湯志鴻，蔣豐智，黎小秀，段高羊，廖 瓊

東莞市婦幼保健院兒科,廣東 東莞 523000

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于兒童胃微生態(tài)研究甚少，幽門(mén)螺桿菌（HP）是胃內(nèi)第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌，全球超過(guò)一半的人口感染幽門(mén)螺桿菌［1］，中國(guó)兒童幽門(mén)螺桿菌感染率為12.8%［2］，幽門(mén)螺桿菌感染后兒童會(huì)出現(xiàn)非特異性癥狀，如嘔吐，惡心，體重減輕，嘔血和食欲下降。慢性幽門(mén)螺桿菌感染可引起生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、缺鐵性貧血、免疫性血小板減少癥［3］。幽門(mén)螺桿菌菌株、宿主、內(nèi)環(huán)境等多方面因素決定了疾病的發(fā)生發(fā)展。目前兒童人群中缺乏關(guān)于胃細(xì)菌群落的存在和組成的研究，本研究對(duì)東莞市婦幼保健院門(mén)診及住院部有消化道臨床癥狀而接受胃鏡檢查的患兒，鉗取胃黏膜標(biāo)本用于快速尿素酶試驗(yàn)、組織病理學(xué)檢查、DNA提取，分析HP陽(yáng)性組和HP陰性組兩組之間的社會(huì)人口資料學(xué)、體重指數(shù)、尿素呼氣試驗(yàn)、病理組織結(jié)果等臨床特征，通過(guò)16SrDNA檢測(cè)技術(shù)分析HP感染后兒童胃黏膜中的微生態(tài)菌群的變化，探索幽門(mén)螺桿菌感染對(duì)胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)組成的影響，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集東莞市婦幼保健院兒科門(mén)診及住院部有消化道臨床癥狀來(lái)就診的患兒，不同程度伴有腹痛、腹脹、惡心、嘔吐、噯氣及食欲不振等不適癥狀；年齡＜14周歲，既往未進(jìn)行過(guò)抗HP治療。完善13 C尿素呼氣試驗(yàn)、糞便HP抗原檢測(cè)，完善胃鏡檢查、鉗取胃黏膜標(biāo)本用于快速尿素酶試驗(yàn)、組織病理學(xué)檢查、DNA提取。按幽門(mén)螺桿菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)：符合下述四項(xiàng)之一者可判斷為HP現(xiàn)癥感染［4］：（1）組織病理學(xué)檢查和快速尿素酶試驗(yàn)均陽(yáng)性；（2）尿素呼氣試驗(yàn)或糞便HP抗原檢測(cè)陽(yáng)性，并且組織病理學(xué)檢查或快速尿素酶試驗(yàn)結(jié)果其中一項(xiàng)陽(yáng)性；（3）有消化性潰瘍出血，病理組織學(xué)或尿素呼氣試驗(yàn)中任一項(xiàng)陽(yáng)性。將患者分為HP陰性組14例和HP陽(yáng)性組26例。

1.2 方法

（1）胃黏膜標(biāo)本采集，胃鏡下分別鉗取受試者胃竇黏膜活檢樣本，大小約1 mm×2 mm。取材后標(biāo)本置于無(wú)菌凍存管中并加入500 uL生理鹽水，立即于-80℃保存。（2）基因組DNA提取和16S rDNA擴(kuò)增測(cè)序：將胃黏膜組織連同生理鹽水轉(zhuǎn)移至組織研磨器進(jìn)行組織勻漿，使用試劑盒QIAamp@DNA Mini Kit(QIAGEN，Germany)提取樣本總DNA，具體操作步驟見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。設(shè)計(jì)引物，對(duì)16S rDNA V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列為：341F(CCTAYGGGRBGCASCAG)和806R(GGACTACNNGGG

—TATCTAAT)。PCR純化、純化PCR產(chǎn)物，純化產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，應(yīng)用Illumina HiSeq 2000測(cè)序平臺(tái)，分析測(cè)序結(jié)果，分析在門(mén)、屬分類水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSSl3.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理分析，χ2檢驗(yàn)比較HP陽(yáng)性組和HP陰性組體重指數(shù)、病理組織結(jié)果的差異。Mann-Whitney U檢驗(yàn)比較HP陽(yáng)性組和HP陰性組微生物群落的豐度和多樣性差異。統(tǒng)計(jì)各樣本在門(mén)、屬分類群的分布情況，并用柱狀圖進(jìn)行展示。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HP陽(yáng)性組和HP陰性組臨床特征分析

兩組之間的社會(huì)人口資料學(xué)、體重指數(shù)、尿素呼氣試驗(yàn)、病理組織結(jié)果等臨床特征分析。HP陽(yáng)性組26人，男性14例，女性12例，平均年齡（7.66±1.69）歲。陰性組14人，男性8例，女性6例，平均年齡（7.45±1.63）歲。對(duì)兩組患者的年齡、性別資料進(jìn)行比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。HP陽(yáng)性組體重過(guò)低（BMI＜18.5 kg/m2）的患兒比例為69.2%，非體重過(guò)低（BMI＞18.5 kg/m2）的患兒比例為30.3%（P=0.04），幽門(mén)螺桿菌感染組患兒體重過(guò)低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。病理組織結(jié)果顯示，HP陽(yáng)性組活動(dòng)性淺表性胃炎、出血性胃炎、胃潰瘍的比例高于HP陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 HP陽(yáng)性組和HP陰性組臨床特征分析 例(%)

2.2 多樣性分析

通過(guò)對(duì)測(cè)序所得的細(xì)菌物種數(shù)量的稀釋曲線來(lái)表示物種豐度和多樣性，見(jiàn)圖1。HP陰性組的物種豐度和物種多樣性高于HP陽(yáng)性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001），表明幽門(mén)螺桿菌感染會(huì)顯著降低胃黏膜細(xì)菌群落的多樣性。

圖1 HP陽(yáng)性組和HP陰性組的稀釋性曲線圖

2.3 組間物種差異分析

在門(mén)水平，HP陽(yáng)性組和HP陰性組的優(yōu)勢(shì)物種的種類相同，但所占的比例有所不同，圖2柱狀圖展示兩組的門(mén)水平的物種分布。其中HP陽(yáng)性組為： Proteobacteria變形菌門(mén)（64%）、Firmicutes厚壁菌門(mén)（13%）、Bacteroidetes擬桿菌門(mén)（8%）、Actinobacteria放線菌門(mén)（6%）、Fusobacteria梭桿菌門(mén)（5%）。而HP陰性組為Proteobacteria變形菌門(mén)（46%）、Firmicutes厚壁菌門(mén)（23%）、Bacteroidetes擬桿菌門(mén)（13%）、Actinobacteria放線菌門(mén)（6%）、Fusobacteria梭桿菌門(mén)（2%）。

在屬水平上，HP陽(yáng)性組和HP陰性組兩組在屬水平的物種分布柱狀圖（圖3），HP陽(yáng)性組Helicobacter螺桿菌屬比例高達(dá)62%，螺桿菌屬是變形菌門(mén)的一種，這也是引起HP陽(yáng)性組變形菌門(mén)比例明顯升高的因素。除螺桿菌屬外，HP陽(yáng)性組Prevotella普氏菌屬（7%VS 3%）、Fusobacterium梭桿菌屬(6%VS 3%)比例較HP陰性組高。

圖2 HP陽(yáng)性組和HP陰性組兩組在門(mén)水平的物種分布柱狀圖

圖3 HP陽(yáng)性組和HP陰性組兩組在屬水平的物種分布柱狀圖

3 討論

傳統(tǒng)上，胃微生物群落特征的方法主要依賴于胃黏膜或胃液的分離培養(yǎng)，但對(duì)苛養(yǎng)菌及生長(zhǎng)緩慢的細(xì)菌分離培養(yǎng)很棘手，80%的細(xì)菌是不可培養(yǎng)的［5］。因此傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法很難全面的認(rèn)識(shí)胃黏膜菌群分布特征。16 SrDNA編碼原核生物16S rRNA的基因，存在于所有細(xì)菌、衣原體、支原體、立克次體、螺旋體和放線菌等原核生物的基因組中［6］，由多個(gè)保守區(qū)和與之相間的多個(gè)可變區(qū)組成。保守區(qū)為所有細(xì)菌共有，細(xì)菌之間無(wú)顯著差異；可變區(qū)在不同細(xì)菌之間存在一定程度的差異，具有細(xì)菌種屬特異性。PCR擴(kuò)增16S rDNA V3-V4區(qū)，可將標(biāo)本中的細(xì)菌鑒定到門(mén)、屬乃至菌株水平。16 SrDNA測(cè)序技術(shù)因此被視為細(xì)菌鑒定與分類的金標(biāo)準(zhǔn)，具有通量高、速度快、準(zhǔn)確度高的優(yōu)勢(shì)［7］。Mera等［8］人的研究報(bào)道了幽門(mén)螺桿菌的感染對(duì)身高和體重有重大影響。Goodman等［9］研究了幽門(mén)螺桿菌感染的學(xué)齡期兒童，結(jié)果顯示幽門(mén)螺桿菌感染后體重生長(zhǎng)速度減慢。在我們的研究中，幽門(mén)螺桿菌感染組患兒體重過(guò)低（BMI＜18.5 kg/m2），幽門(mén)螺桿菌感染后生長(zhǎng)受限，可能是幽門(mén)螺桿菌感染致慢性胃炎，難治性鐵缺乏性貧血的結(jié)果，另一種可能的解釋可能是胃炎影響了控制食欲的激素。成人幽門(mén)螺桿菌感染者胃內(nèi)菌群特征的研究表明，幽門(mén)螺桿菌能顯著影響胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)［10］，兒童幽門(mén)螺桿菌感染也會(huì)影響胃內(nèi)菌群狀態(tài)［11］。本研究結(jié)果證實(shí)，兒童幽門(mén)螺桿菌感染后胃黏膜細(xì)菌群落數(shù)量顯著下降，物種相對(duì)豐度下降。幽門(mén)螺桿菌感染也影響胃內(nèi)菌群的結(jié)構(gòu)差異，幽門(mén)螺桿菌感染患兒Prevotella普氏菌屬、Fusobacterium梭桿菌屬相對(duì)豐度升高，炎癥反應(yīng)程度會(huì)加劇。本研究發(fā)現(xiàn)幽門(mén)螺桿菌感染后Prevotella普氏菌屬、Fusobacterium梭桿菌屬相對(duì)豐度增高，病理組織結(jié)果顯示HP陽(yáng)性組活動(dòng)性淺表性胃炎、出血性胃炎、胃潰瘍的比例增高，幽門(mén)螺桿菌可能與這些細(xì)菌相互作用，共同導(dǎo)致胃內(nèi)一系列疾病的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，幽門(mén)螺桿菌感染影響兒童體重、胃內(nèi)病理組織、胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)，幽門(mén)螺桿菌可能與胃內(nèi)菌群共同促進(jìn)胃部疾病的發(fā)生、發(fā)展。從胃微生態(tài)的角度，重建胃內(nèi)微生態(tài)環(huán)境，對(duì)幽門(mén)螺桿菌感染相關(guān)疾病的治療有良好的臨床意義和應(yīng)用前景。