滕春紅，馮曦茹，徐永清，譚洪鶴，馬藝倩，陶 波*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

我國(guó)是世界農(nóng)藥生產(chǎn)大國(guó)也是農(nóng)藥應(yīng)用大國(guó)，化學(xué)除草是農(nóng)田雜草防治中的主要手段。大量使用化學(xué)除草劑導(dǎo)致除草劑藥效降低、用藥量增加、雜草抗藥性嚴(yán)重。截至2020年3月9日，全球總計(jì)有262種雜草對(duì)已知26種作用機(jī)制中的23種作用機(jī)制的除草劑產(chǎn)生了抗藥性?；瘜W(xué)除草劑在使用過(guò)程中也會(huì)對(duì)環(huán)境和人類(lèi)健康產(chǎn)生威脅[1,2]。

與化學(xué)除草劑相比，植物源除草劑不僅對(duì)環(huán)境友好，而且往往具有新穎的靶標(biāo)和作用機(jī)制[3]。目前，已經(jīng)有30個(gè)科的2000多種植物被報(bào)道含有具有除草活性的次生代謝物質(zhì)[4]，其中有些已被成功開(kāi)發(fā)為除草劑，如環(huán)庚草醚、假蒟亭堿等[5-7]。這些天然物質(zhì)能夠影響植物的萌發(fā)、生長(zhǎng)發(fā)育及密度和分布，是研發(fā)植物源除草劑的重要庫(kù)源之一[8]。廣泛篩選植物中有除草活性的天然產(chǎn)物，作為農(nóng)藥先導(dǎo)結(jié)構(gòu)的重要來(lái)源，進(jìn)行結(jié)構(gòu)衍生及優(yōu)化，已成為新農(nóng)藥創(chuàng)制研究的前沿與熱點(diǎn)領(lǐng)域，也是獲得具有良好的環(huán)境相容性農(nóng)藥的有效途徑之一[9]。

黃花蒿ArtemisiaannuaLinn.為菊科蒿屬一年生草本植物，具有很強(qiáng)的生境適應(yīng)性。黃花蒿在生長(zhǎng)過(guò)程中不斷釋放除草活性物質(zhì)抑制其他植物或雜草的萌發(fā)和生長(zhǎng)，因而在它們所形成的群落中，很少有其他植物或雜草生長(zhǎng)。目前已從黃花蒿中分離得到多種化合物，這些化學(xué)物質(zhì)在環(huán)境中易降解，對(duì)人、畜低毒，符合綠色環(huán)保新型除草劑開(kāi)發(fā)的要求，可進(jìn)一步合成植物源除草劑。

沈慧敏等[10]研究表明黃花蒿水抽提物對(duì)指示植物蘿卜、黃瓜、小麥和玉米的株高及鮮重具有抑制作用。趙紅梅等[11]采用GC-MS聯(lián)用儀從黃花蒿揮發(fā)油中分離鑒定出56種化合物。

為了進(jìn)一步明確黃花蒿化感物質(zhì)在雜草防除中的作用，本試驗(yàn)采用室內(nèi)生物測(cè)定法對(duì)黃花蒿葉醇提物的除草活性進(jìn)行測(cè)定，采用系統(tǒng)溶劑分離和柱層析分離法對(duì)黃花蒿除草活性物質(zhì)進(jìn)行分離，通過(guò)生物活性示蹤測(cè)定出除草活性最強(qiáng)的流份，并利用氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）對(duì)樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，初步確定黃花蒿除草活性物質(zhì)的主要成分。

1 材料與方法

1.1 供試植物

黃花蒿ArtemisiaannuaLinn.于6月采于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)校園，采集后將根、莖和葉分開(kāi)，置于陰涼處，粉粹后密封保存。

受體植物：蘿卜RaphanussativusL.種子。

供試雜草：反枝莧AmaranthusretroflexusL.、苘麻AbutilontheophrastiMedic.、狗尾草Setariaviirdis(L.)Beauv.和稗Echinachlaocrusgali(L.) Beauv.采自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)校園。

1.2 供試儀器設(shè)備

主要儀器設(shè)備：GC-2010型氣相色譜儀，GCMS-QP2010型質(zhì)譜儀，WND-400A型中藥粉粹機(jī)，RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，THC-5B型超聲波提取器，LRH-250-G型隔水式恒溫光照培養(yǎng)箱，培養(yǎng)皿，剪刀，研缽等。

1.3 黃花蒿除草活性物質(zhì)的提取

稱(chēng)取20.0 g采集于6月的蒿葉部干粉，按照1:20質(zhì)量比加入400 mL的80%乙醇，超聲功率800 w，超聲提取溫度50 ℃，超聲提取3次合并濾液，抽濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至膏狀，得黃花蒿葉醇提物[12,13]，于4 ℃冰箱中保存用于生物測(cè)定。

1.4 黃花蒿化感除草活性的生物測(cè)定方法

稱(chēng)取一定量的黃花蒿葉醇提物，以蒸餾水為溶劑，配制成0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 g/L的溶液，以蘿卜為指示植物，采用種子萌發(fā)法，進(jìn)行除草活性測(cè)定[12-15]。每個(gè)處理設(shè)置4次重復(fù)。在人工智能培養(yǎng)箱中（25±1）℃恒溫保濕光照培養(yǎng)，光照12 h（7：00～19：00），黑暗12 h。120 h后計(jì)算對(duì)蘿卜種子萌發(fā)的抑制率、根長(zhǎng)的抑制率、根鮮質(zhì)量的抑制率和綜合抑制效應(yīng)。

以稗、狗尾草、反枝莧和苘麻為受體，方法同上，向每個(gè)培養(yǎng)皿中播入30粒雜草種子，分別加入5 mL濃度為5.0 mg/mL黃花蒿葉醇提物。雜草種子在生測(cè)前進(jìn)行滅菌消毒，之后分別加入蒸餾水催芽直至露白。7 d后計(jì)算對(duì)雜草種子萌發(fā)的影響。

1.5 黃花蒿化感除草活性物質(zhì)的分離與鑒定

黃花蒿葉部乙醇提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至膏狀，將浸膏溶解于蒸餾水，配制成一定濃度溶液。按極性遞增的順序依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇三種有機(jī)溶劑，按照有機(jī)溶劑與萃取溶液1:1等體積比萃取3次，合并3次相同溶劑的萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。稱(chēng)量一定量的黃花蒿葉醇提物用蒸餾水溶解，配制成2.0 mg/mL的溶液，重復(fù)處理和培養(yǎng)方式同1.4。72 h后測(cè)定黃花蒿葉醇提物對(duì)蘿卜種子萌發(fā)的影響。

黃花蒿葉醇提物依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇三種有機(jī)溶劑萃取后進(jìn)行生物活性追蹤，得到的抑制效果最好的石油醚層溶解后點(diǎn)樣，根據(jù)其在薄層板上的 Rf（比移值）大小確定最佳洗脫溶劑，直至Rf值在0.2～0.8時(shí)選擇此時(shí)的展開(kāi)劑作為柱色譜相應(yīng)組分的最佳溶劑。

玻璃柱規(guī)格100 cm×5 cm，選擇100～200目的硅膠作為固定相，將除去氣泡的混均后的硅膠與洗脫液加入玻璃柱內(nèi)，液面稍高于硅膠表面時(shí)關(guān)閉活塞，然后將多余的洗脫液放出至頂部以保持1 cm高的液面時(shí)關(guān)閉活塞。

1.5.1 加樣 取適量黃花蒿葉醇提物浸膏，用少量極性稍大的有機(jī)溶劑溶解。將其溶解后加入吸附劑約為樣品的6倍量拌勻，在45 ℃～55 ℃條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器儀將其濃縮成干粉后加入到柱色譜的頂端，使樣品帶盡量保持平整，且在加完樣品后放一塊圓形濾紙。

1.5.2 洗脫 將Rf值在0.2～0.8時(shí)的溶劑作為柱色譜相應(yīng)組分的洗脫溶劑。用前期已選好的最佳洗脫劑，通過(guò)分液漏斗向玻璃柱中加入，打開(kāi)活塞開(kāi)關(guān)后讓洗脫劑慢慢地滴入，使流速保持速度為4滴/s，每錐形瓶一次收集50 mL洗脫液。根據(jù)TCL分析的結(jié)果進(jìn)行合并。

1.5.3 薄層層析板的制備 參照Leather GR[16]的方法制備薄層層析板。

1.5.4 展開(kāi)劑的制備 展開(kāi)劑是洗脫劑的3.5倍量。展開(kāi)劑所用的試劑與洗脫劑相同。

1.5.5 點(diǎn)樣 使用毛細(xì)管吸取樣品點(diǎn)樣后用電吹風(fēng)將其吹干并將薄層層析板放入展開(kāi)劑中，溶劑前沿到距頂部約為1 cm時(shí)取出放于碘瓶中，待10 s左右即可以觀察到展開(kāi)的結(jié)果和變化。

洗脫液使用不同體積比的石油醚:氯仿:甲醇（90:10:3、70:10:3、50:10:3、30:10:3、10:10:3）梯度淋洗且等體積50 mL/份，每個(gè)梯度收集6份共獲33個(gè)流分，編號(hào)然后對(duì)所獲流份采用生物測(cè)定跟蹤確定其活性強(qiáng)度[17]。

經(jīng)過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，分離獲得的流份用乙醇稀釋?zhuān)脷赓|(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行定性分析。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析條件為：初始溫度為50 ℃并保持3 min，以10 ℃/min速率升至280 ℃后保持3 min，柱箱溫度50 ℃、進(jìn)樣量1.0 μL、進(jìn)樣口和檢測(cè)器的溫度均280 ℃、掃描間隔為0.5 s、溶劑延遲時(shí)間3.5 min、掃描質(zhì)量范圍5～400 Amu[18,19]。

流份經(jīng)GC-MS檢測(cè)后，對(duì)其總離子的流量圖中出現(xiàn)的峰進(jìn)行質(zhì)譜掃描，得到的質(zhì)譜圖采用質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似度檢索，人工譜圖進(jìn)行解析，按照每個(gè)色譜峰的質(zhì)譜裂片圖與相關(guān)的文獻(xiàn)進(jìn)行核對(duì)，同時(shí)查閱有關(guān)質(zhì)譜的資料，將其基峰、質(zhì)荷比和相對(duì)豐度等與標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行對(duì)照比較，從而確定出樣品中的所有化合物的名稱(chēng)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行整理，采用DPS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。綜合抑制率（SE）是提取物對(duì)蘿卜3個(gè)測(cè)試項(xiàng)目(萌發(fā)、根長(zhǎng)、芽長(zhǎng))的抑制百分率的算術(shù)平均值[20]。萌發(fā)抑制率（%）＝（對(duì)照發(fā)芽數(shù)—處理發(fā)芽數(shù)）/對(duì)照發(fā)芽數(shù)×100；根長(zhǎng)抑制率（%）＝（對(duì)照根長(zhǎng)—處理根長(zhǎng)）/對(duì)照根長(zhǎng)×100；芽長(zhǎng)抑制率（%）＝（對(duì)照芽長(zhǎng)—處理芽長(zhǎng)）/對(duì)照芽長(zhǎng)×100；發(fā)芽率（GR%）＝7 d內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)；發(fā)芽勢(shì)（CE%）＝3 d內(nèi)正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)；發(fā)芽指數(shù)（GI）＝Σ（Gt/Dt），Gt表示在第t天種子的發(fā)芽數(shù)，Dt代表相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃花蒿葉醇提物對(duì)蘿卜種子萌發(fā)的影響

黃花蒿葉醇提物對(duì)蘿卜種子萌發(fā)的影響如圖1所示。從圖中計(jì)算出黃花蒿葉醇提物對(duì)蘿卜葉萌發(fā)抑制率的ED50＝0.75 mg/mL，ED90＝1.4 mg/mL，參考此濃度來(lái)設(shè)定對(duì)雜草影響的劑量。黃花蒿葉醇提物對(duì)蘿卜種子萌發(fā)抑制率的R2為0.9827，說(shuō)明黃花蒿葉醇提物對(duì)蘿卜種子萌發(fā)的抑制作用比較明顯，因此，蘿卜可作為下一步除草活性物質(zhì)分離的活性示蹤指示植物。

圖1 黃花蒿葉醇提物對(duì)蘿卜種子萌發(fā)的影響Fig.1 The effect of the ethanol extract of A.annua L.on radish seed germination

2.2 黃花蒿葉醇提物對(duì)不同供試雜草萌發(fā)的影響

黃花蒿葉醇提物對(duì)不同雜草萌發(fā)的影響如表 1所示。從表中可以看出，5.0 mg/mL濃度下，黃花蒿葉醇提物對(duì)雜草的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)均有一定的抑制作用，抑制作用從大到小的順序?yàn)榉粗η{，苘麻，狗尾草，稗，其中對(duì)反枝莧發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)的抑制作用最強(qiáng)，對(duì)稗發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)的抑制作用最弱，但對(duì)稗發(fā)芽勢(shì)的抑制作用較強(qiáng)。黃花蒿葉醇提物對(duì)反枝莧、苘麻、狗尾草和稗發(fā)芽率的抑制率分別為90.09%、85.79%、85.46%和14.23%；對(duì)反枝莧、苘麻、狗尾草和稗發(fā)芽勢(shì)的抑制率分別為96.71%、89.47%、84.63%和73.36%；對(duì)反枝莧、苘麻、狗尾草和稗發(fā)芽指數(shù)的抑制率分別為95.00%、88.62%、86.69%和17.10%。

表1 黃花蒿葉醇提物對(duì)不同雜草萌發(fā)的影響Table 1 Effect of leaves of the ethanol extract of A.annua L.on different weed seed germination

2.3 黃花蒿葉醇提物的系統(tǒng)溶劑分離

2 mg/mL的石油醚相對(duì)蘿卜種子的萌發(fā)抑制率為 90.91%，高于乙酸乙酯相和正丁醇相的萌發(fā)抑制率50.22%和19.18%（表2）。三種萃取液對(duì)根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)的抑制率均為石油醚相高于乙酸乙酯相和正丁醇相。石油醚相對(duì)蘿卜種子萌發(fā)的抑制效果最好，由此說(shuō)明黃花蒿中的除草活性物質(zhì)在石油醚層中溶解較多?？赏ㄟ^(guò)對(duì)黃花蒿葉部乙醇提取液石油醚萃取層的成分分離，確定其除草活性物質(zhì)的主要活性成分，進(jìn)一步驗(yàn)證主要活性成分的除草活性，并進(jìn)行盆栽和田間藥效試驗(yàn)，確定其除草活性物質(zhì)是否可能開(kāi)發(fā)成新型除草劑。

表2 黃花蒿不同萃取液對(duì)蘿卜萌發(fā)和生長(zhǎng)的影響Table 2 Effect of different extract of A.annua L.on Raphanus sativus germination and seedling growth

2.4 黃花蒿除草活性物質(zhì)的分離

以蘿卜種子作為指示植物，對(duì)黃花蒿葉醇提物的石油醚相的 33個(gè)流份進(jìn)行除草活性的生物測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3，從表中可以看出，6號(hào)流份對(duì)蘿卜種子的活性明顯高于其他的流份，0.01 mg/mL的6號(hào)流份對(duì)蘿卜種子萌發(fā)、芽長(zhǎng)和根長(zhǎng)的抑制率分別為60.23%、65.78%和71.67%，綜合抑制率為65.90%。因而可以確定主要有效除草活性成分在6號(hào)流份樣品中，因此鑒定檢測(cè)該流份。

表3 黃花蒿中分離出的除草活性物質(zhì)對(duì)蘿卜種子萌發(fā)和生長(zhǎng)的抑制率Table 3 Inhibition ratio of the herbicidal activity substances separated from A.annua to germination and growth of R.sativus seeds

2.5 6號(hào)樣品GC-MS鑒定檢測(cè)結(jié)果

采用GC-MS對(duì)6號(hào)樣品進(jìn)行成分分析，對(duì)其總離子流量圖中出現(xiàn)的峰進(jìn)行質(zhì)譜掃描，將其基峰、質(zhì)荷比和相對(duì)豐度等與標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行對(duì)照比較確定出樣品中化合物的名稱(chēng)。

6號(hào)樣品的總離子流量圖如圖2所示。6號(hào)流份的GC-MS峰信息表如表4所示，從表4可以看出，6號(hào)流份共檢測(cè)出17種有機(jī)化合物（僅列出匹配度在80以上的物質(zhì)），其中主要成分為青蒿酸和亞油酸等，對(duì)應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為C15H22O2和C18H32O2，相對(duì)含量分別為11.45%和6.49%。

圖2 6號(hào)樣品的總離子流量圖Fig.2 GC-MS result of sample 6

表4 6號(hào)流份的GC-MS峰信息表Table 4 GC-MS peaks information of 6

3 討論

本研究結(jié)果表明，黃花蒿葉醇提物5.0 mg/mL對(duì)供試雜草反枝莧、苘麻、狗尾草和稗的發(fā)芽勢(shì)均有很強(qiáng)的抑制作用，對(duì)反枝莧發(fā)芽勢(shì)的抑制作用最強(qiáng)，達(dá)到 96.71%，對(duì)苘麻、狗尾草和稗發(fā)芽勢(shì)的抑制率也超過(guò)了73%，這說(shuō)明黃花蒿葉醇提物可以延緩雜草的發(fā)芽時(shí)間，從而減輕對(duì)作物的競(jìng)爭(zhēng)。黃花蒿葉醇提物5.0 mg/mL對(duì)供試雜草反枝莧、苘麻、狗尾草發(fā)芽率的抑制作用也較強(qiáng)，均超過(guò)了85%，這說(shuō)明黃花蒿葉醇提物對(duì)雜草萌發(fā)產(chǎn)生了明顯的抑制作用。黃花蒿葉醇提物可以通過(guò)延緩雜草的發(fā)芽時(shí)間和減少發(fā)芽率來(lái)減輕對(duì)作物的競(jìng)爭(zhēng)，具備開(kāi)發(fā)為新型植物源除草劑的潛力。

本研究將黃花蒿葉醇提物分離得到的流份進(jìn)行GC-MS檢測(cè)，共鑒定出17種主要化合物，主要成分為青蒿酸（11.45%）、亞油酸（6.49%）、鄰苯二甲酸二乙酯（4.62%）、二氫獼猴桃內(nèi)酯（4.12%）、十八烷酸（2.84%）和香草酸（0.43%）等萜類(lèi)、酚類(lèi)、醇類(lèi)、酯類(lèi)、烷烴類(lèi)和有機(jī)酸類(lèi)等化合物。分離出來(lái)的化合物中，亞油酸、鄰苯二甲酸二乙酯和香草酸均已有文獻(xiàn)報(bào)道其具有化感除草作用[21-24]。而青蒿素、二氫獼猴桃內(nèi)酯和十八烷酸均屬于化感物質(zhì)，但關(guān)于其除草活性的報(bào)道較少[25-28]，是否具有化感除草活性需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。黃翔杰等[24]研究表明野菊根系分泌物中的鄰苯二甲酸二乙酯對(duì)生菜鮮重、萵苣和油菜胚根生長(zhǎng)具有化感作用。陳芝蘭[31]研究表明鳳眼蓮根可顯著抑制赤潮藻的生長(zhǎng)，亞油酸是鳳眼蓮根抑藻的主要因子之一；其抑藻機(jī)理可能是通過(guò)自由基反應(yīng)，破壞藻細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到抑藻效果。在接下來(lái)的研究中計(jì)劃購(gòu)買(mǎi)亞油酸、鄰苯二甲酸二乙酯、香草酸、青蒿素、二氫獼猴桃內(nèi)酯和十八烷酸的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行室內(nèi)生測(cè)試驗(yàn)，鑒定這些化合物是否具有除草活性，并確定活性最強(qiáng)的成分。然后將除草活性最強(qiáng)的成分進(jìn)行人工模擬合成，用于溫室盆栽試驗(yàn)和田間試驗(yàn)，為研發(fā)新的植物源除草劑鑒定基礎(chǔ)。