濤等[66]利用GC-MS技術(shù)檢測(cè)呼出氣體中的揮發(fā)性有機(jī)物，發(fā)現(xiàn)3-羥基-2-丁酮在健康人和肝癌人群中診斷肝癌的靈敏性與特異性達(dá)到83.3%與91.7%。此外在肝硬化與肝癌人群中診斷肝癌的靈敏性為70.0%、特異性為70.4%。Eng等[67]對(duì)慢性肝病和代償性肝硬化患者呼氣樣本和血液樣本進(jìn)行分析，最終確定5種血清學(xué)標(biāo)志物和11種氣體標(biāo)志物，在檢測(cè)慢性肝病人群中代償性肝硬化患者時(shí)，氣體標(biāo)志物的靈敏度和特異性都高于血清學(xué)標(biāo)志物。此后De Vincentis等[68]利用電子鼻分析呼出氣體，發(fā)現(xiàn)能夠有效地區(qū)別肝硬化與非肝硬化性慢性肝病、慢性肝病與健康人群，且在預(yù)測(cè)肝硬化和失代償肝硬化中準(zhǔn)確率達(dá)到96.6%和88.5%。此外，還有呼氣分析在非酒精性脂肪肝、肝性腦病等疾病診斷鑒別中的報(bào)道[69-70]。

表2 呼氣分析技術(shù)用于肺結(jié)核檢測(cè)Tab.2 Exhaled breath analysis in tuberculosis detection

呼氣分析能在早期對(duì)肝臟疾病進(jìn)行無(wú)創(chuàng)性檢測(cè)，一方面有助于在疾病早期便采取干預(yù)措施防止病情惡化，另一方面能在其基礎(chǔ)上開展相關(guān)檢查，避免過(guò)度診療，促進(jìn)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展。

3.2.3糖尿病

我國(guó)已成為世界上糖尿病患者最多的國(guó)家，且發(fā)病日趨年輕化。糖尿病因其對(duì)健康的嚴(yán)重危害性以及對(duì)社會(huì)發(fā)展的巨大負(fù)面影響，已成為我國(guó)實(shí)施綜合防治管理的主要慢性病[71]。糖尿病患者因胰島素絕對(duì)或相對(duì)不足，無(wú)法有效通過(guò)糖代謝為機(jī)體提供能量，脂肪動(dòng)員顯著加強(qiáng)，造成酮體在血液中濃度大幅升高，嚴(yán)重時(shí)可造成酮癥酸中毒，危及患者生命[72-73]。機(jī)體可通過(guò)呼吸作用排除酮體，因而可通過(guò)測(cè)定呼出氣體中丙酮、β-羥丁酸的濃度等指標(biāo)，為糖尿病的診斷提供指導(dǎo)性依據(jù)，另外，呼氣分析技術(shù)的日益成熟有助于糖尿病患者在血糖檢測(cè)過(guò)程中依從性的提高。

高照華[74]對(duì)健康對(duì)照組、2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)組和糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)組分別采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法測(cè)定呼氣丙酮含量,在T2DM組和DN組中呼氣中的丙酮含量均高于健康對(duì)照組(P<0.01)；ROC曲線下面積AUC=0.902，P<0.001，以呼氣酮體=1.185 ppm作為預(yù)測(cè)糖尿病酮癥發(fā)生的最佳臨界點(diǎn)，其靈敏度為90.6%，特異度為77.1%。

臧寧等[75]通過(guò)對(duì)健康對(duì)照組、1型糖尿病組分別采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法測(cè)定呼氣丙酮含量、全自動(dòng)生化儀的己糖激酶法測(cè)定空腹血糖以及高壓液相反相陽(yáng)離子交換層析法(high performance liquid chromatography, HPLC)測(cè)定糖化血紅蛋白(HA1C)，在1型糖尿病組中呼氣中的丙酮含量高于健康對(duì)照組(P<0.01)；而且丙酮分別與空腹血糖、胰島素注射后1、2 h血糖水平均有很好的相關(guān)性，與糖化血紅蛋白水平呈線性相關(guān)。檢測(cè)呼氣中的丙酮有助于1型糖尿病的早期診斷和血糖監(jiān)測(cè)，其敏感性與傳統(tǒng)的血糖測(cè)定相近，能及時(shí)反映患者血糖波動(dòng)情況。

3.2.4中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病

中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病是一組以原發(fā)性神經(jīng)元變性為基礎(chǔ)的慢性進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，表現(xiàn)為神經(jīng)元進(jìn)行性變性、壞死，引起認(rèn)知及行為異常，主要包括阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)、帕金森病(Parkinson’s disease, PD)、肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)、亨廷頓病(Huntington’s disease, HD)等[76]。其中AD、PD發(fā)病率位居前兩位，因?yàn)槟壳皟烧叩陌l(fā)病機(jī)制尚無(wú)定論，對(duì)其診斷往往需要花費(fèi)大量時(shí)間精力，為患者及家屬帶來(lái)不必要的負(fù)擔(dān)。近年來(lái)，已有一些呼氣分析技術(shù)進(jìn)行AD以及PD輔助診斷的研究，可能為中樞系統(tǒng)疾病的診治提供新方法和新思路。

Akira等[77]的研究通過(guò)氣相色譜-離子遷移光譜(gas chromatography-ion mobility spectrometry, GC-IMS)技術(shù)，將AD相關(guān)輕度認(rèn)知障礙(mild cognitive impairment, MCI)患者、AD患者以及正常人群等三者成功進(jìn)行鑒別。實(shí)驗(yàn)在考慮年齡、吸煙習(xí)慣、性別和飲酒等混雜因素的情況下，共招募100名受試者，包括50名對(duì)照組、25名AD患者和25名MCI患者。使用商用GC-IMS儀器分析呼吸樣本中的VOCs，研究表明，丙酮、2-丙醇和2-丁酮等6種化合物在鑒別診斷組中起著關(guān)鍵作用；GC-IMS作為一種無(wú)創(chuàng)、高通量的診斷技術(shù)，在臨床診斷和監(jiān)測(cè)AD方面具有巨大的潛力。

Bach等[78]通過(guò)電子鼻技術(shù)，經(jīng)過(guò)訓(xùn)練，能正確區(qū)分AD、PD和健康對(duì)照。利用IMS，借助決策樹學(xué)習(xí)模型，鑒定出可用于區(qū)分AD和PD患者與健康對(duì)照組的標(biāo)記物為1-丁醇、2-甲基呋喃等4種有機(jī)物，準(zhǔn)確率為94%；其中PD患者的檢測(cè)敏感性和特異性均為100%，53名參與者中有3名AD患者被錯(cuò)誤分類。該實(shí)驗(yàn)聯(lián)合使用2種呼氣分析技術(shù)，提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性，為AD發(fā)病機(jī)制的探究提供了新的依據(jù)。

Lau等[79]使用氣相色譜和質(zhì)譜(GC-MS)研究了AD、PD患者和健康人呼氣樣本中的化學(xué)成分作為對(duì)照組。研究結(jié)果表明，AD組中的一些化合物，如1-苯甲酚和3-氰基-2,3-雙(2,5,-二甲基-3-噻吩基)-丙烯酸乙酯的百分比高于PD組和對(duì)照組。此外，研究者設(shè)計(jì)并開發(fā)了由多個(gè)傳感器組成的呼氣傳感器陣列，以檢測(cè)患者和對(duì)照組的分布模式。結(jié)果顯示，在患者和對(duì)照組之間的靈敏度特性的標(biāo)準(zhǔn)化響應(yīng)方面顯示出顯著差異，通過(guò)主成分分析、Sammon映射和兩種方法的組合，可區(qū)分AD患者、PD患者和健康個(gè)體。鑒于此，呼氣式呼吸傳感器系統(tǒng)能夠?yàn)锳D的診斷提供替代選擇，有望成為AD篩查和診斷的有效工具。

3.2.5新生兒疾病

機(jī)體紅細(xì)胞因各種原因遭破壞而釋放出的血紅蛋白，其組分中血紅素在酶的催化下轉(zhuǎn)化為等分子量的膽紅素、一氧化碳和游離鐵。絕大多數(shù)內(nèi)源性一氧化碳來(lái)自血紅素的分解代謝,一氧化碳與血紅蛋白結(jié)合，以碳氧血紅蛋白(carboxyhemoglobin, COHb)的形式經(jīng)血液循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)到肺，隨呼吸排出[80]。呼氣末一氧化碳(end-tidal carbon monoxide, ETCO)與紅細(xì)胞的破裂以及膽紅素的代謝相關(guān)，通過(guò)對(duì)ETCO的測(cè)定結(jié)合其他檢查，可為新生兒溶血性疾病、高膽紅素血癥等疾病的診斷提供有力證據(jù)。目前，國(guó)內(nèi)外臨床工作中已逐漸將COHb作為新生兒疾病診斷的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

3.2.5.1新生兒溶血性疾病

20世紀(jì)末，國(guó)外學(xué)者率先采用氣相色譜法測(cè)定ETCO發(fā)現(xiàn)非溶血性黃疸和溶血性黃疸的新生兒平均值分別為(1.9 ± 0.6)× 106和(7.3 ± 0.6)× 106，提示溶血性疾病與COHb水平(校正后)有關(guān)[81]。Christensen等[82]也通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明20名明確有溶血障礙的新生兒及兒童的ETCO值高于20名年齡匹配的健康對(duì)照組(P<0.000 1)。Barak等[83]通過(guò)測(cè)定58名平均足月新生兒的紅細(xì)胞壓積(hematocrit, HCT)、血紅蛋白(hemoglobin, Hb)水平反映紅細(xì)胞質(zhì)量，同時(shí)測(cè)定校正后的ETCO，探究ETCO與紅細(xì)胞質(zhì)量之間的關(guān)系。結(jié)果表明ETCO與Hb、HCT顯著相關(guān)，而ETCO/HCT無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此可將ETCO/HCT用于提高預(yù)測(cè)病理性溶血的特異度和靈敏度。

2004美國(guó)兒科學(xué)會(huì)指南特別推薦通過(guò)測(cè)ETCO來(lái)識(shí)別嬰兒溶血性疾病和后續(xù)的高膽紅素血癥的風(fēng)險(xiǎn)。目前已有美國(guó)Capnia公司研發(fā)的CoSense Monitor等檢測(cè)設(shè)備用于臨床，我國(guó)也正在加快ETCO指標(biāo)用于臨床診斷的進(jìn)程[81]。

3.2.5.2新生兒高膽紅素血癥

紅細(xì)胞溶血以及新生兒膽紅素代謝的特點(diǎn)可能造成非生理性高膽紅素血癥(又稱病理性黃疸)，嚴(yán)重的高膽紅素血癥可造成膽紅素腦病(核黃疸)，可造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)可逆性或永久性損害。因此通過(guò)測(cè)定ETCO，降低新生兒溶血性疾病發(fā)展成嚴(yán)重高膽紅素血癥的風(fēng)險(xiǎn)對(duì)疾病的診治和預(yù)后具有重要價(jià)值。

Okuyama等[84]通過(guò)對(duì)日本51名健康足月、無(wú)溶血性疾病嬰兒的研究，借助ROC分析發(fā)現(xiàn)42 h時(shí)的ETCO水平是隨后高膽紅素血癥的最預(yù)測(cè)因素。在1.8 ppm的臨界值下，敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)、陰性預(yù)測(cè)值分別為86%、80%、40%和97%。浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院于2012年開始進(jìn)行相關(guān)研究，并應(yīng)用ETCO進(jìn)行黃疸管理決策[85]。

另外，ETCO在新生兒敗血癥、支氣管肺發(fā)育不良、呼吸窘迫綜合征、缺血缺氧性腦病等臨床診斷中仍有很好的探索價(jià)值和應(yīng)用前景[86]。

4 存在的問(wèn)題與應(yīng)用前景

呼氣診斷在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，如：碳13或碳14尿素呼氣試驗(yàn)已成為檢測(cè)幽門螺桿菌感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”；訓(xùn)練有素的嗅探犬能夠偵測(cè)肺癌、胃癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等癌癥以及代謝性疾病和帕金森氏癥等疾病，最新報(bào)道指出，嗅探犬經(jīng)過(guò)適當(dāng)訓(xùn)練后能夠區(qū)分感染SARS-CoV-2和未感染的唾液樣本，總體成功率達(dá)到94%[87]。但因?yàn)檠芯科鸩捷^晚、發(fā)展時(shí)間有限等原因，呼氣分析技術(shù)的研究仍然存在一些亟待解決的難題，仍有很大空間需要進(jìn)一步提升。

目前，呼氣分析存在的問(wèn)題主要包括：一是能用于呼氣分析的儀器設(shè)備較為專業(yè)，不僅昂貴，而且大多只能在實(shí)驗(yàn)室中開展分析工作；二是人體成分復(fù)雜、呼氣分析相關(guān)的特征性標(biāo)志物的產(chǎn)生機(jī)理和臨床意義等方面仍需要進(jìn)一步研究；三是呼氣分析相關(guān)的臨床樣本和驗(yàn)證數(shù)量有限、樣本量不大導(dǎo)致結(jié)果易受個(gè)體差異的影響；四是當(dāng)前大部分研究數(shù)據(jù)處理方法不夠豐富，未使用多批次數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，因而對(duì)是否受到建模方法的影響尚不能確定；五是不同研究之間因?yàn)閷?shí)驗(yàn)客觀條件的制約以及尚未形成統(tǒng)一檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)從而導(dǎo)致難以進(jìn)行橫向比較。

當(dāng)前，大數(shù)據(jù)、人工智能領(lǐng)域發(fā)展迅猛，為以電子鼻為代表的呼氣分析方法提供了新的發(fā)展機(jī)遇，呼氣分析技術(shù)研究的進(jìn)展也將更多的在多學(xué)科交叉中產(chǎn)生。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立，可以跨越時(shí)間和空間的限制，根據(jù)疾病、地域、人種、氣體種類和分析方法保存數(shù)據(jù)，并通過(guò)優(yōu)化算法、借助機(jī)器學(xué)習(xí)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析整理，剔除干擾因素，進(jìn)而為臨床診斷提供可靠依據(jù)。

綜上所述，今后呼氣分析技術(shù)的進(jìn)一步開發(fā)完善和臨床應(yīng)用的推進(jìn)可從以下方面進(jìn)行：一是呼氣分析儀器便攜化發(fā)展，使之能在臨床中推廣應(yīng)用，同時(shí)滿足大樣本篩查的需要；二是優(yōu)化呼氣樣本的采集、貯存及前處理方法，避免環(huán)境中揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生干擾；三是嘗試進(jìn)行對(duì)疾病標(biāo)志物的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，探究與疾病進(jìn)展變化間的聯(lián)系，也能夠避免因個(gè)體差異產(chǎn)生誤差；四是盡快統(tǒng)一檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)、建立范式，以便開展基于臨床試驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)研究；五是從疾病機(jī)制出發(fā)，尋找特異性更強(qiáng)的標(biāo)志物，排除人體內(nèi)源性揮發(fā)性有機(jī)物的影響。

相信經(jīng)過(guò)不斷努力，在不久的未來(lái)，呼氣分析技術(shù)能夠憑借其所具有的前瞻性、無(wú)創(chuàng)、快速、可重復(fù)、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)可成為臨床實(shí)踐中一項(xiàng)可靠的輔助診斷方法。