（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部授粉昆蟲生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100093）

1 引言

頭部下唇腺分泌物（cephalic labial gland secretions，CLGS）是雄性蜂頭部下唇腺分泌的標(biāo)記性信息素，具有物種特異性，其在蜂王和雄性蜂交尾前的相互識(shí)別過程中起重要作用[1]。在自然狀態(tài)下，熊蜂交尾前的化學(xué)通訊行為主要包括巡邏式飛行和氣味標(biāo)記兩種方式[2]。雄性蜂通過頭部分泌性外激素并將其標(biāo)記在沿途的花葉、樹枝和草莖上，引誘同種雄性蜂和新蜂王產(chǎn)生一定的行為或生理效應(yīng)，其作用是協(xié)助完成交尾或促進(jìn)種間生殖隔離[3]。因此，開展熊蜂的下唇腺分泌物揮發(fā)性成分分析，有助于了解熊蜂的化學(xué)通訊。

熊蜂的雄性蜂下唇腺分泌物成分主要為脂肪族化合物[4]。不同熊蜂種之間，親緣關(guān)系較近的雄性蜂下唇腺分泌物成分比較接近。近年來已有文獻(xiàn)報(bào)道了我國(guó)9 種本土熊蜂雄性蜂下唇腺分泌物成分，分別為：親熊蜂Bombus consobrinus、韓熊蜂B.coreanus、火紅熊蜂B.pyrosoma、紅光熊蜂B.ignitus、烏蘇里熊蜂B.ussurensis、新疆地熊蜂B.terrestrisXJ、短頭熊蜂B.breviceps、紅尾熊蜂B.haemorrhoidalis和蘭州熊蜂B.lantschouensis[5]。Bertsch 等分別對(duì)來自中國(guó)和歐洲的明亮熊蜂B.lucorum雄性蜂下唇腺分泌物揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析[6]。

長(zhǎng)翅熊蜂B.longipennis主要分布在我國(guó)青藏高原及周邊地區(qū)，對(duì)高海拔地區(qū)的高寒、低氧等極端環(huán)境條件具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，對(duì)維持該地區(qū)植物的傳粉具有重要作用[7-9]。同時(shí)，長(zhǎng)翅熊蜂也是獨(dú)具代表性的熊蜂復(fù)合種之一，在形態(tài)上和地熊蜂、明亮熊蜂、隱熊蜂等幾種熊蜂極為相似[10]。本研究利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）和氣相色譜（GC）技術(shù)對(duì)我國(guó)長(zhǎng)翅熊蜂雄性蜂下唇腺分泌物進(jìn)行定性和定量分析，明確其揮發(fā)性成分的種類和含量。該研究為進(jìn)一步探究長(zhǎng)翅熊蜂交尾行為的信息交流提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)，也作為一種輔助手段為熊蜂物種鑒定提供依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料

長(zhǎng)翅熊蜂雄性蜂新鮮樣本采集于2019年中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所熊蜂飼養(yǎng)室，在不同蜂群內(nèi)隨機(jī)采集雄性蜂共6 頭，采集后迅速凍于液氮。用干凈的鑷子切取頭部置于400μl 正己烷浸泡，室溫萃取24h，保存于-20℃冰箱備用。測(cè)定前，將樣品從冰箱取出置于冰上，移取100μl 萃取液用于氣相色譜測(cè)定。

2.2 方法

2.2.1 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

使用Agilent 7200 氣相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（Q-TOF GC/MS）對(duì)分泌物中的揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析。為避免主峰強(qiáng)度過高出現(xiàn)飽和現(xiàn)象，進(jìn)樣前將樣品溶液稀釋100 倍后，再進(jìn)樣分析。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析條件：色譜柱Agilent HP-5MS（30m×0.25mm×0.25μm）；進(jìn)樣量1μl；分流比：5∶1 或80∶1；EI離子源；電離能量：70eV；質(zhì)譜掃描方式：全掃描；傳輸線溫度：280℃；升溫程序：初始溫度70℃，保持1min；以15℃/min 速率升至160℃，保持3min；以10℃/min速率升至190℃；以3℃/min 速率升至225℃，保持5min；以15℃/min 速率升至300℃，保持3min。

2.2.2 氣相色譜分析

使用Agilent 7890A 氣相色譜儀（GC-FID）對(duì)分泌物中的揮發(fā)性成分進(jìn)行定量分析。氣相色譜分析條件：色譜柱Agilent DB-5MS（30m×0.25mm×0.25μm）；載氣：高純氮?dú)猓?9.999%）；氣體流速1ml/min；進(jìn)樣量1μl；不分流模式；升溫程序：初始溫度70℃，保持1min；以15℃/min 速率升至170℃，保持2min；以10℃/min 速率升至190℃；以3℃/min速率升至225℃，保持5min；以15℃/min 速率升至300℃，保持1min。

2.3 數(shù)據(jù)分析

使用Agilent MassHunter Unknowns Analysis 軟件對(duì)雄性蜂頭部下唇腺分泌物揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析，通過解卷積方式自動(dòng)檢索譜庫(kù)（National Institute of Standards and Technology，NIST 14）識(shí)別未知化合物，參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)。同時(shí)，為進(jìn)一步確?；衔镨b定的準(zhǔn)確性，使用Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.07.00 軟件，手動(dòng)逐一選擇色譜峰，提取質(zhì)譜圖，扣除本底后檢索譜庫(kù)鑒定未知化合物。在兩種方式的定性結(jié)果存在分歧時(shí)，優(yōu)先選擇后者。

揮發(fā)性成分的相對(duì)含量是由各化合物峰面積與總峰面積的比值計(jì)算得出，同時(shí)，對(duì)雄性蜂下唇腺分泌物揮發(fā)性成分氣相數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化，剔除相對(duì)含量小于0.1%的色譜峰。

3 結(jié)果

利用GC-MS 對(duì)長(zhǎng)翅熊蜂雄性蜂頭部下唇腺分泌物揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒定（圖1），結(jié)果表明，共有28種揮發(fā)性成分，包括10 種醇類、8 種酯類、3 種烯烴類、3 種烷烴類、1 種醛類和3 種未知化合物。其中醇類化合物含量最高，平均相對(duì)含量為59.06%，其次為酯類化合物，含量為17.97%（表1）。

圖1 長(zhǎng)翅熊蜂下唇腺分泌物揮發(fā)性成分氣相色譜圖

利用GC 對(duì)長(zhǎng)翅熊蜂雄性蜂頭部下唇腺分泌物揮發(fā)性成分進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明，3,7,11-三甲基-6,10-十二碳二烯-1-醇含量最高，是長(zhǎng)翅熊蜂雄性蜂下唇腺分泌物中的主要成分，平均相對(duì)含量為38.45±3.68%。除此之外，9,12,15-十八碳三烯-1-醇、9,12-十四碳二烯-1-醇乙酸酯和二十八烷這3種揮發(fā)性成分的含量也較高，平均相對(duì)含量分別為11.36±0.61%、9.88±1.40%和13.31±2.19%。二十碳烯醇（3.94±0.34%）、13-二十二烯醇（1.79±0.18%）、月桂酸乙酯（2.74±1.58%）、十二酸-1-甲基乙基酯（2.71±0.64%）、十四醛（1.80±0.20%）、正二十一烷（3.29±0.28%）和三十一烷（1.50±0.47%）含量次之，平均相對(duì)含量在1%～5%。共有17 種揮發(fā)性成分含量較少，平均相對(duì)含量在0.3%～1%，分別為：1-二十醇、二十碳烯醇、藍(lán)桉醇、正十六烷醇、5,8,11-十七碳三烯-1-醇、二十七烷醇、乙酸法呢醇酯、十七碳三烯酸甲酯、油酸乙酯、十八酸乙酯、碳酸異丁酯、1,7-十六烷二烯、十七碳-1,8,11-三烯、十七碳-1,8,11,14-四烯和3 種未知組分（表1）。

表1 長(zhǎng)翅熊蜂頭部下唇腺分泌物揮發(fā)性成分種類及相對(duì)含量

4 討論

熊蜂雄性蜂性信息素是由雄性蜂頭部下唇腺分泌的一種揮發(fā)性成分，作為一種化學(xué)通訊信號(hào)，在蜂王和雄性蜂交尾前識(shí)別過程中發(fā)揮著重要作用。本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和氣相色譜技術(shù)對(duì)廣泛分布于我國(guó)青藏高原地區(qū)的長(zhǎng)翅熊蜂雄性蜂下唇腺分泌物中的揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒定及相對(duì)含量的測(cè)定，明確其化合物種類和含量。該研究結(jié)果為深入探究熊蜂交尾前化學(xué)通訊機(jī)理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為熊蜂鑒定提供依據(jù)。

2011年，Bertsch 等分別對(duì)來自中國(guó)和歐洲的明亮熊蜂雄性蜂下唇腺分泌物成分進(jìn)行了分析，基于分子數(shù)據(jù)和化學(xué)鑒定結(jié)果認(rèn)為中國(guó)明亮熊蜂應(yīng)為長(zhǎng)翅熊蜂[6]。此外，該研究結(jié)果表明，長(zhǎng)翅熊蜂下唇腺分泌物的主要成分為月桂酸乙酯，相對(duì)含量為31%，其次為3,7,11-三甲基-6,10-十二碳二烯-1-醇，相對(duì)含量為24%，以及油酸乙酯，相對(duì)含量為15%。在本研究中，6 頭雄性蜂下唇腺分泌物也都檢測(cè)到月桂酸乙酯，但其相對(duì)含量范圍在1.02%～5.78%，并不能作為分泌物中的主要成分，與前人結(jié)果存在較大差異。另外，在Bertsch 等人的研究中，3,7,11-三甲基-6,10-十二碳二烯-1-醇（24%）是含量?jī)H次于月桂酸乙酯的揮發(fā)性成分，但我們的研究結(jié)果表明3,7,11-三甲基-6,10-十二碳二烯-1-醇是長(zhǎng)翅熊蜂雄性蜂下唇腺分泌物中的主要成分，其相對(duì)含量范圍高達(dá)32.22%～43.54%，造成這些差異的原因可能是由于雄性蜂的年齡差異。研究表明，不同年齡段的雄性蜂，下唇腺分泌物中主要成分的含量會(huì)發(fā)生變化，但種內(nèi)差異仍低于種間差異[11]。熊蜂雄性蜂下唇腺分泌物的成分和含量與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的數(shù)量有關(guān)，在年輕的個(gè)體中（小于1日齡的雄性蜂），粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是主要的分泌器官；對(duì)于1日齡雄性蜂，高爾基體是主要的分泌器官；大于2日齡的雄性蜂，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是主要的分泌器官[12]。

雄性蜂下唇腺分泌物揮發(fā)性成分作為蜂王和雄性蜂交尾前的識(shí)別信號(hào)，其種類和含量在一定范圍內(nèi)存在較大的可變性。由于年齡、地理環(huán)境、采集時(shí)間、樣本處理和儀器設(shè)備的不同，不同實(shí)驗(yàn)室的鑒定結(jié)果可能會(huì)存在一定差異。但即便是同分異構(gòu)體之間的微小差異也可能在熊蜂交尾前的化學(xué)通訊中起關(guān)鍵作用，需要更多的樣本和研究進(jìn)一步驗(yàn)證[13]。本研究采用氣相色譜-高分辨四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀，通過精確質(zhì)量數(shù)檢索譜庫(kù)鑒定化合物，與前人研究結(jié)果進(jìn)行比較驗(yàn)證，以期明確下唇腺分泌物中穩(wěn)定存在的揮發(fā)性成分。研究結(jié)果表明，在6 頭長(zhǎng)翅熊蜂雄性蜂頭部下唇腺分泌物中含量比較高（平均相對(duì)含量＞1%）的成分共11 種，與Bertsch 等人研究中相對(duì)含量同樣大于1%的10 種物質(zhì)成分進(jìn)行比較，共發(fā)現(xiàn)4種揮發(fā)性成分的鑒定結(jié)果完全一致，分別為：3,7,11-三甲基-6,10-十二碳二烯-1-醇、9,12,15-十八碳三烯-1-醇、月桂酸乙酯和十四醛[6]。我們認(rèn)為，這4種揮發(fā)性成分穩(wěn)定存在于長(zhǎng)翅熊蜂下唇腺分泌物中，在長(zhǎng)翅熊蜂蜂王和雄性蜂交尾前識(shí)別過程中可能發(fā)揮重要作用，其化學(xué)通訊機(jī)理有待進(jìn)一步探究。

本研究報(bào)道了我國(guó)長(zhǎng)翅熊蜂雄性蜂下唇腺分泌物的28 種揮發(fā)性成分，并明確其相對(duì)含量。熊蜂下唇腺分泌物主要揮發(fā)性成分在其交尾前相互識(shí)別過程中起著重要作用，故本研究對(duì)于長(zhǎng)翅熊蜂主要揮發(fā)性成分在熊蜂交尾行為的化學(xué)通訊功能還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，雄性蜂下唇腺分泌物中相對(duì)含量較低的揮發(fā)性成分也可能是熊蜂雄性蜂和蜂王交尾前化學(xué)通訊的關(guān)鍵物質(zhì)，因此，探究這些微量成分在熊蜂化學(xué)通訊中扮演的角色也是今后重要的研究方向。