俞 楊，姚 嘉，楊時平，李冠喬

ZEB1、ZEB2是E-cadherin的候選阻遏物。ZEB1、ZEB2蛋白參與包括骨骼組織、平滑肌組織、神經(jīng)組織等多種組織的分化[1-2]。ZEB1、ZEB2在多種腫瘤中異常表達，包括胰腺癌[3]、肺癌[4]、肝癌[5]、結(jié)腸癌[6]和乳腺癌[7]。近年研究顯示，miR-32-5p參與調(diào)控胰腺癌、前列腺癌、肝細胞癌等腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲等惡性生物學行為，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，且在胃瘤、骨肉瘤和結(jié)直腸癌等不同腫瘤中起抑癌或致癌作用[8-10]。目前，miR-32-5p在乳腺癌中的表達尚不明確。本實驗旨在探討miR-32-5p及ZEB1、ZEB2在乳腺癌MCF-7細胞系中的作用，并分析兩者間的關聯(lián)性。

1 材料與方法

1.1 材料本實驗入組的樣本選自2019年1月～2019年6月就診于海南省人民醫(yī)院的女性乳腺癌患者，所有患者均經(jīng)病理學確診；包括癌旁組織30例和乳腺癌組織30例。本實驗經(jīng)我院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 細胞培養(yǎng)MCF-10A、MDA-MB-231和MCF-7細胞購于北京國家實驗細胞資源共享平臺。MCF-10A給予100 ng/mL霍亂毒素及1%P/S培養(yǎng)，MDA-MB-231用含有10%胎牛血清(浙江天杭生物公司)的L-15培養(yǎng)基(Gibco，美國)進行培養(yǎng)。MCF-7用含有10%胎牛血清(浙江天杭生物公司)的MEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)進行培養(yǎng)。

1.3 qRT-PCR檢測通過qRT-PCR法檢測癌旁組織和乳腺癌組織中ZEB1、ZEB2和miR-32-5p的表達水平；檢測乳腺癌細胞系MCF-10A、MDA-MB-231和MCF-7中ZEB1和ZEB2的表達水平，以及MCF-7細胞中ZEB1和ZEB2敲除效率。利用Trizonl(上海生工公司)提取組織或細胞中的RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京天根生化科技公司)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，熒光染料法(SYB Green，羅氏，美國)進行實時定量PCR檢測，QuantStudio 3儀器(Applied Biosystem，美國)檢測熒光信號。miR-32-5p、U6、ZEB1、ZEB2和GAPDH引物由上海生工公司合成。miR-32-5p表達以U6為內(nèi)參，ZEB1和ZEB2表達以GAPDH為內(nèi)參。

1.4 Western blot檢測取處于對數(shù)生長期的細胞或組織(癌旁和癌)用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液進行裂解，12 000 r離心20 min，上清即為蛋白。BCA試劑盒(北京普利萊基因公司)進行蛋白濃度的定量，加入5×Loarding buffer進行蛋白的變性。取等量的蛋白用SDS-PAGE凝膠進行電泳，電泳完成后轉(zhuǎn)移到NC膜(密理博中國公司)上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗孵育過夜(ZEB1、ZEB2、E-cadherin、vimentin和GAPDH抗體購于美國Abcam公司)，TBS-T清洗3次，每次10 min，用HRP偶聯(lián)的二抗(北京中杉金橋公司)室溫孵育1 h，TBS-T清洗3次，每次10 min。ECL進行避光顯影，化學發(fā)光成像儀采集圖像(Bio-Rad，美國)。

1.5 免疫組化用4%多聚甲醛固定組織，于20%蔗糖中4 ℃過夜。制作蠟塊，切片，貼片。TBS-T清洗3次，0.3%過氧化氫-甲醇作用30 min，TBS-T清洗3次。0.3%Triton X100作用30 min，TBS-T清洗3次。加入用血清稀釋液稀釋的一抗4 ℃孵育過夜，TBS-T清洗3次。TBS-T稀釋的二抗室溫孵育2 h，TBS-T清洗3次。加入顯色液，進行免疫組化顯色，梯度乙醇脫水后，封固，拍照。

1.6 免疫熒光檢測MDA-MB-231和MCF-7細胞中ZEB1和ZEB2的表達水平，將細胞消化吹散，按5×105個/孔接種于6孔板中，24 h后取出已爬好細胞的玻片，PBS清洗3次。4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗3次。0.5%Triton X-100室溫孵育20 min，PBS清洗3次。正常山羊血清室溫封閉30 min，PBS清洗3次。加足夠量稀釋好的一抗，濕盒中4 ℃孵育過夜。PBS清洗3次，滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中室溫孵育1 h。Hoechst避光孵育5 min，PBS清洗3次。用含抗熒光淬滅劑的封片液封固，熒光顯微鏡(奧林巴斯)下觀察、采集圖像。

1.7 細胞凋亡染色檢測MCF-7細胞中敲減ZEB1和ZEB2，以及加入miR-32-5p抑制劑后的細胞凋亡情況。按照試劑盒說明書的步驟進行染色(北京索萊寶公司)，最后熒光顯微鏡(奧林巴斯)下觀察、采集圖像。

1.8 克隆形成實驗檢測MCF-7細胞中敲減ZEB1和ZEB2后細胞克隆形成能力。將細胞消化吹散，按照每孔500個細胞種到6孔板中，每個做3個孔。5%CO2、37 ℃培養(yǎng)2～3周后，棄上清，PBS小心清洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，Giemsa染色液染15 min，流水緩慢洗去染色液。照相機拍照并計數(shù)。

1.9 劃痕實驗檢測MCF-7細胞敲減ZEB1和ZEB2后的細胞遷移能力。先用Marker筆在6孔板背后用直尺劃橫線。在每孔中加入5×106個細胞，過夜鋪滿。第2天用槍頭沿著直尺，盡量垂直于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜(不同孔之間使用同一槍頭)，PBS清洗3次，加入無血清培養(yǎng)基。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后取出拍照。Image J軟件計算細胞間距離的均值。

1.10 細胞侵襲和遷移檢測檢測MCF-7細胞敲減ZEB1和ZEB2，以及加入miR-32-5p抑制劑后細胞侵襲和遷移能力的變化。在遷移小室(密理博中國公司)鋪上30 μg基質(zhì)膠(BD，美國)，37 ℃ 30 min形成重構(gòu)的基質(zhì)膜。上小室中加入200 μL含1×105個細胞的無血清培養(yǎng)基，下小室中加入600 μL含血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，檢測細胞的侵襲情況。4%多聚甲醛固定15 min，蘇木精染色15 min，然后用棉簽移除上小室中非遷移的細胞。顯微鏡(奧林巴斯，日本)下拍照，計數(shù)。遷移步驟和侵襲類似，只是遷移小室中未加基質(zhì)膠。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織中ZEB1、ZEB2與miR-32-5p表達的關系癌旁組織和乳腺癌組織中ZEB1和ZEB2蛋白表達相比，乳腺癌組織中ZEB1和ZEB2蛋白表達均高于癌旁組織(圖1A)。乳腺癌組織中ZEB1 mRNA(t=11.72，P<0.001)和ZEB2 mRNA(t=16.6，P<0.001)表達水平均高于癌旁組織(圖1B)。乳腺癌組織中miR-32-5p表達水平高于癌旁組織(圖2)。經(jīng)Person相關性檢驗結(jié)果顯示，ZEB1表達與miR-32-5p表達呈正相關(R2=0.743 7，P<0.001)，ZEB2表達與miR-32-5p表達呈正相關(R2=0.679 5，P<0.001，圖3)。

圖1 A.癌旁組織和乳腺癌組織中ZEB1和ZEB2蛋白的表達；B.癌旁組織和乳腺癌組織中ZEB1和ZEB2 mRNA的表達：N.正常組織；T.癌組織；與癌旁組織相比，***P<0.001

圖2 癌旁組織和乳腺癌組織中miR-32-5p mRNA的表達

圖3 ZEB1、ZEB2表達與miR-32-5p表達的相關性分析：A.ZEB1與miR-32-5p；B.ZEB2與miR-32-5p

2.2 ZEB1、ZEB2在乳腺癌增殖和侵襲中的作用MCF-10A、MDA-MB-231和MCF-7細胞中ZEB1和ZEB2蛋白水平相比，MDA-MB-231和MCF-7細胞中ZEB1和ZEB2蛋白表達水平高于MCF-10A細胞(圖4)。Control組與si-ZEB1組ZEB1 mRNA表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(t=30.59，P<0.001)；Control組與si-ZEB2組ZEB2 mRNA表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(t=20.25，P<0.001，圖5)。與Control組比較，si-ZEB1組ZEB1蛋白表達降低；與Control組比較，si-ZEB2組ZEB2蛋白表達降低(圖6)。si-ZEB1組與Control組比較，si-ZEB1組細胞克隆形成能力減弱；si-ZEB2組與Control組相比，si-ZEB2組細胞克隆形成能力減弱(圖7)。si-ZEB1組與Control組比較，si-ZEB1組細胞遷移能力減弱；si-ZEB2組與Control組比較，si-ZEB2組細胞遷移能力減弱(圖8)。si-ZEB1組與Control組比較，si-ZEB1組細胞侵襲能力減弱；si-ZEB2組與Control組比較，si-ZEB2組細胞侵襲能力減弱(圖8)。si-ZEB1組與Control組比較，si-ZEB1組E-cadherin蛋白表達增加，vimentin蛋白表達降低；si-ZEB2組與Control組比較，si-ZEB2組E-cadherin蛋白表達增加，vimentin蛋白表達降低(圖9)。上述實驗結(jié)果表明，ZEB1、ZEB2通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)途徑影響乳腺癌的增殖和侵襲。

圖4 MCF-10A、MDA-MB-231和MCF-7細胞中ZEB1和ZEB2蛋白的表達

圖5 敲減ZEB1和ZEB2后，ZEB1和ZEB2 mRNA的表達：A.ZEB1 mRNA的表達；B.ZEB2 mRNA的表達；***P<0.001

圖7 敲減ZEB1和ZEB2后的克隆形成情況

2.3 miR-32-5p通過與ZEB1、ZEB2相互作用影響乳腺癌的增殖和侵襲雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灡砻?，NC組和miR-32-5p組比較，過表達miR-32-5p能夠抑制細胞中熒光素酶的活性，將預測的結(jié)合位點突變后，其抑制作用消失(圖10)。Control組和miR-32-5p inhibitor組中ZEB1和ZEB2蛋白表達對比，miR-32-5p inhibitor組ZEB1和ZEB2蛋白表達水平降低(圖11)。Control組、miR-32-5p inhibitor組、miR-32-5p inhibitor+ZEB1組和miR-32-5p inhibitor+ZEB2組細胞侵襲能力比較：與Control組相比，miR-32-5p inhibitor組細胞侵襲數(shù)目減少；與miR-32 inhibitor組相比，miR-32-5p inhibitor+ZEB1組和miR-32-5p inhibitor+ZEB2組細胞侵襲數(shù)目增加(圖12)。Control組、miR-32-5p inhibitor組、miR-32-5p inhibitor+ZEB1組和miR-32-5p inhibitor+ZEB2組細胞遷移能力比較：與Control組相比，miR-32-5p inhibitor組細胞遷移數(shù)目減少；與miR-32-5p inhibitor組相比，miR-32-5p inhibitor+ZEB1組和miR-32-5p inhibitor+ZEB2組細胞遷移數(shù)目增加(圖12)。Control組、miR-32-5p inhibitor組、miR-32-5p inhibitor+ZEB1組和miR-32-5p inhibitor+ZEB2組E-cadherin和vimentin蛋白表達比較：與Control組相比，miR-32-5p inhibitor組E-cadherin蛋白表達增加，vimentin蛋白表達降低；與miR-32-5p inhibitor組相比，miR-32-5p inhibitor+ZEB1組和miR-32-5p inhibitor+ZEB2組E-cadherin蛋白表達降低，vimentin蛋白表達升高(圖13)。

3 討論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，腫瘤的侵襲和遠處轉(zhuǎn)移高達90%以上，是乳腺癌患者死亡的主要原因，但乳腺癌的具體發(fā)病機制尚不明確。通過對乳腺癌的分子生物學研究表明，乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展是一個復雜的過程，是多基因和多因素相互作用的結(jié)果。在腫瘤活檢和體液中都發(fā)現(xiàn)了特定miRNA失調(diào)，研究表明，miRNA可以在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中起抑癌或癌基因的作用[11]，通過對miRNA的研究可能為乳腺癌的治療提供新的靶點。

EMT是上皮細胞失去特性并獲得間質(zhì)特性的轉(zhuǎn)分化過程。EMT的發(fā)生參與了高度移動和侵入癌細胞的生理過程[12]。ZEB1和ZEB2是EMT過程中的關鍵轉(zhuǎn)錄因子。研究表明，ZEB1和ZEB2誘導的EMT在癌癥發(fā)展中至關重要，ZEB1與乳腺癌的增殖、浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關[13]。ZEB1和ZEB2表達受多種信號通路和成分的調(diào)節(jié)，包括TGF-β、β-catenin、miRNA和其它因子。本實驗發(fā)現(xiàn)，ZEB1和ZEB2在乳腺癌中均高表達，抑制ZEB1和ZEB2表達會促進細胞凋亡，ZEB1和ZEB2通過調(diào)控E-cadherin和vimentin蛋白表達抑制細胞克隆的形成、遷移和侵襲。為更進一步探究上游調(diào)控的miRNA，本實驗選擇了miR-32-5p為分析對象。Gao等[14]研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌中miR-32-5p表達水平升高，可影響腫瘤的遠期轉(zhuǎn)移，其作用機制與PTEN信號通路有關。

圖8 敲減ZEB1和ZEB2后，乳腺癌細胞的遷移和侵襲情況

圖9 敲減ZEB1和ZEB2后，EMT相關蛋白E-cadherin和vimentin的表達

圖10 ZEB1、ZEB2與miR-32-5p的結(jié)合位點，雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證結(jié)合位點：A.ZEB1；B.ZEB2；***P<0.001

圖11 抑制miR-32-5p后，ZEB1和ZEB2蛋白的表達

圖13 抑制miR-32-5p后，E-cadherin和vimentin蛋白的表達

圖12 抑制miR-32-5p后細胞侵襲和遷移情況

敲出miR-32-5p基因可導致SPC-A1細胞的活力顯著下降，細胞周期停滯在G2/M期，并抑制遷移和侵襲[15]。衣蘭娟等[16]研究發(fā)現(xiàn)，與正常胃黏膜細胞相比，胃癌細胞中miR-32-5p表達顯著升高，且抑制miR-32-5p表達可抑制Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白表達，從而降低胃癌細胞的生物活性，提高其凋亡率。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織樣本和細胞系中miR-32-5p過表達，并且miR-32-5p表達與ZEB1和ZEB2表達呈正相關。首次闡明了miR-32-5p通過與ZEB1和ZEB2的3′UTR相互作用，調(diào)控乳腺癌的增殖、凋亡、遷移和侵襲。