史艷彬 張婉妮 邵小光

大連市婦女兒童醫(yī)療中心生殖與遺傳醫(yī)學(xué)中心，遼寧大連 116000

盡管輔助生殖技術(shù)取得了重大進展，但體外受精-胚胎移植（in vitro fertility-embryo transfer，IVF-ET）面臨的主要挑戰(zhàn)仍然是選擇最佳的單胚移植技術(shù)[1]。增強胚胎選擇過程將使體外受精成功率最大化[2]。大量文獻(xiàn)報道，在侵入性技術(shù)PGT-A 局限性的背景下，Time-lapse 技術(shù)作為以選擇具有最高發(fā)展?jié)摿Φ呐咛槟繕?biāo)來優(yōu)化非侵入性技術(shù)方面展示了極大的優(yōu)勢[3-5]。本研究通過回顧性分析胚胎發(fā)育動力學(xué)指標(biāo)與妊娠結(jié)局的關(guān)系，建立胚胎動力學(xué)指標(biāo)預(yù)測囊胚移植后妊娠結(jié)局的模型，為臨床工作提供理論基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年7月～2019年7月于大連市婦女兒童醫(yī)療中心生殖與遺傳醫(yī)學(xué)中心使用Time-lapse 囊胚培養(yǎng)并行囊胚移植的704個周期的資料，排除合并影響妊娠結(jié)局要素和移植兩枚囊胚僅單胎妊娠的453個周期，共納入251個周期的371個胚胎。根據(jù)妊娠結(jié)局，將其分為未妊娠組（A組，N=115個周期，n=169個胚胎）和臨床妊娠組（B組，N=136個周期，n=202個胚胎）。本研究經(jīng)過大連市婦女兒童醫(yī)療中心醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≤40歲；②不孕原因為女方輸卵管因素、排卵障礙和男性精液因素；③夫妻未見染色體異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①補救顯微受精；②移植日子宮內(nèi)膜＜7 mm；③移植2 枚囊胚單胎妊娠；④宮腔因素（如息肉、粘連或黏膜下肌瘤）；⑤患有肥胖、生殖器畸形、高泌乳素血癥、子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢早衰、免疫性疾??；⑥患有高血壓、糖尿病、腎病等內(nèi)科合并癥者。

1.2 方法

控制性超促排卵按大連市婦女兒童醫(yī)療中心常規(guī)進行（長方案或拮抗劑方案）。行體外受精-短時受精未補救患者的受精卵置于37℃、6% CO2、5% O2的Time-lapse 培養(yǎng)箱中（ESCO，Miri-TL），用一步培養(yǎng)液（GlobleRtotalRLP，美國）進行全程培養(yǎng)；分別于取卵后第5、6 天觀察囊胚并評價（評價標(biāo)準(zhǔn)采取Gardner評分系統(tǒng)）。依據(jù)形態(tài)學(xué)指標(biāo)選擇三級或四級囊胚移植（CC 囊胚不用于移植）。

新鮮周期或凍融周期（HRT 方案）囊胚移植，移植時內(nèi)膜厚度≥7 mm。囊胚移植12 d后檢測血人絨毛膜促性腺激素（β-HCG）判斷妊娠。如妊娠，胚胎移植后28～35 d B超檢查，確定臨床妊娠及妊娠胎數(shù)。妊娠后繼續(xù)使用雌孕激素維持妊娠，孕8～9 周可開始逐漸減量，孕12～14 周停藥。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察胚胎發(fā)育動力學(xué)指標(biāo)對妊娠結(jié)局的影響，探索影響囊胚移植周期臨床妊娠結(jié)局的胚胎發(fā)育動力學(xué)指標(biāo)，建立臨床妊娠結(jié)局預(yù)測模型，并對其進行驗證。

以雌雄原核消失的時間點為t0；t2、t3、t4、t5、t8：合子分裂為2細(xì)胞、3細(xì)胞、4細(xì)胞、5細(xì)胞、8 細(xì)胞的時間點；cc2：t3～t2；cc3：t5～t3；s2：t4～t3；s3：t8～t5；tM：桑椹胚形成的時間；tSB：囊胚開始形成的時間點；tB：囊胚完全形成的時間點。由一名胚胎師評估胚胎發(fā)育動力學(xué)指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。二元Logistic 回歸分析把對妊娠結(jié)局有顯著影響的胚胎動力學(xué)指標(biāo)作為自變量，妊娠情況作為因變量，使用逐步回歸法統(tǒng)計，以P≤0.05 為選入變量的標(biāo)準(zhǔn)，P≥0.10 為剔除變量的標(biāo)準(zhǔn)。采用Enter 法，建立體外受精囊胚移植臨床妊娠率預(yù)測方程式，并通過接受者操作特征（ROC）曲線檢驗方程的有效性。

2 結(jié)果

2.1 兩組胚胎發(fā)育動力學(xué)指標(biāo)的比較

兩組的t2、t3、t4、cc2、cc3、s2 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；兩組的t5、t8、s3、tM、tSB、tB 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 兩組胚胎發(fā)育動力學(xué)指標(biāo)的比較（h，）

表1 兩組胚胎發(fā)育動力學(xué)指標(biāo)的比較（h，）

組別 周期數(shù) t2 t3 t4 t5 t8 cc2 A組B組115 136 t值P值2.76±1.36 2.15±0.39 0.181 0.158 14.43±2.98 12.61±0.67 0.174 0.238 15.70±4.30 13.05±0.65 0.197 0.153 28.61±4.32 23.86±1.46 3.076 0.044 33.80±5.33 27.89±5.01 4.213 0.027 11.89±1.95 10.45±0.94 0.179 0.224組別 周期數(shù) cc3 s2 s3 tM tSB tB A組B組t值P值115 136 14.37±1.93 11.58±1.38 2.167 0.080 1.25±2.96 0.39±0.24 0.119 0.500 5.05±3.29 1.41±0.55 5.935 0.010 78.84±5.32 66.48±6.56 10.179 0.000 87.48±5.99 74.16±5.82 6.373 0.000 105.21±5.50 86.39±6.16 8.154 0.000

2.2 建立臨床妊娠結(jié)局相關(guān)動力學(xué)指標(biāo)影響因素的預(yù)測模型

以妊娠結(jié)局為因變量（未妊娠=1，持續(xù)妊娠=2），以兩組比較后差異有統(tǒng)計學(xué)意義的胚胎發(fā)育動力學(xué)指標(biāo)（t5、t8、s3、tM、tSB、tB）為自變量，建立妊娠結(jié)局相關(guān)胚胎發(fā)育動力學(xué)指標(biāo)的預(yù)測模型，根據(jù)表2中數(shù)據(jù)可得體外受精囊胚移植后妊娠結(jié)局相關(guān)胚胎發(fā)育動力學(xué)指標(biāo)的預(yù)測模型：P=1/（1+y），y=-3.803+0.007×t5-0.004×t8-0.042×s3+0.023×tM+0.005×tSB+0.043×tB。

表2 臨床妊娠結(jié)局相關(guān)動力學(xué)指標(biāo)影響因素的回歸模型

2.3 預(yù)測模型的敏感度和特異性

根據(jù)所得臨床妊娠結(jié)局回歸模型，計算臨床妊娠率預(yù)測概率，并與實際妊娠結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)繪制ROC曲線（圖1），結(jié)果顯示，曲線下面積為0.702 （95%CI：0.679～0.791，P=0.047），對應(yīng)的敏感度為84.8%，特異性為88.9%，總正確率為86.70%。提示妊娠結(jié)局相關(guān)胚胎發(fā)育動力學(xué)指標(biāo)的預(yù)測模型——y=-3.803+0.007×t5-0.004×t8-0.042×s3+0.023×tM+0.005×tSB+0.043×tB 有臨床應(yīng)用價值。

圖1 預(yù)測模型的敏感度和特異性

3 討論

人類胚胎學(xué)中的延時成像技術(shù)顯示了胚胎獨特的發(fā)育特征，通過胚胎發(fā)育事件的確切時間能夠獲得細(xì)胞周期長度和裂解模式[6]。已有文獻(xiàn)證明，胚胎發(fā)育的速度與著床率有關(guān)[7]。移植特定發(fā)育速度的胚胎，最終患者的妊娠結(jié)局不盡相同[8-9]。這可能是由于胚胎的發(fā)育時間影響細(xì)胞周期的合成期（S期）持續(xù)時間；此外，染色體異常可能會延遲DNA 復(fù)制[10]，因此改變了細(xì)胞周期和分裂的長度。對預(yù)測胚胎發(fā)育和體外受精治療結(jié)局預(yù)后因素的研究引起了學(xué)術(shù)界廣泛的關(guān)注。目前，已有基于形態(tài)動力學(xué)參數(shù)的多種胚胎選擇算法和妊娠結(jié)局的預(yù)測算法，但大多數(shù)關(guān)于動力學(xué)發(fā)育的人類胚胎研究都是基于在不同實驗條件下產(chǎn)生的少量樣本胚胎的生存能力與一系列嚴(yán)格調(diào)控的細(xì)胞事件有關(guān)，使用來自單個中心的數(shù)據(jù)很難被其他中心利用。此外，對于體外受精周期，卵子成熟度的不同會影響精子入卵的時間有差異，進而影響原核出現(xiàn)的時間。為了克服這些局限，本研究使用原核消失的時間點作為t0，利用胚胎發(fā)育的相對速度作為因變量，基于數(shù)據(jù)挖掘的模型具有較高的預(yù)測能力，可以有效地用于區(qū)分植入潛能增加的胚胎。

本研究的Logistic 回歸分析顯示，t5（OR=1.007，95%CI：1.001～1.013，P=0.000）、t8（OR=0.996，95%CI：0.941～1.054，P=0.012）、s3（OR=0.959，95%CI：0.821～1.120，P=0.000）是影響體外受精囊胚移植后妊娠結(jié)局的重要影響因素。這與Meseguer 等[11]（提出5 細(xì)胞期分裂及后期事件的發(fā)生時間是著床潛能的良好指標(biāo)）以及Cruz等[12]（通過胚胎鏡觀察胚胎，提出5 細(xì)胞形成的時間和桑葚胚形成的時間是預(yù)測胚胎發(fā)展?jié)撃芨煽康闹笜?biāo)）的結(jié)論相一致。這些現(xiàn)象可能與人的胚胎從4～8 細(xì)胞階段是人胚胎基因組激活的關(guān)鍵時期有關(guān)[13]。本研究中的tM（OR=1.023，95%CI：1.005～1.041，P=0.009）、tSB（OR=1.005，95%CI：1.001～1.009，P=0.000）、tB（OR=1.044，95%CI：1.002～1.088，P=0.000）也是妊娠結(jié)局的重要影響因素。最近的延時顯微鏡觀察表明，致密化可能是人類胚胎活力的一個重要檢查點，通過其，胚胎可以感覺到并消除染色體異常的卵裂球[14]。2013年，Campbell 等[15]提出tSB和tB是具有顯著預(yù)測妊娠結(jié)局能力的指標(biāo)。

綜上所述，筆者利用著床前胚胎發(fā)育動力學(xué)指標(biāo)與妊娠結(jié)局的關(guān)系，提出一個回歸模型以通過胚胎發(fā)育動力學(xué)指標(biāo)預(yù)測囊胚移植后是否有更高的妊娠可能：P=1/（1+y），y=-3.803+0.007×t5-0.004×t8-0.042×s3+0.023×tM+0.005×tSB+0.043×tB，并檢驗其有效性。從心理上增加醫(yī)患雙方信心，減少焦慮情緒。然而，本模型的回顧設(shè)計和模型本身所固有的偏差將使其臨床應(yīng)用有待進一步開發(fā)和挖掘。