李選文，熊智，黃雨云，張珊，周藝萍，韋建福,4,熊忠平

(1.西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué) 繼續(xù)教育學(xué)院，云南 昆明 650224；3.西南林業(yè)大學(xué) 生物多樣性學(xué)院，云南 昆明 650224；4.云南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650500)

思茅松毛蟲(Dendrolimukikuchii)隸屬于鱗翅目(Lepidoptera)枯葉蛾科(Lasiocampidae)松毛蟲屬(Dendrolimus)，最早在云南思茅發(fā)現(xiàn)而命名[1]，主要分布在云南、四川、湖南、湖北、貴州等省[2]。思茅松毛蟲是我國(guó)危害松樹最為嚴(yán)重的6種松毛蟲之一，具有繁殖潛能大、數(shù)量波動(dòng)明顯、遷移能力強(qiáng)、暴食性明顯等特征[3]。當(dāng)其大面積爆發(fā)時(shí)，會(huì)使大量松科(Pinaceae)植物枯萎死亡，狀如火燒，嚴(yán)重影響相關(guān)地區(qū)的生態(tài)環(huán)境和林業(yè)產(chǎn)業(yè)，給當(dāng)?shù)厝藗兊纳a(chǎn)生活帶來(lái)極大不便[4]。2000年江西省萍鄉(xiāng)市蓮花縣，爆發(fā)過(guò)一次思茅松毛蟲災(zāi)害，導(dǎo)致濕地松(Pinuselliottii)的受災(zāi)面積達(dá)到522 hm2[5]。

近年來(lái)，對(duì)思茅松毛蟲的防治方法主要為營(yíng)林措施[6]、物理防治[6]、化學(xué)防治[7-8]以及生物防治[9]。但隨著化學(xué)藥品的使用，在思茅松毛蟲體內(nèi)產(chǎn)生了一定的抗藥性，因此，白僵菌(Beauvriabassiana)[9]、蘇云金桿菌(Bacillusthriengiensis)、病毒[10]等生物防治成為了新型的防治方式。隨著研究的進(jìn)展，昆蟲腸道微生物越來(lái)越成為研究的熱點(diǎn)[11]，越來(lái)越多種類的昆蟲腸道內(nèi)微生物的多樣性及其對(duì)寄主的生理功能也逐漸顯現(xiàn)，能夠應(yīng)用于害蟲防治、昆蟲資源的開發(fā)以及生物能源的生產(chǎn)等領(lǐng)域[12]。昆蟲腸道作為昆蟲重要的組成器官，承擔(dān)著昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育等重要的生命活動(dòng)。寄居在昆蟲腸道的微生物，一方面依賴?yán)ハx腸道提供能量，另一方面又參與了昆蟲的生命活動(dòng)[13-14]。

研究表明，大多數(shù)昆蟲腸道微生物包括了細(xì)菌、真菌和古細(xì)菌，而細(xì)菌是其中的優(yōu)勢(shì)菌群[15]。鱗翅目作為昆蟲中的第二大目，分布范圍極為廣泛，其數(shù)量約占昆蟲總量的16%，大多以農(nóng)林業(yè)害蟲為主，也包括少數(shù)具有傳粉能力和經(jīng)濟(jì)效益的昆蟲[16]。鱗翅目昆蟲食性多樣，腸道菌群會(huì)受到地域、氣候差異以及食物所攜帶的微生物的影響，從而導(dǎo)致腸道微生物種類與數(shù)量的差異[17-18]。林曉麗以小菜蛾(Plutellaxylostella)為研究對(duì)象，采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)法和DGGE電泳法研究其腸道微生物的多樣性，發(fā)現(xiàn)幼蟲腸道中分離到的細(xì)菌最多，且沙雷氏菌屬(Serratia)和假單胞菌屬(Pseudomonas)占優(yōu)勢(shì)地位[18]。

本實(shí)驗(yàn)以安寧地區(qū)采集回來(lái)健康的思茅松毛蟲6齡幼蟲為材料，采用純培養(yǎng)技術(shù)、形態(tài)學(xué)和16S rDNA序列對(duì)6齡幼蟲腸道細(xì)菌進(jìn)行初步的分離鑒定，探索思茅松毛蟲6齡幼蟲腸道細(xì)菌資源及其多樣性，為研究昆蟲腸道微生物的功能及對(duì)于思茅松毛蟲的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

思茅松毛蟲6齡幼蟲樣本(圖1)采自云南省安寧市草鋪鎮(zhèn)的云南松(Pinusyunnanensis)林內(nèi)(24°31′～25°6′ N，102°8′～102°37′ E，海拔1 913 m)。根據(jù)安寧市森林的情況，以安寧市權(quán)甫派出所為圓點(diǎn)，在方圓1 km2范圍內(nèi)隨機(jī)挑選10個(gè)樣品點(diǎn)，每個(gè)樣品點(diǎn)采集7頭健康的思茅松毛蟲6齡幼蟲，總計(jì)70頭，并連同6齡幼蟲所在的樹枝帶回實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。

圖1 思茅松毛蟲6齡幼蟲

1.2 分離培養(yǎng)基與試劑、儀器

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA)[19]：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水定容至1000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

培養(yǎng)基及生理生化鑒定所用分析純、化學(xué)純?cè)噭┚?gòu)自西隴化工股份有限公司，Ezup 柱式細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，PCR擴(kuò)增體系試劑購(gòu)自碩擎生物科技有限公司。

1.3 腸道細(xì)菌的分離純化

選取50頭健康的思茅松毛蟲6齡幼蟲，在恒溫22～24 ℃、恒濕80%～85%條件下，無(wú)菌水喂養(yǎng)幼蟲，40 h后待其排空體內(nèi)食物殘?jiān)筮M(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將思茅松毛蟲幼蟲置于冰上3～5 min，待其昏迷；采用70 %酒精擦拭蟲體表面30 s，0.25%次氯酸鈉沖泡1 min，無(wú)菌水沖洗3次；將體表消毒好的蟲子固定于無(wú)菌蠟盤上，在無(wú)菌環(huán)境下操作，使用滅菌后的細(xì)尖鉗將昆蟲腹部剖開，取出整個(gè)腸道，并立即用0.9%無(wú)菌NaCl溶液沖洗表面2次，然后將腸道取出后置于無(wú)菌離心管中，向離心管中加入1 mL PBS緩沖液研磨成勻漿，備用。

將上述腸道勻漿吸取1 mL置于9 mL PBS緩沖液中，稀釋成10-1，按照10的倍數(shù)梯度稀釋，制成10-2、10-3、10-4、10-5的稀釋液，吸取每個(gè)濃度稀釋液100 μL分別涂布于NA培養(yǎng)基中，每個(gè)梯度涂3個(gè)平板，作為實(shí)驗(yàn)組。取最后一次清洗的無(wú)菌水100 μL涂布于NA培養(yǎng)基上，作為空白對(duì)照。涂板均勻后將培養(yǎng)平板倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3 d后觀察空白對(duì)照是否有菌落形成，若無(wú)菌落長(zhǎng)出，則選擇單菌落數(shù)在30～300株的培養(yǎng)皿，根據(jù)涂有腸道內(nèi)容物懸液培養(yǎng)皿上的單菌落的不同特征，挑取單菌落至新的NA培養(yǎng)基平板上，采用分區(qū)劃線法進(jìn)行純化，直至菌株形態(tài)基本一致，得到純菌株。將得到的菌種保藏于NA斜面培養(yǎng)基中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 6齡幼蟲腸道可培養(yǎng)菌株的形態(tài)觀察

將經(jīng)分離純化得到的純菌株用平板劃線法接種于新的NA平板上，在37 ℃下培養(yǎng)24～48 h，待菌落長(zhǎng)成后，參考黃秀梨等[20]的方法對(duì)菌落進(jìn)行染色，并在顯微鏡下觀察菌株的形態(tài)，依據(jù)東秀珠等[21]的方法對(duì)其特征進(jìn)行描述鑒定。

1.5 6齡幼蟲腸道可培養(yǎng)菌株的生理生化鑒定

按照朱旭芬[22]、周德慶等[23]微生物生理生化鑒定的方法，對(duì)6齡幼蟲腸道細(xì)菌進(jìn)行生理生化鑒定。

1.6 6齡幼蟲腸道細(xì)菌16S rDNA分子鑒定

1.6.1 腸道細(xì)菌基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增

將1 mL過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌菌液按照Ezup 柱式細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒提取6齡幼蟲腸道細(xì)菌基因組DNA。提取出的細(xì)菌基因組DNA用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)，得到的片段符合細(xì)菌基因組DNA大小后，將檢測(cè)合格的DNA產(chǎn)物作為16S rDNA序列擴(kuò)增模板。擴(kuò)增引物[24]選擇：正向引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和反向引物1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR擴(kuò)增體系為：25.0 μL的2× Tap PCR MasterMix；3.0 μL的模板DNA；10.0 μmol/L 正向引物27F和反向引物1492R各1.0 μL；雙蒸水補(bǔ)充至50.0 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min，-20 ℃保存。取4.0 μL PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，將檢測(cè)合格的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.6.2 6齡幼蟲腸道細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

測(cè)得的序列通過(guò)DNA MAN6.0軟件進(jìn)行矯正及拼接，拼接完成后的16S rDNA序列在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/中與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，選出與菌株相似度最高的序列，運(yùn)用軟件MEGA 7.0構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹，判定其分類學(xué)關(guān)系。

1.7 分離率與群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

(1)分離率與相對(duì)分離率，分別衡量6齡幼蟲腸道細(xì)菌豐富度和某種6齡幼蟲腸道細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)度。分離率[25]指從樣品中分離得到的菌株數(shù)與全部樣本蟲數(shù)的比值；相對(duì)分離率指分離到的某種6齡幼蟲腸道細(xì)菌株數(shù)占分離到的總菌株數(shù)的百分率。

(2)群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

多樣性指數(shù)[26]的計(jì)算公式如下：

①

②

Margalef豐富度指數(shù)Ma=(S-1)/lnN

③

式中，S表示某個(gè)6齡幼蟲腸道細(xì)菌的種類數(shù)，N表示某個(gè)6齡幼蟲腸道細(xì)菌的總量，Pi表示某種6齡幼蟲腸道細(xì)菌的相對(duì)分離率。

2 結(jié)果與分析

2.1 幼蟲腸道細(xì)菌的種類及數(shù)量

從50頭6齡思茅松毛蟲的幼蟲腸道中共分離得到104株細(xì)菌，分離率達(dá)208.00%。根據(jù)菌落的形態(tài)特征共有14個(gè)類群，整理編號(hào)得：N601～N614。

2.2 幼蟲腸道細(xì)菌的形態(tài)特征

對(duì)分離得到的14株細(xì)菌的菌落特征(圖2)與革蘭氏染色結(jié)果(圖3)進(jìn)行觀察，結(jié)果見表1。14株菌株中多數(shù)菌株的革蘭氏染色結(jié)果呈陽(yáng)性，僅有4株呈陰性。且大部分菌株為桿狀，僅有N608、N613為球狀；大部分菌株邊緣整齊，只有N601、N610、N612的邊緣呈鋸齒狀；N606和N607在固體培養(yǎng)基上半透明，其他菌株的菌絲體都是不透明的。

表1 6齡幼蟲腸道細(xì)菌的菌落形態(tài)特征

圖2 6齡幼蟲部分腸道細(xì)菌菌落形態(tài)特征注:a為N602,b為N605,c為N607,d為N608,e為N610,f為N611。Fig.2 Colonymorphologyobservationofsomeintestinalbacteriain6thinstarlarvae圖3 幼蟲部分腸道細(xì)菌的顯微形態(tài)(100×)注:a為N602,b為N607,c為N605,d為N610,e為N608,f為N611。Fig.3 Micromorphologyofsomeintestinalbacteriainlarvae(100×)

2.3 幼蟲腸道細(xì)菌生理生化鑒定及多樣性分析

幼蟲腸道細(xì)菌生理生化鑒定及多樣性分析見表2。

表2 6齡幼蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的生理生化特征

經(jīng)過(guò)對(duì)生理生化指標(biāo)的聚類分析可知，在歐式距離4左右處，可將14個(gè)細(xì)菌類群劃分為2個(gè)遺傳聚類組，N613自成一類，其他13個(gè)細(xì)菌類群為一類，其中N614、N610、N609、N606、N611、N604屬于一類，N608、N607、N612、N603、N602、N605、N601屬于一類，見圖4。

圖4 菌株生理生化聚類

結(jié)合生理生化指標(biāo)(表2、圖4)、細(xì)菌的形態(tài)特征(圖2)、菌落(圖3)及顯微形態(tài)特征(表1)，查詢細(xì)菌鑒定手冊(cè)后，將分離到的14種細(xì)菌形態(tài)，初步鑒定為：N601、N602、N603、N607和N612均屬于芽孢桿菌屬(Bacillussp.)，N604為類芽孢桿菌屬(Paenibacillussp.)，N605為蒼白桿菌屬(Ochrobactrumsp.)，N606為短芽孢桿菌屬(Brevibacillussp.)，N608為微球菌屬(Micrococcussp.)，N609為莫拉菌屬(Moraxellasp.)，N610為棲水菌屬(Enhydrobactersp.)，N611為土壤芽孢桿菌屬(Solibacillusp.)，N613為葡萄球菌屬(Staphylococcussp.)，N614為普羅威登斯菌屬(Providenciasp.)。部分菌株因?yàn)榫N形態(tài)過(guò)于相似，需進(jìn)一步進(jìn)行后續(xù)分子生物學(xué)鑒定。

從思茅松毛蟲6齡幼蟲腸道細(xì)菌的相對(duì)分離比率(表1)可以看出，104株6齡幼蟲腸道細(xì)菌中，芽孢桿菌屬(Bacillussp.)(N601、N602、N603、N607和N612)相對(duì)分離率為53.00%，是思茅松毛蟲6齡幼蟲腸道中細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群。另外，思茅松毛蟲6齡幼蟲腸道細(xì)菌的Shannon多樣性指數(shù)、Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)、Margalef豐富度指數(shù)分別為2.521 7、0.912 9、2.799 1，說(shuō)明思茅松毛蟲6齡幼蟲腸道中的細(xì)菌具有豐富的多樣性。

2.4 6齡幼蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌16S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

分離純化的思茅松毛蟲6齡幼蟲腸道細(xì)菌的基因組DNA，檢測(cè)合格后，通過(guò)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其PCR擴(kuò)增條帶均在1 500 bp左右，條帶清晰(圖5)。

圖5 思茅松毛蟲幼蟲腸道中可培養(yǎng)細(xì)菌16S rDNA PCR的電泳條帶

2.5 幼蟲腸道中可培養(yǎng)細(xì)菌16S rDNA序列

將所獲14種細(xì)菌形態(tài)6齡幼蟲腸道細(xì)菌16S rDNA序列在GenBank中注冊(cè)，獲得GenBank登錄號(hào)(表3)，分離到的6齡幼蟲腸道細(xì)菌與相應(yīng)菌株的16S rDNA序列相似度在97%-100%之間。從表3看，這104株細(xì)菌隸屬于10個(gè)屬，14個(gè)類群，初步鑒定為：N601為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，N602為空氣芽孢桿菌(Bacillusaerius)，N603為高地芽孢桿菌(Bacillusaltitudinis)，N604為帕薩迪娜類芽孢桿菌(Paenibacilluspasadenensis)，N605為人蒼白桿菌(Ochrobactrumanthropi)，N606為土壤短芽孢桿菌(Brevibacillusagri)，N607為甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)，N608為藤黃微球菌(Micrococcusluteus)，N609為奧斯陸莫拉菌(Moraxellaosloensis)，N610為棲水菌屬(Enhydrobactersp.)，N611為森林土壤芽孢桿菌(Solibacillussilvestris)，N612為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)，N613為頭狀葡萄球菌(Staphylococcuscapitis)，N614為雷氏普羅威登斯菌(Providenciarettgeri)。這些思茅松毛蟲6齡幼蟲腸道細(xì)菌均不能夠確定其真正的種屬地位，還需要做進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)以鑒定其分類學(xué)地位。

表3 思茅松毛蟲幼蟲腸道中細(xì)菌GenBank登錄號(hào)及最大相似菌株

2.6 系統(tǒng)發(fā)育樹

將6齡幼蟲腸道細(xì)菌的16S rDNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6)。思茅松毛蟲6齡幼蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌歸屬于3個(gè)大類，第一大類為厚壁菌門(Firmicutes)，分別為：芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、短芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬、土壤芽孢桿菌屬；第二大類為放線菌門(Actinobacteria)，為微球菌屬；第三大類為變形菌門(Proteobacteria)，分別為：蒼白桿菌屬、莫拉菌屬、棲水菌屬、普羅威登斯菌屬。

圖6 基于16S rDNA序列構(gòu)建6齡幼蟲腸道細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(鄰接法)

3 討論與結(jié)論

思茅松毛蟲嚴(yán)重危害云南松等松科(Pinaceae)植物，對(duì)林業(yè)造成巨大的損失，對(duì)人畜造成傷害，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類生活造成了巨大的影響。本研究以6齡思茅松毛蟲幼蟲為材料，通過(guò)對(duì)其腸道可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行一系列的菌落觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA同源性分析，共分離得到104 株腸道可培養(yǎng)細(xì)菌，初步推測(cè)隸屬于10個(gè)屬，14個(gè)類群。通過(guò)對(duì)腸道細(xì)菌的相對(duì)分離率進(jìn)行分析，芽孢桿菌屬的相對(duì)分離率最高為53.00%，是6齡思茅松毛蟲幼蟲腸道細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌屬。通過(guò)對(duì)其多樣性進(jìn)一步分析，得到思茅松毛蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌具有豐富的多樣性。

昆蟲腸道是昆蟲重要的發(fā)育部分，承擔(dān)起昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育等重要活動(dòng)[12]。而寄居在昆蟲腸道中的微生物對(duì)昆蟲腸道提供營(yíng)養(yǎng)，參與了昆蟲的生長(zhǎng)代謝；通過(guò)增強(qiáng)昆蟲的免疫和提高定殖抗力，保護(hù)昆蟲不受外界侵害[14]。另一方面，昆蟲為微生物提供了一個(gè)生存環(huán)境，當(dāng)寄居在腸道中的某種微生物的數(shù)量發(fā)生變化后，宿主內(nèi)的腸道微生態(tài)環(huán)境也會(huì)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致宿主健康受到影響[13]，二者是相互聯(lián)系的，這為研究微生物殺蟲劑奠定了基礎(chǔ)。

課題組前期已對(duì)采自普洱市寧洱縣磨黑鎮(zhèn)健康的思茅松毛蟲6齡幼蟲做了關(guān)于腸道細(xì)菌的研究[27]，研究表明，采自寧洱縣的6齡幼蟲腸道細(xì)菌共分離得到6種細(xì)菌，隸屬于芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、克雷伯氏桿菌屬(Klebsiellasp.)2個(gè)屬，而采自安寧地區(qū)的6齡幼蟲分離到104株腸道細(xì)菌，隸屬于10個(gè)屬，14個(gè)類群。2個(gè)地點(diǎn)采集的6齡幼蟲都分離到了芽孢桿菌，這說(shuō)明其可能是思茅松毛蟲6齡幼蟲的腸道優(yōu)勢(shì)菌屬，說(shuō)明不同地區(qū)的思茅松毛蟲具有相同的優(yōu)勢(shì)菌種，但也有不同的菌種。

細(xì)菌最適生長(zhǎng)pH在6～7之間，但鱗翅目幼蟲中腸pH卻高達(dá)11～12[27]，極端堿性條件不利于絕大多數(shù)細(xì)菌的生長(zhǎng)[29]，腸球菌(Enterococcussp.)卻能在此生長(zhǎng)，說(shuō)明腸球菌可能以某種方式降低了pH，能緩沖腸道極端pH[30]，以適合腸道中大部分的腸道細(xì)菌生存。本研究通過(guò)對(duì)6齡幼蟲的腸道細(xì)菌分離得到了14個(gè)類群的細(xì)菌(包含球菌)，這為防治思茅松毛蟲提供了依據(jù)。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，可以通過(guò)宏基因?qū)W技術(shù)[31-32]不依賴純培養(yǎng)直接對(duì)腸道細(xì)菌的總DNA進(jìn)行提取，進(jìn)而分析出整個(gè)腸道的細(xì)菌種類，為研究昆蟲的腸道微生物資源庫(kù)提供全面的研究基礎(chǔ)。因此，通過(guò)純培養(yǎng)技術(shù)分離得到的6齡幼蟲腸道細(xì)菌只是其中很少的一部分，需要結(jié)合宏基因組技術(shù)，才能得到較為全面的細(xì)菌類群。

思茅松毛蟲是林業(yè)重要的害蟲，對(duì)其腸道微生物的研究，不僅可以補(bǔ)充昆蟲腸道微生物資源庫(kù)，還可以據(jù)此進(jìn)一步分析腸道細(xì)菌對(duì)昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育的影響，最終得到防治思茅松毛蟲的生物制劑，從而減少林業(yè)害蟲的危害。