吳麗華 胡晶晶 梁凱玲 張憶聰

(廣東省婦幼保健院 醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東 廣州 511442)

全世界大約有10%～15%的育齡夫婦不育，世界衛(wèi)生組織認(rèn)為不育夫婦中的50%都由男性因素引起的[1]，而在男性不育中無(wú)精癥和隱匿性無(wú)精癥占10%～20%。引起男性無(wú)精癥的原因有遺傳學(xué)異常、性激素水平異常、免疫異常、年齡和環(huán)境等因素。染色體異常及Y染色體微缺失是男性不育癥患者重要的遺傳學(xué)病因，也是目前臨床上最關(guān)注的遺傳學(xué)異常。該病因?qū)W檢查有助于臨床采取相應(yīng)治療措施或輔助生育技術(shù)，減少患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。本文通過(guò)回顧性分析了516例無(wú)精癥的患者的染色體核型和Y染色體上的無(wú)精因子(azoospermia factor，AZF)微缺失檢測(cè)結(jié)果，探討Y染色體微缺失和細(xì)胞遺傳學(xué)分析在無(wú)精癥中發(fā)生的頻率以及它們之間的相關(guān)性，幫助明確無(wú)精癥患者的遺傳學(xué)病因。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 收集自2015年3月至2019年12月近5年來(lái)廣東省婦幼保健院生殖健康與不育癥科診斷為無(wú)精癥的患者共516例，年齡21～52歲，平均年齡31.7歲。所有的患者均通過(guò)體檢和精液常規(guī)分析檢查，排除精索靜脈曲張、內(nèi)分泌紊亂、生殖道炎癥、免疫異常和理化等引起無(wú)精的因素。無(wú)精子癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)按照世界衛(wèi)生組織第5版《人類(lèi)精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》[2]的定義及方法，檢查精子密度至少3次或3次以上，且精液離心后也未見(jiàn)精子。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞遺傳學(xué)分析 患者簽署知情同意后，抽取肝素抗凝外周血4ml，常規(guī)進(jìn)行淋巴細(xì)胞培養(yǎng)72h，常規(guī)制備染色體，G顯帶，計(jì)數(shù)20個(gè)核型，分析5個(gè)核型，有數(shù)目異常者加倍計(jì)數(shù)及分析，染色體命名參考根據(jù)《人類(lèi)細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制2016》[3]。

1.2.2 Y染色體微缺失檢測(cè) 抽取患者EDTA-K2抗凝外周血2ml，提取基因組DNA，選擇Y染色體AZF上6個(gè)STS序列，分別是AZFa:SY84、SY86，AZFb:SY127、SY134，AZFc:SY254、SY255，以SRY(SY14)和ZFAX/Y位點(diǎn)為內(nèi)對(duì)照同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR引物末端FAM、JOE和TAMRA熒光基團(tuán)標(biāo)記[4]。除ZFX/ZFY引物外，其他引物和擴(kuò)增條件按照參考?xì)W洲男科學(xué)會(huì)(European Academy of Andrology，EAA)2004版指導(dǎo)原則和歐洲分子基因診斷質(zhì)量聯(lián)盟(European Molecular Genetics Quality Network，EMQN)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[5]，最后使用GeneMaker(version2.2.0)軟件對(duì)毛細(xì)管電泳結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞遺傳學(xué)分析 516例無(wú)精癥患者中共檢出染色體異?；颊?6例，檢出率12.8%(66/516)。檢出性染色體異常57例(86.36%，57/66)，包括性染色體結(jié)構(gòu)異常4例、性染色體數(shù)目異常44例、46,XX性別發(fā)育異常4例和嵌合體9例；檢出常染色體結(jié)構(gòu)異常9例(13.64%，9/66)。詳見(jiàn)表1。

2.2 Y染色體微缺失檢測(cè) 檢出AZF缺失40例，總?cè)笔蕿?.8%(40/516)，包括5例AZFa(12.5%，5/40)、1例AZFb(2.5%，1/40)、20例AZFc(50.0%，20/40)、9例AZFb+AZFc(22.5%，9/40)、4例AZFa+AZFb+AZFc(10.0%，4/40)。詳見(jiàn)表1。

2.3 Y染色體微缺失患者中的細(xì)胞遺傳學(xué)分析 40例Y染色體微缺失中檢出正常核型27例(67.5%，27/40)，異常核型13例(32.5%，13/40)，異常核型包括46,X,del(Y)(10.0%，4/40)、性染色體嵌合體(12.5%，5/40)和46,XX(10.0%，4/40)。詳見(jiàn)表1。

表1 染色體核型和Y染色體微缺失檢出率及分布

3 討論

在男性無(wú)精癥的遺傳病因中，染色體核型異常和Y染色體AZF微缺失是2個(gè)常見(jiàn)的遺傳因素。染色體Y染色體長(zhǎng)臂q11區(qū)存在A(yíng)ZF，其含有3個(gè)互不重疊的AZFa、AZFb、AZFc區(qū)域組成[6]，為調(diào)控精子發(fā)生的基因位點(diǎn)，一個(gè)或多個(gè)區(qū)域的缺失可引起生精功能障礙，導(dǎo)致男性無(wú)精癥。本研究516例無(wú)精癥患者中異常核型檢出率為12.8%，與Fu[7]報(bào)道的14.71%相近。我們發(fā)現(xiàn)無(wú)精癥患者中最常見(jiàn)的異常核型是47,XXY，占異常核型的49.4%，與Zhang[8]報(bào)道的51.14%相一致。Klinefelter綜合征即先天性睪丸曲細(xì)精管發(fā)育不全，Y染色體上存在控制睪丸發(fā)育的SRY基因，表型為男性，但是由于患者核型中多余的X染色體導(dǎo)致Y染色體功能受到抑制，使睪丸曲精管發(fā)育受到影響，生精小管玻璃樣變和纖維化。臨床表現(xiàn)無(wú)精子，且有睪丸小而質(zhì)硬和第二性征發(fā)育異常。劉興章等[8]報(bào)道的無(wú)精癥或隱匿性無(wú)精癥患者中檢出的165例47,XXY，未發(fā)現(xiàn)Y染色體AZF微缺失。本文39例47,XXY中也未檢出AZF微缺失，提示47,XXY患者的無(wú)精癥病因與Y染色體微缺失無(wú)明顯相關(guān)性。因此，對(duì)于Klinefelter綜合征患者可能沒(méi)必要進(jìn)行AZF基因微缺失檢測(cè)。

國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)常染色體上存在2000多個(gè)與精子生成有關(guān)的基因[7]。一些研究發(fā)現(xiàn)1號(hào)染色體存在與生精功能相關(guān)的基因，包括SCP-1、tsMCAK、MTHFR、MSH4和MMP-23[9，10]。本文檢出的常染色體異常9例，均無(wú)AZF微缺失，其中1號(hào)染色體最常見(jiàn)，包括3例倒位和1例平衡易位，占常染色體異常的44.4%。有研究在男性不育癥，尤其是無(wú)精癥患者中1號(hào)染色體斷裂位點(diǎn)數(shù)相比其他常染色體要高[11]?？梢?jiàn)1號(hào)染色體的結(jié)構(gòu)異?？赡芘c患者的無(wú)精癥具有高度相關(guān)。原因可能是1號(hào)染色體發(fā)生易位或倒位后，這些斷裂的位點(diǎn)如果位于生精功能的形成的相關(guān)基因，破壞了該基因的完整性，影響基因表達(dá)進(jìn)而引發(fā)生精障礙，其發(fā)生機(jī)制有待日后進(jìn)一步深入研究。

本文檢出AZF總?cè)笔蕿?.8%，與Ferlin[12]報(bào)道的相近。AZF至少可分為a、b、c 3個(gè)區(qū)域，分別位Yq11.23的近、中、遠(yuǎn)端。AZFa缺失可導(dǎo)致唯支持細(xì)胞綜合征，病理檢查表現(xiàn)為間質(zhì)細(xì)胞及支持細(xì)胞減少，精曲小管發(fā)育不良；AZFb缺失則會(huì)導(dǎo)致精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞成熟發(fā)育障礙，表現(xiàn)為無(wú)精；AZFc缺失則比較復(fù)雜，可以出現(xiàn)有正常精子到無(wú)精癥的表型。本文發(fā)現(xiàn)無(wú)精癥中AZFc異常率為50%，為最常見(jiàn)的缺失類(lèi)型，其次為AZFb+AZFc(22.5%)、AZFa(12.5%)、AZFa+AZFb+AZFc(10.0%)和AZFb(2.5%)。以上涉及到AZFa和AZFb單個(gè)或多個(gè)區(qū)域的缺失無(wú)法獲得精子，AZFc缺失的無(wú)精癥患者則可以通過(guò)睪丸穿刺而獲成熟精子，借助卵細(xì)胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)生育后代[13，14]，但AZF缺失也有通過(guò)垂直傳播給男性子代的風(fēng)險(xiǎn)。因而，早期發(fā)現(xiàn)是否存在A(yíng)ZF缺失及缺失區(qū)域，為男性無(wú)精癥患者日后是否選擇通過(guò)ICSI輔助生育治療提供了科學(xué)依據(jù)，與此同時(shí)為AZFc缺失的患者行ICSI治療前遺傳診斷選擇女性胚胎提供了遺傳咨詢(xún)，減少非必要的有創(chuàng)手術(shù)，減輕患者的心理壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

40例AZF缺失患者中正常核型占65%，劉興章等[15]也報(bào)道了997例無(wú)精癥患者中有71.6%正常男性核型，可見(jiàn)AZF缺失中正常核型比例高。一般來(lái)說(shuō)AZF微缺失很難通過(guò)染色體核型檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，因此，對(duì)無(wú)精癥患者染色體核型正常的患者有必要再進(jìn)一步行AZF基因的檢測(cè)。

決定睪丸曲細(xì)精管生精細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵基因存在Y染色體q11位置，該部分缺失或重排可能導(dǎo)致了Y染色體上一系列與生精子功能的相關(guān)基因缺失或改變。我們檢出4例核型為46,XY,del(Y)(q11.22)，細(xì)胞遺傳學(xué)上Y染色體長(zhǎng)臂有明顯的缺失。同時(shí)涉及到不同區(qū)域的AZF微缺失，1例AZFc區(qū)缺失、2例AZFb+AZFc區(qū)缺失、1例AZFa+AZFb+AZFc區(qū)缺失。4例患者染色體核型Y染色體缺失定位于q11.22位置，分子水平表現(xiàn)出不同AZF的缺失，表明細(xì)胞遺傳學(xué)上對(duì)Y染色體長(zhǎng)臂q11.22缺失的無(wú)精癥患者AZF微缺失的可能性大，且缺失的區(qū)域需要分子遺傳學(xué)確認(rèn)。

綜上所述，染色體異常和Y染色體微缺失是影響男性無(wú)精癥的重要遺傳因素。AZF微缺失的無(wú)精癥患者大多核型正常，常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)不能直接反應(yīng)AZF微缺失情況，必需通過(guò)分子學(xué)水平明確診斷。2種方法聯(lián)合檢測(cè)有助于在接受輔助生育治療前的無(wú)精癥患者明確遺傳學(xué)病因，從而減輕患者心理負(fù)擔(dān)和避免不必要的臨床治療。