葛婉寧 鐘敏 張柳笛

0 引言

近年來(lái)，除心臟移植之外，心室輔助裝置(ventricular assist device，VAD)成為臨床上治療心力衰竭的重要手段[1]。但是在VAD使用過(guò)程中，由于非生理性剪切應(yīng)力(non-physiological shear stress，NPSS)造成血液機(jī)械損傷，引起一系列臨床并發(fā)癥，主要包括創(chuàng)傷性溶血和血栓的形成[2-4]。經(jīng)過(guò)近幾十年對(duì)VAD的研發(fā)與改進(jìn)，溶血和血栓問題已經(jīng)得到重大改善。然而，近年來(lái)，VAD在臨床使用上的消化道出血問題開始引起越來(lái)越多的關(guān)注[5]，VAD植入1年后的出血發(fā)生率可高達(dá)65%。一些研究發(fā)現(xiàn)，VAD中NPSS對(duì)血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)的機(jī)械損傷是引發(fā)臨床上出血癥狀的主要因素[6-9]。然而由于血液成分vWF的機(jī)械損傷現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)和研究較晚，至今仍然定義模糊且缺乏相關(guān)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),非常不利于VAD的創(chuàng)新設(shè)計(jì)與發(fā)展。

vWF是一種在正常凝血過(guò)程中發(fā)揮重要作用的血漿糖蛋白，分子量較大，最小單體片段為500 kDa，高分子量部分可以超過(guò)10 000 kDa[10-12]。與vWF相關(guān)的評(píng)價(jià)參數(shù)主要包括高分子量血管性血友病因子(high molecular weight von Willebrand factor,HMW-vWF)的減少量、vWF抗原總含量、以及表征vWF抗原活性的vWF瑞斯托霉素輔因子活性和 vWF膠原結(jié)合活性[13]。其中HMW-vWF的損傷測(cè)試(vWF多聚體分析實(shí)驗(yàn))可以最直觀地反映vWF多聚體分子量分布狀況，是評(píng)價(jià)VAD對(duì)vWF損傷的首選測(cè)試方法。HMW-vWF多聚體是決定vWF功能的重要部分，當(dāng)血管破裂時(shí)，大量血小板會(huì)以HMW-vWF為中介，粘附在膠原纖維上形成血栓得以止血。NPSS對(duì)于HMW-vWF多聚體的降解，會(huì)直接破壞凝血機(jī)制，引發(fā)凝血功能異常并導(dǎo)致不同程度的出血事件[14-17]。然而，由于vWF分子量較大，沒有合適的內(nèi)參蛋白作為實(shí)驗(yàn)參照，也沒有相應(yīng)分子量的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。除此之外，vWF多聚體分析實(shí)驗(yàn)的操作步驟復(fù)雜、影響因素眾多、實(shí)驗(yàn)成本也較高，目前僅有極少數(shù)的實(shí)驗(yàn)室可常規(guī)檢測(cè)，所使用設(shè)備和方法也不盡相同，給研究VAD中NPSS對(duì)于血液成分vWF機(jī)械損傷的影響規(guī)律造成困難，不利于VAD的創(chuàng)新設(shè)計(jì)和改進(jìn)，因此合理設(shè)計(jì)vWF損傷的評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)并優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法十分必要。

本文針對(duì)VAD對(duì)vWF機(jī)械損傷這一臨床問題，給出在NPSS環(huán)境下，血液成分HMW-vWF損傷程度的測(cè)試方法，為制定VAD中NPSS對(duì)血液成分vWF機(jī)械損傷的標(biāo)準(zhǔn)提供參考，使得VAD 領(lǐng)域內(nèi)對(duì)具有臨床意義的標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)方法形成共識(shí)，促進(jìn)VAD的創(chuàng)新設(shè)計(jì)和改進(jìn)。

1 研究方法

首先采用人血作為基礎(chǔ)血樣，通過(guò)將測(cè)得的vWF高、中、低分子量的灰度值比值與文獻(xiàn)中實(shí)際數(shù)值做對(duì)比，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方法的可行性。然后采用該方法，對(duì)經(jīng)過(guò)血泵BPX-80剪切之后的豬血樣本進(jìn)行測(cè)試，以研究VAD對(duì)血液成分HWM-vWF的損傷情況，驗(yàn)證方法的有效性。其中剪切血樣是利用標(biāo)準(zhǔn)化血泵體外檢測(cè)平臺(tái)制備的，該平臺(tái)之前主要用于體外溶血測(cè)試，本研究成功將其應(yīng)用擴(kuò)展到對(duì)于vWF機(jī)械損傷的測(cè)試中[18]。

1.1 儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)儀器包括美國(guó)Bio-Rad公司的制膠器(1704412，15 cm×10 cm)、電泳槽(Mini-Sub Cell GT,18 cm×40.5 cm×9.4 cm/1 L/3.0 cm)和轉(zhuǎn)印槽(Criterion Blotter,12 cm×16 cm×18 cm/450 mL)，以及北京六一儀器廠的雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀電源(DYY-6C)。

使用試劑包括一抗(polyclonal rabbit anti-human von Willebrand factor，DAKO，美國(guó))、二抗(anti-rabbit IgG HRP-linked antibody，Cell Signaling Technology，美國(guó))、ECL發(fā)光液底液(Cell Signaling Technology，美國(guó))、瓊脂糖(Sigma-Aldrich，美國(guó))、十二基硫酸鈉(SDS，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，中國(guó))、10×Tris-乙酸-EDTA電泳緩沖液(TAE，海利克思，美國(guó))、10×TBS緩沖液(海利克思，美國(guó))、Tris-甘氨酸電泳緩沖液(海利克思，美國(guó))、Tris-HCl緩沖液(海利克思，美國(guó))、甘油(安諾倫生物科技有限公司，中國(guó))、溴酚藍(lán)(上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司，中國(guó))、Tween 20(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國(guó))、無(wú)水甲醇(上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司，中國(guó))、脫脂奶粉(北京索萊寶科技有限公司，中國(guó))、顯影液和定影液(上海源葉生物科技有限公司，中國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法及步驟

實(shí)驗(yàn)使用免疫印跡法將電泳分離后的vWF分子從凝膠轉(zhuǎn)移到固相載體聚偏氟乙烯膜(PVDF，Immobilon-P)上，然后用特異性抗體檢測(cè)膜上vWF多聚體的分子量分布情況。整個(gè)過(guò)程一般需要3 d，主要步驟包括制膠、電泳、轉(zhuǎn)印、免疫反應(yīng)和顯色5部分[19-23]。

1.2.1 測(cè)試樣品的制備

人血為蘇州大學(xué)唐仲英血液中心志愿者捐獻(xiàn)，豬血從蘇州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心取得，取血過(guò)程由專業(yè)人員進(jìn)行操作，均已通過(guò)蘇州大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

為了制備血泵剪切血樣，根據(jù)ISO和美國(guó)材料實(shí)驗(yàn)協(xié)會(huì)(American Socienty of Test Materials,ASTM)標(biāo)準(zhǔn)明確測(cè)試血液的選用標(biāo)準(zhǔn)，搭建標(biāo)準(zhǔn)化血泵體外檢測(cè)平臺(tái)[24-26]。實(shí)驗(yàn)用血采自體溫正常、無(wú)明顯疾病特征的豬，采血時(shí)按照 1∶20 的比例加入 0.4% 的肝素溶液抗凝。整個(gè)回路包括一根總長(zhǎng)為 2 m，內(nèi)徑為 9.5 mm 的聚氯乙烯軟管，一個(gè)儲(chǔ)血袋，一個(gè)流量探頭，壓力傳感器，螺旋夾和一臺(tái)待測(cè)試離心式血泵 BPX-80。在血液灌輸過(guò)程中注意用孔徑為 74 μm 的濾網(wǎng)過(guò)濾之后通過(guò)重力作用灌輸?shù)饺鐖D1所示的回路中[25]。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)化循環(huán)回路示意圖Figure 1 Schematic diagram of standardized circulation loop

開啟血泵，將其調(diào)整到待測(cè)試的實(shí)驗(yàn)條件。其中泵的流量設(shè)定為(2±0.25)L/min，壓力設(shè)定為(110±3)mmHg，循環(huán)血液溫度為(37±1)℃。測(cè)試周期為5 h，在血泵循環(huán)5 min 后采集第1個(gè)血樣，之后每隔1 h 采集1次，共計(jì)6個(gè)血樣。每次采集3 mL血樣，將血液樣本在4 000 r/min，10 min的參數(shù)下兩次離心得到待測(cè)血漿樣本，記錄時(shí)間和編號(hào)，并置于-80℃冰箱保存留用。

1.2.2 制膠

將0.3 g瓊脂糖粉末用50 mL電泳緩沖液(40 mmol/L Tris-乙酸,pH 7.8,0.1% SDS,1 mmol/L EDTA)混勻，微波爐中加熱至溶液澄清透明，然后將冷卻至55℃的瓊脂糖溶液從一側(cè)緩慢均勻倒入制膠器，插入梳子，待膠凝固后放入4℃冰箱30 min。

1.2.3 電泳

將解凍后的血漿樣本在4℃下14 000 r/min離心15 min，再用上樣緩沖液(65.8 mmol/L Tris-HCl,pH 6.8,2.1% SDS,26.3%甘油，0.01%溴酚藍(lán))按1∶20稀釋。每個(gè)加樣槽上樣量為10 μL。將電泳槽置于4℃冰箱中，30 mA恒定電流下運(yùn)行30 min后提高到50 mA，直到指示劑遷移到另一端，總過(guò)程約3.5 h。

1.2.4 轉(zhuǎn)印

從冰箱中取出提前配置好的轉(zhuǎn)印緩沖液(2.5 mmol/L Tris,19.2 mmol/L甘氨酸,20%無(wú)水甲醇,0.01% SDS,pH 8.8)，將電泳完的膠浸入轉(zhuǎn)印緩沖液中平衡15 min。為了活化 PVDF上面的正電基團(tuán)，使它更易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合，要提前將剪好的PVDF膜用甲醇浸泡1 min，純水沖洗后浸入轉(zhuǎn)印緩沖液中留用。同時(shí)要保證膜上無(wú)油脂類物質(zhì)，以免影響蛋白結(jié)合和抗體雜交。在轉(zhuǎn)印緩沖液中浸濕支撐保護(hù)PVDF膜和凝膠的黑色海綿和濾紙(美國(guó)BIO-RAD公司)，按照膠夾安裝順序組裝完成，將膠夾放置在轉(zhuǎn)印槽中，PVDF膜的一側(cè)朝向轉(zhuǎn)印槽的陽(yáng)極，凝膠則朝向轉(zhuǎn)印槽陰極。向槽中添加轉(zhuǎn)印緩沖液至刻度線，置于4℃冰箱中，在70 mA的恒定電流下過(guò)夜(運(yùn)行約15～17 h)。

1.2.5 vWF多聚體的免疫反應(yīng)

將轉(zhuǎn)印完的PVDF膜浸入40 mL封閉液(5%的脫脂奶粉，0.1% Tween 20，TBS緩沖液)1 h，室溫置于搖床上緩慢搖晃。使用0.1% TBS-T(0.1% Tween 20，TBS緩沖液)洗膜5次，先沖洗1次，再置于搖床上洗4次，每次10 min。再分別將一抗、二抗用抗體稀釋液(即封閉液)按1∶4 000和1∶2 000稀釋，室溫下孵育PVDF膜各1 h，0.1% TBS-T洗膜5次，方法同上。最后使用TBS洗液洗膜一次(置于搖床上10 min)以去除Tween的影響。

1.2.6 vWF多聚體的呈像與分析

采用化學(xué)發(fā)光法(ECL)，提前按照說(shuō)明配制好ECL發(fā)光液，保證發(fā)光液能夠全面覆蓋PVDF膜。在工作臺(tái)上鋪一張保鮮膜，倒上ECL發(fā)光液，再將PVDF膜倒扣在上面反應(yīng)1 min。將膜上多余的液體吸干，轉(zhuǎn)移到在X光片夾中用保鮮膜包裹。在暗室紅燈下剪裁3張比膜的長(zhǎng)和寬均大1 cm的 X光膠片蓋在膜上，壓緊曝光過(guò)夜。

曝光完成后，取出X光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時(shí)間一般為1～2 min(20～25℃)，溫度過(guò)低時(shí)(低于16℃)需適當(dāng)延長(zhǎng)顯影時(shí)間。顯影結(jié)束后，用純水沖掉X光片上的顯影液，迅速浸入定影液中，定影時(shí)間一般為5～10 min，以膠片透明為止。在室溫下晾干膠片，放置在觀片臺(tái)上用相機(jī)拍照或掃描至電腦中。將所得圖片導(dǎo)入ImageJ 軟件，選中需要分析的樣品區(qū)域，得到膠片選中區(qū)域的圖像灰度，該灰度值即與此區(qū)域中vWF含量成正比。將每個(gè)樣品的灰度值與初始樣品的灰度值作比較即可得出HMW-vWF的降解程度，從而分析得出在NPSS環(huán)境下，血液成分HMW-vWF的機(jī)械損傷情況。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了確保實(shí)驗(yàn)方法的通用性，作者進(jìn)行了多次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，本文僅選取了一組具有代表性的圖片進(jìn)行展示。

2.1 健康人血樣本測(cè)試結(jié)果

圖2即為所得的健康人血樣本vWF分子量分布圖像，條帶清晰完整且容易區(qū)分，從下往上，條帶中vWF多聚體的分子量依次升高。參照文獻(xiàn)[27]中的vWF多聚體條帶-分子量對(duì)照?qǐng)D，對(duì)圖2中的條帶進(jìn)行分區(qū)，其中低分子量區(qū)域?yàn)闂l帶1-2，對(duì)應(yīng)分子量為500～2 500 kDa；高分子量區(qū)域?yàn)闂l帶8以上，分子量大于5 500 kDa；介于兩區(qū)域之間的條帶3-7為中分子量區(qū)域，對(duì)應(yīng)分子量為3 000～5 000 kDa。從圖中可以看出，高分子量、中分子量、低分子量區(qū)域可以很容易地區(qū)分開，便于使用ImageJ軟件進(jìn)行樣品之間的定量分析比較。將圖像與文獻(xiàn)[18,19,28]中健康人血vWF的實(shí)際數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果基本一致，證明了該方法的可行性。

圖2 健康人血樣本vWF分子量分布Figure 2 Molecular weight distribution of vWF in healthy human blood sample

2.2 機(jī)械損傷前后豬血樣本測(cè)試結(jié)果

使用免疫印跡法對(duì)經(jīng)BPX-80血泵剪切前后的樣本進(jìn)行測(cè)試，圖3中1通道對(duì)應(yīng)BPX-80運(yùn)行5 min采集的第一個(gè)血樣，2-6通道分別對(duì)應(yīng)5 h測(cè)試周期中，每隔1 h 采樣的測(cè)試結(jié)果，由圖中可以看出經(jīng)血泵剪切之后的樣本與健康人血樣本一樣，條帶清晰完整，通過(guò)ImageJ軟件得出不同通道高分子量區(qū)域的灰度值，將1-6通道的灰度值與1通道的灰度值做比較即可得出HMW-vWF的剩余量(圖4)，分析出在NPSS環(huán)境下，血液成分HMW-vWF的機(jī)械損傷情況。

圖3 BPX-80剪切血樣中vWF多聚體條帶分布圖Figure 3 Distribution of vWF multimer for BPX-80 sheared

圖4中灰度值比值隨時(shí)間呈下降趨勢(shì)，這表明在血泵運(yùn)行期間，高剪切應(yīng)力會(huì)造成血液成分HMW-vWF的降解，使得HMW-vWF被剪切應(yīng)力破壞成為小分子，失去凝血功能。另外，從圖4還可以看出，灰度值比值在初始1 h內(nèi)下降較多(14%)，后續(xù)趨于穩(wěn)定，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束損失量一直維持在20% 左右。該數(shù)值的大小代表了HMW-vWF受高剪切應(yīng)力影響的降解量，可以用來(lái)衡量研發(fā)中的血泵對(duì)vWF的損傷程度，進(jìn)而評(píng)估血泵的性能，保證血泵的有效性和安全性。由于本研究的主要目的是探討vWF機(jī)械損傷測(cè)試方法的建立，因此課題組主要關(guān)注血泵剪切樣品的相對(duì)損傷程度，這個(gè)方法最直觀，后續(xù)還會(huì)進(jìn)行vWF活性測(cè)定，以和本方法相互驗(yàn)證。

圖4 各時(shí)間點(diǎn)樣品中高分子量vWF與0時(shí)刻樣品比值Figure 4 The ratio of HMW-vWF at each time point to the initial point

3 討論

3.1 測(cè)試血泵和血樣的討論

3.1.1 測(cè)試血泵的討論

目前，國(guó)際上很多新型血泵的研發(fā)中，常采用美國(guó)Medtronic公司的BPX-80和美國(guó)Abbott公司的CentriMag血泵來(lái)作為對(duì)照泵[23,29]。這兩種泵都是技術(shù)較為成熟、性能穩(wěn)定的體外離心泵，其中BPX-80是目前國(guó)內(nèi)唯一能買到的商品化心室輔助裝置，因此課題組選用BPX-80進(jìn)行vWF損傷的研究。

在之前的研究中，BPX-80主要用于ASTM標(biāo)準(zhǔn)化體外溶血實(shí)驗(yàn)的對(duì)照泵，本研究成功將其應(yīng)用到對(duì)vWF機(jī)械損傷的研究中，為后續(xù)更多相關(guān)實(shí)驗(yàn)，如vWF抗原總含量測(cè)定、vWF膠原結(jié)合活性測(cè)定等奠定基礎(chǔ)。

3.1.2 測(cè)試血樣的討論

在血樣的制備過(guò)程中，為了確保采樣的準(zhǔn)確性，需要舍棄采樣口附近的2 mL血樣。冰凍保存的樣本須注意避免反復(fù)凍融，反復(fù)凍融過(guò)程中產(chǎn)生的機(jī)械剪切力將對(duì)樣本中的蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生破壞作用，從而得出假陽(yáng)性結(jié)果。此外，融化樣本的混勻過(guò)程亦應(yīng)注意，不要?jiǎng)×艺袷?，反?fù)顛倒混勻即可。

3.2 電泳和轉(zhuǎn)印方案的討論

電泳是現(xiàn)在用于分離和純化生物大分子最常用的技術(shù)。轉(zhuǎn)印過(guò)程是將待測(cè)分子轉(zhuǎn)移到固相載體上，在轉(zhuǎn)印膠夾組裝過(guò)程中，按照膠夾安裝順序：黑色海綿-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-黑色海綿，逐層鋪在膠夾中，注意趕走氣泡。需保證兩張濾紙的長(zhǎng)、寬分別比膠小，而膜的長(zhǎng)、寬分別比膠大，避免上下兩層濾紙因?yàn)檫^(guò)大而相互接觸引起短路，影響轉(zhuǎn)印的完整性。

需要注意的是，在電泳和轉(zhuǎn)印的通電過(guò)程中，系統(tǒng)產(chǎn)熱使溫度升高，如果實(shí)驗(yàn)時(shí)間很長(zhǎng)容易燒膠，因此整個(gè)實(shí)驗(yàn)通電過(guò)程在 4℃ 冰箱中進(jìn)行。

3.3 vWF多聚體呈像方法的討論

免疫印跡的檢測(cè)方法分為熒光檢測(cè)法和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法，而熒光檢測(cè)法又可分為可見紅外檢測(cè)和近紅外熒光檢測(cè)。其中可見紅外檢測(cè)已經(jīng)被證實(shí)有很高的自發(fā)熒光，會(huì)降低檢測(cè)的靈敏度。近紅外熒光檢測(cè)背景較低，可以提高檢測(cè)的靈敏度，再結(jié)合其信號(hào)穩(wěn)定、定量準(zhǔn)確、動(dòng)態(tài)范圍廣等特點(diǎn)，已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外很多蛋白質(zhì)研究者的主流選擇?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)法是通過(guò)酶標(biāo)記的抗體和底物發(fā)生酶促動(dòng)力學(xué)反應(yīng)，然后利用暗室壓片或者化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行檢測(cè)。

在實(shí)驗(yàn)探索的過(guò)程中，作者嘗試使用近紅外熒光檢測(cè)法和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法兩種方法進(jìn)行vWF多聚體的呈像對(duì)比。其中熒光成像技術(shù)采用Odyssey近紅外熒光成像系統(tǒng)，依靠Image Studio軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析?；瘜W(xué)發(fā)光成像使用ECL發(fā)光液，在暗室中進(jìn)行壓片，根據(jù)結(jié)果調(diào)整曝光時(shí)間和曝光區(qū)域，得到最佳結(jié)果。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，近紅外熒光檢測(cè)法和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法都需要制膠、電泳、轉(zhuǎn)印、封閉和免疫反應(yīng)這些操作步驟。其差別在于在免疫反應(yīng)過(guò)程中抗體的標(biāo)記物不同，近紅外熒光檢測(cè)法使用熒光標(biāo)記抗體，而化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法則使用酶標(biāo)記抗體。

通過(guò)對(duì)比兩種檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，近紅外熒光檢測(cè)法所得到的圖像背景較高，條帶不清晰，后續(xù)分析計(jì)算比較困難。另外Odyssey近紅外熒光成像設(shè)備價(jià)格昂貴，后期需要定期維護(hù)，并且需要購(gòu)買特定熒光標(biāo)記的二抗。而化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果達(dá)到預(yù)期效果，并且該方法受實(shí)驗(yàn)條件的限制較少，只要設(shè)置一個(gè)暗室即可進(jìn)行，因此在之后的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中課題組沒有繼續(xù)探索完善近紅外熒光檢測(cè)法，而是選用化學(xué)發(fā)光法來(lái)實(shí)現(xiàn)vWF多聚體的呈像，如果后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要，課題組將會(huì)做進(jìn)一步的研究。對(duì)于沒有條件購(gòu)買紅外設(shè)備的實(shí)驗(yàn)室，建議采用化學(xué)發(fā)光法，價(jià)格低廉的同時(shí)完全滿足測(cè)試分析要求。

4 結(jié)論

本研究采用健康人血作為基礎(chǔ)血樣驗(yàn)證了免疫印跡法檢測(cè)vWF機(jī)械損傷的有效性?；谠摲椒ù罱ǖ臋z測(cè)平臺(tái)也成功定量檢測(cè)出了BPX-80血泵剪切對(duì)豬血中vWF的損傷情況。該檢測(cè)方法可用于對(duì)VAD的血液相容性評(píng)價(jià)，對(duì)于保證其安全性和有效性具有重要意義。文中明晰了實(shí)驗(yàn)方法和操作細(xì)節(jié)，希望供VAD研發(fā)和評(píng)價(jià)測(cè)試人員參考。