邱山桐，張 昊，沈雅麗，潘陽陽，曾巧英，王 萌

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

外泌體是指包含了多種mRNA、miRNA和蛋白質(zhì)的微小囊泡[1]，直徑30～150 nm，呈茶托形或一側(cè)凹陷的半球形結(jié)構(gòu)[2]，主要來源于細(xì)胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡體，經(jīng)多囊泡體外膜與細(xì)胞膜融合后釋放到胞外基質(zhì)中[1-3]。外泌體在細(xì)胞間信息交流中發(fā)揮著重要作用，其攜帶的物質(zhì)可作為疾病診斷的分子標(biāo)志物[4]，也可作為藥物載體靶向疾病部位[5]。外泌體在動(dòng)物體液中分布廣泛[6]，血清是從動(dòng)物體內(nèi)較為容易獲取的體液。從血清中提取得到純度較高的外泌體用于后期的疾病診斷有著較為重要的意義[7]。目前，關(guān)于小鼠血清來源的外泌體的分離方法研究較少。

本實(shí)驗(yàn)通過對小鼠來源的血清外泌體的密度梯度離心提取方法以及超高速離心法的提取方法進(jìn)行比較，討論這2種方法各自的優(yōu)缺點(diǎn)，篩選出適合小鼠血清來源外泌體的提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清潔級60日齡昆明系小鼠18只（2019.12.10購入12只，2020.10.10購入6只；均由蘭州獸醫(yī)研究所提供）；30%蔗糖溶液、3%磷鎢酸染液；高速離心機(jī)（日立CT15RE）、超高速冷凍離心機(jī)（日立CP100NX）、透射電子顯微鏡（日立HT7700，蘭州獸醫(yī)研究所）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 超速離心法 采用超速離心法提取小鼠血清外泌體，具體步驟如圖1所示。將6只60日齡昆明系小鼠摘眼球采集小鼠血液，收集血液于離心管中，待血液凝固后，放入離心機(jī)中，3 000 r/min，4℃離心5 min，上清液即為血清。將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，300 g，4℃離心10 min；取上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，2 000 g，4℃離心10 min；取上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中10 000 g，4℃離心70 min；取上清液轉(zhuǎn)移到新的超離管中，100 000 g，4℃離心70 min，棄上清，加入適量PBS緩沖液，使外泌體重懸與PBS緩沖液中；100 000 g，4℃離心70 min，棄上清，底部沉淀即為外泌體，加入200μl 4℃預(yù)冷的PBS緩沖液，使外泌體重懸與PBS緩沖液中，置于-80℃保存。

圖1 超速離心法操作步驟

1.2.2 密度梯度離心法 采用密度梯度離心法提取小鼠血清外泌體，具體步驟如圖2所示。將小鼠通過摘眼球采血，收集血液于離心管中，待血液凝固后，放入離心機(jī)中，3 000 r/min，4℃離心5 min，上清液即為血清。將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，700 g，4℃離心10 min；取上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，10 000 g，4℃離心30 min，沿離心管管壁緩慢加入4 ml 30%蔗糖溶液，形成一單層后，100 000 g，4℃離心70 min，棄上清，將蔗糖層重懸于PBS緩沖液中；再以100 000 g，5.4℃離心70 min，將獲得的沉淀物重懸于200μl 4℃預(yù)冷的PBS緩沖液中，所得沉淀即為外泌體，置于-80℃保存。

圖2 密度梯度離心法操作步驟

1.3 外泌體的鑒定

利用透射電鏡（transmission electron microscope,TEM）對外泌體進(jìn)行鑒定。染色過程如下：采用負(fù)染色技術(shù)，載樣銅網(wǎng)碳膜面朝上，分別滴加提取的外泌體混懸液20μl，室溫靜置3 min后用濾紙吸干液體，再加入30μl的3%磷鎢酸溶液負(fù)染3 min，濾紙吸干、晾干，透射電鏡下觀察各組外泌體形態(tài)。

1.4 外泌體超速離心法的重復(fù)性檢測

在2020年10月對6只60日齡昆明系小鼠用超速離心法提取小鼠血清中外泌體。利用透射電鏡觀察提取到的外泌體，與之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，檢驗(yàn)超速離心法的重復(fù)性。

2 結(jié)果

2.1 超速離心法外泌體結(jié)果

由超速離心法從小鼠血清中得到的外泌體在透射電鏡下可觀察到囊泡狀外泌體結(jié)構(gòu)，大小在100 nm左右，密度較小，放大觀察可見背景較為清晰，結(jié)構(gòu)清楚完整，便于觀察（見圖3）。提取到的外泌體在透射電鏡的一個(gè)視野下含量較少，分布均勻。根據(jù)電鏡下的觀察結(jié)果，計(jì)算平均數(shù)，大致推算出每平方厘米有3.0×108個(gè)外泌體。

2.2 密度梯度離心法外泌體結(jié)果

由密度梯度離心法從小鼠血清中得到的外泌體在透射電鏡下可觀察到囊泡狀外泌體結(jié)構(gòu)，大小在100 nm左右，在透射電鏡的一個(gè)視野內(nèi)含量較多，分布不均勻，許多堆疊在一起，不是很方便觀察形態(tài)，背景較為雜亂，判斷雜質(zhì)較多（見圖4）。因外泌體分布不均勻且多個(gè)堆疊在一起，故無法估算外泌體個(gè)數(shù)。

圖4 密度梯度離心法提取到外泌體

2.3 重復(fù)性

對同日齡同品系的小鼠通過超速離心法提取血清中外泌體。在電鏡下進(jìn)行觀察，可觀察到囊泡狀外泌體結(jié)構(gòu)，大小在100 nm左右，結(jié)構(gòu)依舊清晰完整，可見標(biāo)準(zhǔn)的雙層膜結(jié)構(gòu)，分布較為均勻（見圖5）。根據(jù)電鏡下的觀察結(jié)果，計(jì)算平均數(shù)，大致推算出每平方厘米有2.8×108個(gè)外泌體，與第一次提取的計(jì)算結(jié)果相近，由此可知超速離心法的重復(fù)性較好，均為500 nm比例尺下。

圖5 不同批次小鼠血清超速離心法提取得到的外泌體

3 討論與結(jié)論

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出超速離心法在提取血清中外泌體中較密度梯度離心法純度較高，分布較為平均，結(jié)構(gòu)比較清晰，不會堆疊在一起，無須加入其他試劑，重復(fù)性較好，但耗時(shí)較長。密度梯度離心法提取的量較多，步驟較為簡便，耗時(shí)較超速離心法少一些，但純度不佳，得到的外泌體常堆疊在一起，在提取時(shí)需要加入蔗糖溶液，可能會對純度要求較高的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生一定影響。

隨著對外泌體了解的不斷深入，它是目前已知細(xì)胞間信息較為合適的通信工具，其內(nèi)蛋白質(zhì)含有與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的特異性蛋白[8]。外泌體中所攜帶的miRNA會參與體內(nèi)的多種生物學(xué)過程，可以對機(jī)體內(nèi)1/3以上的基因表達(dá)起到調(diào)控作用[9]。這些外泌體中的生物信息分子會隨著疾病的發(fā)展而發(fā)生變化[10]。外泌體廣泛存在于人和動(dòng)物的血液中，可以穩(wěn)定地提供具有特異性的疾病信息，且樣本便于獲得，對人和動(dòng)物的傷害較小，方法便于推廣?？梢酝ㄟ^對信號分子進(jìn)行篩選，找到不同疾病的生物標(biāo)志物，通過提取血清中的外泌體對其內(nèi)所含的信號分子進(jìn)行識別，以達(dá)到快速診斷疾病、判斷疾病分期、評價(jià)治療效果的目的。

直接從血清中獲取外泌體，并對其內(nèi)的多種信號分子進(jìn)行檢測，擁有廣闊的臨床應(yīng)用前景，因此對血清中外泌體提取方法的研究具有重要的實(shí)用意義。本次試驗(yàn)通過超速離心法和密度梯度離心法對同日齡同品系小鼠血清中的外泌體進(jìn)行提取，并用透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)超速離心法在純度和應(yīng)用前景較密度梯度離心法更好，該結(jié)果與王飄飄[11]等人在巨噬細(xì)胞中和范式杰[12]等人在牛乳中利用不同方法提取外泌體得到的結(jié)論相似。

綜上所述，在小鼠血清外泌體提取中，密度梯度離心法雖然耗時(shí)較短，步驟較少，但提取出的外泌體分布不均勻，大批堆疊在一起，不方便觀察和進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，且引入了其他試劑，會對純度有要求的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生一定影響。超速離心法得到的外泌體結(jié)構(gòu)清晰，分布均勻，純度較高，故在小鼠血清的外泌體提取中超速離心法更好一些。在日后的研究中研究者可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮筒牧蠈Ψ椒ㄟM(jìn)行選擇。