張丹 顏夢秋 張美彥 譚琦 宋春艷 尚曉冬

摘要：變性聚丙烯酰胺凝膠電泳是一種高效鑒定微衛(wèi)星分子標(biāo)記的方法，廣泛應(yīng)用于種質(zhì)鑒定、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及分子標(biāo)記輔助育種等研究中。該方法由于操作繁瑣，目前在食用菌領(lǐng)域的應(yīng)用尚不廣泛。以香菇為研究對(duì)象，建立變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的檢測流程，并利用正交試驗(yàn)對(duì)檢測流程中涉及的加樣緩沖液與PCR反應(yīng)液的體積比、95 ℃變性時(shí)間、置于冰上冷卻時(shí)間、銀染時(shí)間、銀染后膠板去離子水洗時(shí)間等5個(gè)操作節(jié)點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，加樣緩沖液與PCR反應(yīng)液體積比為1 ∶2，95 ℃變性2～5 min，置于冰上冷卻15～20 min，銀染7 min，銀染后膠板用去離子水洗5～10 s是正交試驗(yàn)的較優(yōu)處理組合。試驗(yàn)建立了香菇微衛(wèi)星標(biāo)記變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測操作規(guī)程，該操作規(guī)程具有成本低、效率高、易批量化操作等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)其他食用菌微衛(wèi)星標(biāo)記的應(yīng)用具有重要的參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞：香菇;變性聚丙烯酰胺凝膠電泳;微衛(wèi)星標(biāo)記;正交試驗(yàn)設(shè)計(jì);銀染試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S646.1+20.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）05-0057-05

微衛(wèi)星標(biāo)記別稱簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，簡稱SSR）標(biāo)記是目前普遍使用的分子遺傳學(xué)標(biāo)記，具有多態(tài)性高、共顯性、檢測重復(fù)性好、基因組中廣泛分布等優(yōu)點(diǎn)。近年來，隨著全基因組測序技術(shù)的不斷發(fā)展，SSR標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物遺傳圖譜的構(gòu)建、數(shù)量性狀座位（quantitative trait locus，簡稱QTL）定位、分子遺傳多樣性等研究。SSR標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測方法主要有熒光標(biāo)記引物測序法、同位素標(biāo)記引物的聚丙烯酰胺凝膠電泳法、瓊脂糖凝膠電泳法、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳法等，其中變性聚丙烯酰胺凝膠電泳-銀染檢測法被認(rèn)為是精度最好的鑒定方法。

在香菇分子遺傳學(xué)研究中，SSR標(biāo)記已應(yīng)用于菌種真實(shí)性鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建以及遺傳多樣性分析等研究中。已有的文獻(xiàn)報(bào)道表明，目前香菇中SSR標(biāo)記的檢測多采用瓊脂糖凝膠電泳法或是非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳法，有關(guān)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳法的報(bào)道較少。為進(jìn)一步推動(dòng)該方法在食用菌領(lǐng)域的應(yīng)用，本研究擬采用正交設(shè)計(jì)對(duì)現(xiàn)有變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測流程進(jìn)行優(yōu)化，以期建立一套高效、低成本、易批量化實(shí)踐的香菇SSR標(biāo)記操作規(guī)程，同時(shí)為其他食用菌SSR標(biāo)記的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2019年3月在上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所開展，供試香菇菌株為國內(nèi)常用栽培品種，共24株（表1），由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所育種室提供。通過十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，簡稱CTAB）法[10]提取香菇菌絲體的全基因組DNA。

1.2 PCR擴(kuò)增體系和程序

選用的SSR引物根據(jù)香菇L135菌株的全基因組序列設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物信息見表2。

PCR反應(yīng)使用Mycycler Thermal Cycler （Bio-Rad，USA） PCR儀，反應(yīng)體系為20 μL，包括2 μL 10×Reaction buffer （Promega，without Mg2+），2 μL MgCl2 （Promega，25 mmol/L），0.4 μL dNTP（10 mmol/L），0.2 μL Taq聚合酶 （5 U/μL，Promega公司產(chǎn)品），2 μL 模板DNA （50 ng/μL），正向和反向引物各1 μL （10 μmol/L），以及 11.4 μL ddH2O。

PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.3 電泳

電泳儀型號(hào)為DYY-12（北京六一儀器廠），電泳槽型號(hào)為DYCZ-20E（北京六一儀器廠），玻璃膠板尺寸為48 cm×32 cm，采用體積濃度為6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴(kuò)增片段，采用穩(wěn)壓為1 000 V，電泳時(shí)間為50 min。DNA Marker 為DL500（TaKaRa 公司，日本）。

1.4 樣品的變性處理

在電泳前須將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性處理，具體方法為將擴(kuò)增產(chǎn)物與點(diǎn)樣緩沖液按照一定比例進(jìn)行混合。采用95 ℃高溫處理打開DNA雙鏈，之后迅速置于冰上冷卻，使DNA保持單鏈狀態(tài)。

1.5 銀染及顯色

試驗(yàn)采用銀染及強(qiáng)堿法顯色，具體流程為 （1） 電泳結(jié)束后切斷電源，取下膠板，將附著凝膠的玻璃板放入裝有去離子水的塑料盤中，快速用去離子水漂洗1次。（2） 銀染：將膠板放入1 000 mL質(zhì)量濃度為0.1%的AgNO3銀染液中浸泡適當(dāng)時(shí)間，之后用去離子水漂洗1次。（3） 顯色：將銀染后的膠板放入1 000 mL的顯色液（質(zhì)量濃度為1.6%的無水NaOH和體積濃度為0.5%的甲醛）中進(jìn)行顯色。

1.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

經(jīng)反復(fù)實(shí)踐，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳流程有5個(gè)操作節(jié)點(diǎn)需優(yōu)化改良，其中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的變性有3個(gè)節(jié)點(diǎn)，即點(diǎn)樣緩沖液添加量、高溫（95 ℃）處理時(shí)間、變性產(chǎn)物在冰上冷卻時(shí)間;銀染和顯色過程中有2個(gè)節(jié)點(diǎn)，即銀染時(shí)間和銀染后膠板去離子水漂洗時(shí)間。因此，試驗(yàn)采用L16（45）正交設(shè)計(jì)對(duì)上述5個(gè)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化改良，試驗(yàn)的因子設(shè)置為加樣緩沖液與PCR反應(yīng)液的體積比、95 ℃變性時(shí)間（min）、變性產(chǎn)物冰上冷卻時(shí)間（min）、銀染時(shí)間（min）、銀染后去離子水漂洗時(shí)間（s）。具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表3。

1.7 拍照統(tǒng)計(jì)與膠板質(zhì)量評(píng)價(jià)

將銀染顯色后的玻璃膠板晾干后置于白熾燈箱上，對(duì)不同處理的膠板進(jìn)行比較評(píng)價(jià)，使用數(shù)碼相機(jī)拍照保存。

采用3個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)各處理的膠板質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。3個(gè)指標(biāo)分別為膠板整體清晰度、膠板背景色、產(chǎn)物條帶和DNA marker的清晰度，膠板整體清晰度可分為模糊、一般、清晰等3個(gè)等級(jí);膠板背景色分為深、一般、淺3個(gè)等級(jí);產(chǎn)物條帶和DNA marker的清晰度分為3個(gè)等級(jí)，即模糊、一般、清晰。上述3個(gè)指標(biāo)各等級(jí)依次賦予1、2、3分的得分，得分越高效果越好。評(píng)價(jià)以白熾燈箱為唯一背景光源，采用人眼觀測投票打分的方式進(jìn)行，參與測評(píng)共34人，以出現(xiàn)次數(shù)最多的得分為該處理膠板質(zhì)量指標(biāo)的最終評(píng)分。各處理的膠板質(zhì)量評(píng)分情況見表3。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)各處理電泳及銀染顯色效果的比較

正交試驗(yàn)的極差分析結(jié)果可以闡明各因素不同水平對(duì)膠板質(zhì)量的影響，同時(shí)也可以挖掘出重要的影響因子。表4中k表示表3中各因素同一水平對(duì)應(yīng)膠板質(zhì)量評(píng)分的平均值。極差（R）是各水平的平均值中最大值與最小值的差值。極差大說明此因素的不同水平產(chǎn)生的評(píng)分差異較大，重要性也越高。由表4可知，對(duì)膠板整體清晰度指標(biāo)而言，最重要的影響因子為銀染時(shí)間，其極差為2。膠板整體清晰度的平均值隨著銀染時(shí)間的增加呈增大趨勢，說明銀染時(shí)間與膠板整體清晰度成正比。

膠板背景色評(píng)分的極差分析結(jié)果表明，銀染時(shí)間越短，銀染后漂洗的時(shí)間越長，膠板背景顏色越淺。擴(kuò)增產(chǎn)物條帶和DNA marker條帶清晰度評(píng)分的極差分析結(jié)果表明，銀染時(shí)間和反應(yīng)液與緩沖液的體積比對(duì)條帶清晰度有較大影響，銀染時(shí)間越長條帶的清晰度越高;緩沖液與反應(yīng)液的體積比為 1 ∶2 時(shí)條帶清晰度最好。

2.2 正交試驗(yàn)各處理的時(shí)效性分析

正交試驗(yàn)中有4個(gè)涉及時(shí)效性的因素，其中高溫（95 ℃）變性時(shí)間設(shè)置2、5、8、11 min等4個(gè)水平。試驗(yàn)結(jié)果表明，變性時(shí)間在2～11 min的范圍內(nèi)均可檢測出目標(biāo)條帶，從提高試驗(yàn)效率以及節(jié)能降耗的角度考慮，變性時(shí)間設(shè)置為2～5 min較為合理。

冰上冷卻時(shí)間設(shè)置5、10、15、20 min等4個(gè)水平，結(jié)果表明，冷卻時(shí)間在5～20 min的范圍內(nèi)均可檢測出目標(biāo)條帶，并沒有出現(xiàn)隨著時(shí)間的延長擴(kuò)增產(chǎn)物復(fù)性現(xiàn)象（單鏈DNA變?yōu)殡p鏈狀態(tài)）。在實(shí)際操作中，擴(kuò)增產(chǎn)物的變性可在膠板預(yù)電泳（將膠板接通電源進(jìn)行預(yù)熱）之前進(jìn)行，預(yù)電泳10～15 min后再進(jìn)行上樣有利于提高擴(kuò)增產(chǎn)物在膠板中的整齊度，因此冰上冷卻時(shí)間較為合適的選擇為15～20 min。

銀染時(shí)間設(shè)置2、7、12、17 min等4個(gè)水平。正交分析的結(jié)果表明，銀染時(shí)間與膠板的整體清晰度以及擴(kuò)增條帶的清晰度呈正比，但與膠板背景色成反比。比較銀染時(shí)間各水平的膠板整體清晰度得分可以發(fā)現(xiàn)，2 min處理的平均得分為1.00分，7 min 處理的平均得分為2.50分，12 min處理的平均得分為275分，17 min處理的平均得分為3.00分。綜合膠板清晰度得分和時(shí)間成本，銀染7 min較為合理。

銀染后用去離子水漂洗時(shí)間設(shè)置0、5、10、15 s等 4個(gè)水平，極差分析結(jié)果表明，銀染后使用去離子水漂洗膠板可降低背景顏色深度。在實(shí)際操作中，沒有經(jīng)去離子水漂洗的膠板放入顯色液中時(shí)，膠板表面殘留的AgNO3在顯色液中會(huì)產(chǎn)生大量黑色沉淀物，其附著在膠板上使膠片背景色加深。同時(shí)較多的黑色沉淀物也會(huì)影響顯色液的使用效率（1 d內(nèi)進(jìn)行多次銀染時(shí)，顯色液可重復(fù)使用）。而用去離子水漂洗時(shí)間過久（超過15 s），容易導(dǎo)致膠體在強(qiáng)堿顯色液中從玻璃板上脫落，致使整個(gè)試驗(yàn)失敗。綜合考慮，銀染后用去離子水浸泡膠板5～10 s效果較好。

綜上所述，95 ℃變性2～5 min，置于冰上冷卻15～20 min，銀染7 min，銀染后膠板用去離子水洗 5～10 s，是試驗(yàn)的較優(yōu)處理組合。

3 結(jié)論與討論

SSR標(biāo)記穩(wěn)定性好、多態(tài)性高且廣泛分布于基因組，目前已應(yīng)用于遺傳多樣性分析、連鎖圖譜構(gòu)建以及分子標(biāo)記輔助育種等研究[11]。食用菌中SSR標(biāo)記的應(yīng)用較晚，肖揚(yáng)等最早在香菇上建立了 SSR-PCR 技術(shù)體系，并對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析，該研究采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測了SSR標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物[7]。由于SSR標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物分子量小，常規(guī)的瓊脂糖電泳并不能完全檢測出SSR標(biāo)記的多態(tài)性，大規(guī)模應(yīng)用SSR標(biāo)記仍需使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測。

關(guān)于聚丙烯酰胺凝膠電泳及其染色方法的應(yīng)用及改良在動(dòng)植物中有較多報(bào)道，曲魯江等比較了雞基因組中SSR-PCR產(chǎn)物的變性與非變性聚丙烯酰胺-銀染檢測方法，發(fā)現(xiàn)變性聚丙烯酰胺凝膠及銀染方法檢測的條帶較清晰、易于鑒定[4]。李建武等通過對(duì)不同染色方法的比較，在馬鈴薯上建立了SSR標(biāo)記變性聚丙烯酰胺凝膠的快速銀染方法[12]。王愛聽等在玉米上對(duì)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行比較，認(rèn)為衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物在二者上的電泳結(jié)果存在差異[13]。在變性膠中微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物目的條帶清晰，易于鑒定;在非變性凝膠中表現(xiàn)有較多的非特異性條帶。李立群等在小麥上對(duì)SSR標(biāo)記變性聚丙烯酰胺凝膠電泳方法進(jìn)行了改進(jìn)，提高了大規(guī)模SSR分子標(biāo)記分析的工作效率[14]。王偉等對(duì)玉米SSR標(biāo)記檢測體系進(jìn)行了優(yōu)化，檢測了貴州51份玉米雜交種的遺傳多樣性，并建立了玉米SSR標(biāo)記技術(shù)操作規(guī)程[15]。

本研究在參考動(dòng)植物中前人研究的基礎(chǔ)上，建立香菇SSR標(biāo)記變性聚丙烯酰胺凝膠檢測流程，同時(shí)結(jié)合香菇SSR-PCR產(chǎn)物檢測的自身特點(diǎn)，采用正交試驗(yàn)對(duì)檢測流程中涉及的加樣緩沖液與PCR反應(yīng)液的體積比、95 ℃變性時(shí)間、置于冰上冷卻時(shí)間、銀染時(shí)間、銀染后膠板去離子水洗時(shí)間等5個(gè)操作節(jié)點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，加樣緩沖液與PCR反應(yīng)液的體積比為1 ∶2，95 ℃變性時(shí)間2～5 min，置于冰上冷卻15～20 min，銀染7 min，銀染后膠板用去離子水洗5～10 s，是正交試驗(yàn)的較優(yōu)處理組合。

利用改良后的香菇SSR標(biāo)記變性聚丙烯酰胺凝膠電泳操作流程，筆者進(jìn)一步選取6對(duì)SSR標(biāo)記引物檢測了24份常用香菇菌種的擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明，該流程可以高效地檢測出香菇基因組的SSR標(biāo)記（圖1），可應(yīng)用于香菇遺傳研究領(lǐng)域。優(yōu)化后的操作流程可為其他大型真菌SSR標(biāo)記的應(yīng)用提供參考。

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