蔣 升 李佩倫 寧鋼民

(浙江大學生物醫(yī)學工程與儀器科學學院，杭州 310058)

引言

微循環(huán)包括微動脈、微靜脈和毛細血管，是循環(huán)系統(tǒng)的最小單元，也是血液與組織進行氧和及營養(yǎng)物質(zhì)交換的場所[1]。研究表明，微循環(huán)病變發(fā)生早于體循環(huán)病變，是導致組織低灌注和休克，繼而引起多器官功能衰竭的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。如微循環(huán)障礙患者的全身血流動力學情況恢復后，代表組織灌注的指標，如乳酸和尿量等，仍出現(xiàn)異常[3]，這說明微循環(huán)障礙尚未得到改善。因此進行微循環(huán)監(jiān)測和評估有助于檢驗治療是否達到合理水平。

舌體微循環(huán)包括舌乳頭微循環(huán)[4]與舌下微循環(huán)形態(tài)[5]，兩者結(jié)構(gòu)差異較大，其中舌下微循環(huán)呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。舌下微循環(huán)富含微血管且血流灌注活躍、微循環(huán)狀態(tài)變化豐富，一定程度上反映了活體組織微循環(huán)的狀態(tài)，是進行臨床微循環(huán)監(jiān)測和活體動物微循環(huán)監(jiān)測的理想部位[6]。舌下微循環(huán)監(jiān)測越來越得到廣泛應用：臨床上，舌下微循環(huán)監(jiān)測能夠反映機體微循環(huán)障礙狀態(tài)，已經(jīng)用于評價膿毒癥、呼吸衰竭等重癥疾病演變過程中重要病理生理改變[7]；實驗中，舌下微循環(huán)監(jiān)測也被用于藥物對微循環(huán)的影響[8]，以及活體動物各器官微循環(huán)生理、病理關(guān)系等的研究[9]。

本文回顧總結(jié)了舌下微循環(huán)顯微影像監(jiān)測采用的光學技術(shù)模式、成像后的圖像處理算法、基于特征提取算法得到的指標體系以及舌下微循環(huán)監(jiān)測的應用情況，并對開展舌下微循環(huán)監(jiān)測的發(fā)展進行了展望。

1 設備

1.1 構(gòu)成

舌下微循環(huán)顯微影像監(jiān)測設備通常由監(jiān)測探頭和主機組成(見圖1)。監(jiān)測探頭采用不同形式的光學技術(shù)對約1 mm2范圍的舌下微循環(huán)進行拍攝。視頻通過線纜傳至主機，借助圖像處理算法處理，生成相應的評價指標。

圖1 舌下微循環(huán)顯微影像監(jiān)測設備Fig.1 Sublingual microcirculation monitoring device

1.2 探頭采用的光學技術(shù)

自20世紀90年代以來，舌下微循環(huán)顯微影像監(jiān)測探頭采用的光學技術(shù)已經(jīng)出現(xiàn)3種模式。

第1種模式是由Groner等[10]提出的正交偏振多光譜(orthogonal polarization spectral，OPS)成像技術(shù)(見圖2)。該技術(shù)主要特點在于：使用與血紅蛋白吸收波長相近的550 nm波長的偏正光照射組織，其反射光經(jīng)過一個呈直角的偏振片最終成像，因此成像后紅細胞為黑色小體，顯著提高了微血管圖像的對比度。OPS技術(shù)的局限性在于：首先，對光線過于敏感，容易造成影像模糊，從而影響清晰度，不利于對毛細血管的觀察；其次，需要具備高能光源，一定程度限制了臨床應用的普及。

圖2 正交偏振多光譜成像技術(shù)原理[3]Fig.2 OPS：Orthogonal polarization spectral[3]

第2種模式是旁流暗視野(sidestream dark field，SDF)成像技術(shù)[11]，是OPS技術(shù)的衍生技術(shù)(見圖3)。該技術(shù)特點在于：將光源改為發(fā)光二極管，排列在探測器末端，發(fā)出波長為530 nm綠光。獨立極化的光源可以照入更深的微循環(huán)內(nèi)部組織，使得紅細胞和白細胞對比度更高，因此顯著提高了分辨率，并能監(jiān)測 更深組織的毛細血管。 荷蘭MicroVision Medical公司生產(chǎn)的MicroScan SDF設備[12]和英國KK Technology公司生產(chǎn)的Capiscope HVCS-HR SDF設備[13]是其中的代表。

圖3 旁流暗視野技術(shù)和入射光暗視野技術(shù)原理[8]Fig.3 SDF:Sidestream dark field and IDF: Incident dark field[8]

第3種模式是入射光暗視野(incident dark field，IDF)成像技術(shù)[14]，這項技術(shù)原理于1971年最先提出[15](見圖3)。設備由筆狀探頭組成，其中包含了照明、透鏡、傳感器。設備利用高像素芯片和計算機控制下的短脈沖光源對光照進行同步和控制。IDF技術(shù)與SDF技術(shù)最大的區(qū)別是沒有隔離反射光中的入射光。IDF技術(shù)具有比SDF技術(shù)更高的分辨率，更好的成像質(zhì)量和更多可視化的毛細血管[16-17]。荷蘭Braedius Medical公司的Cytocam IDF設備[18]是其中的代表，該產(chǎn)品物鏡放大倍數(shù)為4倍，可以達到300線對/mm的光學分辨率，1.55 mm×1.16 mm視場。

1.3 主機采用的圖像處理算法

通過手持顯微設備獲取舌下微循環(huán)圖像后，需要通過合適的算法對圖像進行處理，以獲得有用的微循環(huán)評價指標。

Bezemer等[19]提出了處理舌下微循環(huán)圖像的一般算法流程(見圖4)。首先對視頻進行去抖動處理，得到穩(wěn)定的圖像序列；然后采用時間平均等方法得到時間平均圖像(為了填補血漿和白細胞造成的紅細胞間隙)和像素強度波動圖。利用時間平均圖檢測血管網(wǎng)絡中心線，并基于對比度閾值驗證中心線，像素強度波動圖用于檢測中心線是否存在血流灌注。最后，生成血管灌注密度和血管密度等評估指標。

之后，趙興群等[20]借鑒了Bezemer等的研究，提出了可以測量血管動態(tài)參數(shù)的微循環(huán)血流分析算法的設計方案，其算法包括：首先對視頻圖像進行消抖、去燥以及增強等預處理；隨后通過計算毛細血管區(qū)域與成像視野范圍的面積比值計算毛細血管密度以及通過血管中心線提取以及血管邊緣提取得到血管直徑；其次基于時空圖(spatiotemporal image, ST)的方法[19]估計微循環(huán)的流速等動態(tài)參數(shù)。該算法的技術(shù)路線是將細胞運動軌跡映射到ST圖中，將基于視頻的流速測量轉(zhuǎn)換為對ST圖中軌跡的方向測量。

除此之外，Kuryati等[21]綜述了基于圖像處理的視網(wǎng)膜微循環(huán)特征提取技術(shù)的研究現(xiàn)狀，可以為舌下微循環(huán)圖像處理提供借鑒。文章介紹了視網(wǎng)膜微循環(huán)生理特征，概述了腦卒中患者視網(wǎng)膜血管異常特征的圖像處理技術(shù)，總結(jié)了通用的視網(wǎng)膜特征提取過程，包括圖像采集、灰度圖像處理、眼底圖像增強、眼底圖像分割、邊緣檢測、血管提取、血管直徑測量、血管特征提取等。

1.4 探頭的固定形式

現(xiàn)有的舌下微循環(huán)顯微影像監(jiān)測設備通常采用手持方式，因此存在影像不穩(wěn)定以及觀測視野面積偏小(約1 mm2)問題。為此有研究提出采用可調(diào)節(jié)穩(wěn)定支架(adjustable stabilizing device，ASD)[22]或者圖像采集穩(wěn)定器(image acquisition stabilizer，IAS)[23-24]的方案。

ASD的基本結(jié)構(gòu)(見圖5)是一個由30 cm長的柔性金屬彎臂制成的C形夾，其底座固定于桌子等任意穩(wěn)定平面上，便于任意操作顯微設備的方向。柔性金屬彎臂內(nèi)部貫穿鋼纜以提供鋼性。在金屬彎臂的另一端是顯微設備固定裝置。固定裝置有3個調(diào)節(jié)方向，每個方向可以調(diào)節(jié)20 mm。該裝置可以避免手持顯微設備帶來的抖動情況，并可以通過調(diào)節(jié)旋鈕微調(diào)探頭位置，使觀察面積達到約1 cm2，是原先觀察面積(約1 mm2)的100倍。

圖5 可調(diào)節(jié)穩(wěn)定支架[11]Fig.5 Adjustable stabilizing device[11]

IAS由一個中空的不銹鋼圓柱體組成(見圖6)。它緊貼著手持設備探頭的一次性無菌帽的頂端。這種設計可以緩解探頭對觀察組織的壓力，同時不至于使設備失焦。同時，采用真空壓力調(diào)節(jié)器，通過IAS周圍的20個小孔，使得探頭與組織間產(chǎn)生負壓，以達到穩(wěn)定圖像的作用。實驗表明，采用IAS后，獲取穩(wěn)定圖像的時間由原先的平均(150±25)s，縮短到(99±20)s；穩(wěn)定圖像的持續(xù)時間由原先的(8±2)s提高到(42±8)s。

圖6 圖像采集穩(wěn)定器(IAS)[12]Fig.6 Image acquisition stabilizer[12]

2 微循環(huán)灌注指標

對于通過舌下微循環(huán)顯微成像設備獲取的微循環(huán)圖像，還需要利用合理的灌注指標對其灌注能力進行評價。根據(jù)2018年的《重癥患者舌下微循環(huán)評估第二次專家共識》中的意見[25]，毛細血管的灌注質(zhì)量、血管密度、血流灌注不均一性被用于評估微循環(huán)內(nèi)紅細胞向組織的輸氧能力。其中，灌注質(zhì)量的指標有微血管血流指數(shù)(microvascular flow index，MFI)和灌流血管比例(proportion of perfusion vessels，PPV)，可用于判斷微循環(huán)是否出現(xiàn)瘀滯。微血管血流指數(shù)采用半定量分析方法：血管直徑分為小血管、中血管和大血管；血流分為無血流、間歇流動、緩慢流動和持續(xù)流動。監(jiān)測圖像被分為4個象限，根據(jù)血管管徑和血流速度，可以給每個象限評分，平均分即為微血管血流指數(shù)。該指標的優(yōu)點是易于通過觀察得到。灌流血管比例采用百分比計數(shù)，指灌流血管(血流狀態(tài)為瘀滯或正常的血管)總長度除以所有血管的長度之和。該指標的優(yōu)點是再現(xiàn)性好，缺點是對各項同性敏感。

血管密度指標有總血管密度(total vascular density, TVD)、灌流血管密度(perfusion vascular density, PVD)和De Backer評分，可用于判斷微循環(huán)數(shù)量是否出現(xiàn)減少?？傃苊芏葹榭傃苊娣e除以總的分析面積。該指標的缺點是需要手工修正軟件識別參數(shù)，同時需要估計血管的直徑。灌流血管密度為總血管密度乘以灌流血管比例。該指標是臨床上衡量功能毛細血管密度的金標準，其缺點是計算需要消耗大量時間。De Backer評分計算方法為將圖像用3條橫線和3條縱線分割為9個區(qū)域，血管穿過各區(qū)域的數(shù)量除以總的血管長度即為評分值。代表的是功能毛細血管密度。

血流灌注不均一性指標有血流不均一指數(shù)(HI)，可用于判斷血流分布的異常程度。由各采樣點的微血管血流指數(shù)中最大MFI和最小MFI之差除以平均MFI得到。

上述指標體系一定程度反映了微循環(huán)灌注狀態(tài)，有助于評價微循環(huán)障礙程度，但是缺乏對微循環(huán)狀態(tài)的精準和完整描述，未來借助人工智能和機器學習等技術(shù)，可以獲得更豐富和有價值的微循環(huán)評價指標。

3 臨床應用

臨床上，舌下微循環(huán)顯微影像監(jiān)測目前較多用于膿毒癥、休克導致的重癥微循環(huán)障礙的檢測與評估。Ince等[26]的研究顯示，舌下微循環(huán)顯微影像監(jiān)測可以用于發(fā)現(xiàn)微循環(huán)是膿毒癥的使動因素：通過對舌下微循環(huán)監(jiān)測，與健康對照組相比，發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者微血管密度明顯降低，揭示了膿毒癥與微循環(huán)障礙的相關(guān)性。Rovas 等[27]的研究顯示，舌下微循環(huán)顯微影像可以用于檢測微循環(huán)障礙與糖萼受損程度的相關(guān)性，即將微血管血流指數(shù)和灌注血管比例與糖萼損傷標志物進行比較。在對膿毒癥治療的評價中，Ospina-Tascon等[28]的研究表明，舌下微循環(huán)監(jiān)測可以對膿毒癥液體復蘇進行評價：利用監(jiān)測設備對舌下血管灌注比例進行監(jiān)測后發(fā)現(xiàn)，膿毒癥早期時的液體恢復可以使小血管灌注比例從65%提升至80%，而晚期的液體恢復則從75%變?yōu)?4%。

最新的臨床研究中，舌下微循環(huán)監(jiān)測還被用于明確舌下微循環(huán)與肝硬化、低溫、體液失衡等病癥的關(guān)系。Ballerga 等[29]的研究通過監(jiān)測肝硬化病人舌下微循環(huán)灌注血管密度和比例，發(fā)現(xiàn)舌下微循環(huán)病變與肝硬化有關(guān)。趙川等[30]研究表明，通過監(jiān)測受試者微血管流動指數(shù)和灌注血管密度，發(fā)現(xiàn)低溫可引起微循環(huán)狀態(tài)異常。 Uz等[31]的研究顯示，通過監(jiān)測舌下微循環(huán)的總血管密度、灌注血管密度、灌注血管比例和微血管血流指數(shù)，發(fā)現(xiàn)微循環(huán)指標能反映體液的超負荷灌注。

4 實驗應用

一類重要的實驗應用是利用微循環(huán)顯微成像設備研究藥物對微循環(huán)的影響。在進行臨床治療特別是重癥治療時，特別要關(guān)注藥物對組織灌注，既微循環(huán)灌注的影響，微循環(huán)顯微成像設備在其中發(fā)揮了重要作用。硝酸甘油可以被用于血管舒張，減少外周血管阻力[32]。Boerma等[33]利用微循環(huán)顯微成像設備的研究表明，硝酸甘油可以改善微循環(huán)：注射0.5 mg硝酸甘油的膿毒癥患者的舌下微循環(huán)血流有明顯增加。右旋美托咪啶為有效的α2腎上腺素受體激動劑，臨床上用于重癥監(jiān)護治療期間插管和使用呼吸機時的鎮(zhèn)靜[34]。Hisham等[35]利用微循環(huán)顯微成像設備研究表明，這種鎮(zhèn)靜劑對微循環(huán)有改善作用：鎮(zhèn)靜劑組的血流指數(shù)和灌注血管密度均高于對照組。多巴酚丁胺可被用于舒張血管，增加心排量，但其在感染性休克復蘇中的作用仍存爭議[36]。Hernandez 等[37]利用微循環(huán)顯微成像設備研究表明，多巴酚丁胺對舌下微循環(huán)改善沒有幫助。苯腎上腺素被用于收縮血管、升高血壓，可被用于體外循環(huán)患者穩(wěn)定血壓[38]。 Maier等[39]利用微循環(huán)顯微成像設備研究了體外循環(huán)患者注射苯腎上腺素后組織灌注的變化情況。研究表明，苯腎上腺素會導致舌下微循環(huán)血流減少，影響組織灌注。特利加壓素是膿毒癥患者推薦加壓素藥物，被用于增加外周血管阻力，保障器官灌注[40]。Morelli等[41]利用微循環(huán)顯微成像設備研究表明，注射低劑量的特利加壓素不影響舌下微循環(huán)灌注。

還有一類應用是器官間微循環(huán)關(guān)系研究的實驗，即利用微循環(huán)顯微成像設備研究舌下微循環(huán)與臟器微循環(huán)間的關(guān)系，是用舌下微循環(huán)研究替代器官組織灌注研究的基礎(chǔ)。主要實驗有：Nakagawa等[9]的研究顯示，失血性休克或感染性休克時，大鼠的舌下二氧化碳分壓與胃二氧化碳分壓、乳酸水平直接相關(guān)，這一方面說明舌下微循環(huán)指標可以反映臟器微循環(huán)的狀態(tài)，另一方面說明舌下微循環(huán)指標還是評價全身循環(huán)系統(tǒng)的良好指標。Qian等[42]的研究顯示，隨著大鼠心臟驟停時間的延長，舌下微循環(huán)和腸道微循環(huán)血管密度都出現(xiàn)了下降，舌下微循環(huán)與腸道微循環(huán)變化存在關(guān)聯(lián)。劉威等[43]的研究也得到了相同的結(jié)論：豬在膿毒癥后舌下微循環(huán)和腸系膜微循環(huán)的PPV和MFI等都出現(xiàn)了下降。上述研究為疾病重癥期間監(jiān)測舌下微循環(huán)的意義提供了理論支持。另一方面，也有研究表明，膿毒癥恢復期時不同器官的微循環(huán)并不存在強相關(guān)性。Boerma等[44]的研究結(jié)果顯示，在進行膿毒癥治療后，第1 d時，膿毒癥患者的舌下微循環(huán)和腸系膜微循環(huán)的微循環(huán)流動指數(shù)(MFI)不相關(guān)；第3 d時，兩個區(qū)域的微循環(huán)流動指數(shù)趨于一致。該研究認為，在膿毒癥初期，局部微循環(huán)因素(如內(nèi)皮細胞活化能力、紅細胞變形能力、血管自調(diào)節(jié)能力等)可能影響微循環(huán)流量而不是全身血流動力學情況；隨著時間的推演，膿毒癥自身演變或治療策略的改變能影響微循環(huán)灌注情況。

5 對于臨床診治和研究的意義

越來越多的研究顯示，舌下微循環(huán)顯微影像監(jiān)測對于臨床診治和基礎(chǔ)研究有著非常積極的意義。首先，作為實用的床旁監(jiān)測設備，可使臨床醫(yī)生便捷、快速、高效地獲得患者微循環(huán)變化。其次，微循環(huán)障礙是重癥疾病的重要病理生理過程，重癥疾病如膿毒癥、休克等的發(fā)生發(fā)展與微循環(huán)的病變有著千絲萬縷的關(guān)系，如Trzeciak等[45]提出，基于序貫器官衰竭評估評分系統(tǒng)證實微循環(huán)灌注情況與臟器衰竭有關(guān)。舌下微循環(huán)顯微影像監(jiān)測可以使醫(yī)生獲得對微循環(huán)障礙深入研究的有效觀測窗口，發(fā)現(xiàn)微循環(huán)障礙與疾病發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸的關(guān)系，如文獻[26]的研究中，利用舌下微循環(huán)顯微影像監(jiān)測設備發(fā)現(xiàn)微循環(huán)是膿毒癥的使動因素。另有一些研究，包括：Scheuzger等[46]借助舌下微循環(huán)顯微影像監(jiān)測設備，提早預測到了一例小腸切除手術(shù)患者的病情惡化情況；Caixeta等[47]則將舌下微循環(huán)顯微影像監(jiān)測設備用于研究登革熱休克患者疾病發(fā)生發(fā)展情況與微循環(huán)灌流血管密度(PVD)之間的關(guān)系;Bouattour等[48]則發(fā)現(xiàn)手術(shù)后心臟前負荷依賴與微循環(huán)減少相關(guān)。再次，舌下微循環(huán)與臟器微循環(huán)都屬于微循環(huán)系統(tǒng)，通過與全身循環(huán)系統(tǒng)耦合，共同受到循環(huán)系統(tǒng)運行機制支配。有理由認為舌下微循環(huán)與臟器微循環(huán)存在關(guān)聯(lián)，現(xiàn)有的研究也支持這一判斷：如前所述的研究[9,43]顯示，大鼠舌下微循環(huán)的二氧化碳分壓與胃黏膜微循環(huán)的二氧化碳分壓直接相關(guān)，而膿毒癥豬的舌下微循環(huán)和腸系膜微循環(huán)血管比例出現(xiàn)下降。Ferrara等[49]的研究顯示，血液稀釋后的羊的腸系膜和舌下微循環(huán)均出現(xiàn)受損；高飛等[50]發(fā)現(xiàn)，新西蘭大白兔休克后小腸絨毛和舌下微循環(huán)的微血管血流指數(shù)MFI和TVD等微循環(huán)參數(shù)均出現(xiàn)下降; 而趙川等[51]發(fā)現(xiàn)，隨著體溫的下降，國產(chǎn)家豬大腦微循環(huán)和舌下微循環(huán)微血管血流指數(shù)(MFI)和灌注血管密度(PVD)均出現(xiàn)下降。這都表明，舌下微循環(huán)在一定程度上反映臟器循環(huán)的情況。盡管存在一些不同的聲音[44]，這可能與調(diào)節(jié)舌下微循環(huán)和臟器微循環(huán)的機制發(fā)生變化有關(guān)，舌下微循環(huán)與臟器微循環(huán)相關(guān)程度隨著病程的推移會出現(xiàn)變化；同時，舌下微循環(huán)通過全身體循環(huán)耦合至臟器微循環(huán)的模型需要對循環(huán)系統(tǒng)形態(tài)、工作機理有深入研究、仿真，但借助人工智能、大數(shù)據(jù)等技術(shù)舌下微循環(huán)顯微影像監(jiān)測技術(shù)不失為一種預測臟器微循環(huán)情況的潛在手段，為臨床醫(yī)生了解、掌握患者臟器功能情況提供了工具。最后，微循環(huán)是人體物質(zhì)交換和新陳代謝的場所，與諸多疾病和生理變化相關(guān), 如肝硬化[29]、低溫[30]、體液失衡[31]等。舌下微循環(huán)顯微影像監(jiān)測是通過微循環(huán)研究疾病及其機制的適宜手段。

6 展望和結(jié)語

近年，舌下微循環(huán)顯微影像監(jiān)測設備及應用實現(xiàn)了快速發(fā)展，但技術(shù)問題也限制了它的應用效果。主要問題表現(xiàn)為：尚缺少更加便利靈活的檢測技術(shù)；尚不能充分反映組織血流動態(tài)以及血氧變化；尚不能有效反映局部微循環(huán)與重大疾病臨床特征的相互關(guān)系。上述問題的解決需要進一步研究。隨著技術(shù)進步，可以發(fā)展出貼片式的舌下微循環(huán)顯微影像監(jiān)測裝置，以及可以將激光散斑影像技術(shù)、激光多普勒血流成像技術(shù)、血氧影像技術(shù)用于舌下微循環(huán)檢測，有效反映微循環(huán)血流和血氧動態(tài)，更有效和精準反映微循環(huán)灌注的動態(tài)特征。隨著人工智能和大數(shù)據(jù)技術(shù)的發(fā)展，可以將局部微循環(huán)指標與臨床特征指標進行相關(guān)性統(tǒng)計，由此獲得將微循環(huán)障礙檢測用于重大疾病診療的可靠應用?？梢?，舌下微循環(huán)監(jiān)測目前仍舊處于發(fā)展階段，未來越來越多的臨床應用和新技術(shù)參與，必將使其成為不可或缺的臨床診療手段。