馬名川 劉龍龍 劉 璋 周建萍 南成虎 張麗君

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)基因資源研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室/雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點實驗室，030031，山西太原）

苦蕎（Fagopyrum tartaricum L. Gertn）屬蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum Mill），起源于我國，主要分布在我國西南地區(qū)和高海拔地區(qū)[1]。苦蕎具有生育期短、抗逆性強、耐旱和耐瘠薄等特性，可作為應(yīng)對干旱形勢的備荒作物[2]?？嗍w營養(yǎng)全面，尤其富含一般作物沒有的蘆丁和槲皮素等黃酮類物質(zhì)，具有降糖降脂和抗氧化等功效，使其成為集營養(yǎng)、保健和治療于一體的“食藥兼用”的珍品[3]。

簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）也稱微衛(wèi)星DNA（microsatellites DNA），是一類由1～6個核苷酸為單位在基因組中多次串聯(lián)重復(fù)的DNA序列[4]。SSR分子標(biāo)記數(shù)量豐富、多態(tài)性高、共顯性，并且具有成本低和操作簡便等優(yōu)點，在植物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位與克隆等方面得到廣泛應(yīng)用，是目前最常用的分子標(biāo)記技術(shù)之一[5]。

與水稻、小麥、玉米和大豆等主要作物相比，蕎麥分子標(biāo)記方面的研究起步較晚。從利用AFLP[6-8]、RAPD[9-12]和SRAP[13]等第一代分子標(biāo)記進(jìn)行蕎麥的分子遺傳分析，到開始利用SSR分子標(biāo)記分析蕎麥遺傳多樣性、構(gòu)建核心種質(zhì)和繪制連鎖圖譜，蕎麥的分子標(biāo)記研究已經(jīng)取得了一些進(jìn)展。Iwata等[6]開發(fā)的5對SSR標(biāo)記在日本甜蕎中具有較高的多態(tài)性。Konishi等[14]用開發(fā)的54對SSR引物對甜蕎居群的遺傳變異進(jìn)行檢測。Ma等[15]開發(fā)了136對SSR引物，其中10對效應(yīng)顯著，41對可有效鑒別栽培蕎麥和野生蕎麥的親緣關(guān)系；Li等[16]創(chuàng)新了SSR引物設(shè)計方法，開發(fā)了4對苦蕎SSR引物，效果良好；高帆等[17]構(gòu)建了我國苦蕎的SSR標(biāo)記體系；韓瑞霞等[18]在苦蕎中開發(fā)了28對多態(tài)性較好的引物；石桃雄等[19]基于甜蕎的轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)SSR標(biāo)記，篩選到12對多態(tài)性引物；黎瑞源等[20]基于苦蕎轉(zhuǎn)錄組序列設(shè)計合成了150對引物，其中30對具有多態(tài)性；杜曉磊等[21]構(gòu)建了首張苦蕎SSR遺傳連鎖圖譜；黎瑞源等[22]利用SSR標(biāo)記，構(gòu)建了首次以苦蕎RIL為作圖群體的遺傳圖譜；莫日更朝格圖等[23]、田曉慶等[24]、楊學(xué)文等[25]和徐笑宇等[26]利用SSR標(biāo)記對不同地區(qū)的蕎麥資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析。然而，由于適用性不夠普遍，功能性不顯著，目前適用于蕎麥遺傳分析的SSR引物數(shù)量仍然有限，難以滿足蕎麥遺傳多樣性分析和遺傳圖譜構(gòu)建等研究需要。2017年苦蕎全基因組序列的發(fā)表[27]為全面搜索SSR位點和批量開發(fā)SSR引物提供了條件。本研究以苦蕎全基因組序列為基礎(chǔ)，對苦蕎基因組SSR序列特征進(jìn)行了分析，批量開發(fā)了SSR引物，并對開發(fā)的部分引物進(jìn)行了多態(tài)性篩選，為進(jìn)一步開展蕎麥遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建和品種鑒定等研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取來源地不同并且表型差異大的5份苦蕎資源和3份甜蕎資源（表1）作為SSR引物的多態(tài)性鑒定。試驗材料均由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所提供。

表1 供試材料信息Table 1 List of accessions used in accessing SSR level in the tartary buckwheat

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 2018年2月，在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大吳溫室種植8份材料，每份材料種植2行，行長2m，苗期每份材料采集鮮嫩葉片2g，利用高通量粉碎機粉碎，采用DNA提取試劑盒（Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒，B518261-0050）提取葉片DNA，在酶標(biāo)儀上測定DNA質(zhì)量及濃度，并將DNA稀釋至終濃度30ng/μL，置于–20℃保存。

1.2.2 SSR開發(fā) 根據(jù)已發(fā)表的苦蕎基因組序列數(shù)據(jù)，采用MISA1.0對苦蕎基因組序列進(jìn)行SSR序列識別，其中1、2、3、4、5、6個堿基的重復(fù)次數(shù)最低分別為12、6、5、5、4、4，2個SSR之間距離小于100bp則合并為1個復(fù)合型SSR位點。

1.2.3 SSR引物的設(shè)計與篩選 利用Primer 3.0模塊進(jìn)行SSR引物批量設(shè)計。對8份材料DNA和設(shè)計的SSR引物進(jìn)行PCR擴增，驗證引物的多態(tài)性。PCR 反應(yīng)體系 10μL，包括 1.5μL（30ng/μL）基因組DNA，5μL 2×TaqPCRMasterMix[天根生化科技（北京）有限公司，KT：121221]，2μL（0.002nmol/μL）的正反引物和1.5μL ddH2O。PCR擴增反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性 5min；95℃變性 30s，52℃退火 45s，72℃延伸45s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物中加入2μL緩沖液并離心，以100～600bp DNA分子量為標(biāo)準(zhǔn)，采用6%～8%的非變性聚丙烯酰胺進(jìn)行凝膠電泳，電泳緩沖液為0.5×TBE，200～300V電壓電泳2～3h，至擴增片段電泳到凝膠中部為止。電泳結(jié)束后采用銀染法染色，最終將凝膠置于成像儀上成像并標(biāo)記拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎基因組SSR位點搜索及其組成分析

共檢測序列34 554條，序列總長度34 996 377bp，共檢測到SSR位點1 640個，頻率為4.75%，包含SSR位點的序列1 196條，占總序列數(shù)的3.46%，包含2個及以上SSR位點的序列142條，占總序列數(shù)的0.41%，復(fù)合型SSR 371個，平均每21 339bp出現(xiàn)1個SSR位點。從表2可以看出，苦蕎基因組SSR類型以重復(fù)5次的序列出現(xiàn)頻率最高，有704個，占比42.93%，其次為重復(fù)6次的序列，有360個，占比21.95%。從重復(fù)類型來看，單核苷酸重復(fù)型SSR 54個，二核苷酸重復(fù)型400個，三核苷酸重復(fù)型1 038個，四核苷酸重復(fù)型77個，五核苷酸重復(fù)型2個，六核苷酸重復(fù)型69個，其中三核苷酸重復(fù)型最多，占比63.29%，其次為二核苷酸重復(fù)型，占比24.39%。

表2 苦蕎全基因組SSR的重復(fù)類型、數(shù)量與分布頻率Table 2 Repeat type, number and frequency of SSRs in tartary buckwheat

從表3可以看出，苦蕎基因組SSR核苷酸基序的重復(fù)類型共有72種，其中單核苷酸重復(fù)類型2種，二核苷酸3種，三核苷酸10種，四核苷酸7種，五核苷酸2種，六核苷酸48種，以六核苷酸基序的重復(fù)類型最多。對單元的堿基組合進(jìn)行統(tǒng)計，出現(xiàn)頻率最高的二核苷酸重復(fù)型SSR是AT/TA，有310個，占二核苷酸重復(fù)基序總數(shù)的77.50%，占總SSR的18.90%；三核苷酸重復(fù)型SSR以AAG/CTT最多，有277個，占三核苷酸重復(fù)基序總數(shù)的21.87%，占總SSR的16.89%；此外，單核苷酸重復(fù)型SSR為A/T和C/G，占總SSR的3.29%；四核苷酸重復(fù)型SSR以ACAT/ATGT為主，有65個，占四核苷酸重復(fù)基序總數(shù)的84.41%；五核苷酸重復(fù)型SSR為ACAAA和TGGGC，分別僅有1個；六核苷酸重復(fù)型SSR以ACATAT/ATATGT最多，有8個，占總數(shù)的11.59%。

表3 苦蕎全基因組SSR基序中不同重復(fù)基序出現(xiàn)的頻率Table 3 Occurrence frequency of different microsatellites motifs of tartary buckwheat

2.2 苦蕎基因組微衛(wèi)星長度分析及變異

苦蕎基因組SSR序列長度變化范圍為12～476bp，平均長度23.14bp（圖1）。長度為15bp的SSR序列所占比例最大，為40.73%，其次是長度為18bp的SSR序列，占比16.10%，第三是長度為12bp的SSR序列，占比7.56%（圖1）。重復(fù)序列長度在12～19bp的占比71.71%，長度≥20bp占比28.29%。

圖1 苦蕎基因組不同長度SSR的出現(xiàn)頻率Fig.1 Frequency of SSRs with different length in tartary buckwheat genome

圖2顯示，除五核苷酸重復(fù)型SSR外，不同長度重復(fù)單元的SSR序列長度均呈現(xiàn)隨著重復(fù)次數(shù)的增多，SSR豐度降低的趨勢。單核苷酸重復(fù)型SSR序列的長度變化范圍12～92bp，平均長度為18.22bp，（A/T）n序列的平均長度18.74bp略大于（C/G）n序列平均長度16.18bp；二核苷酸重復(fù)型SSR序列的長度變化范圍最大，為12～476bp，平均長度為35.15bp，其中以（AT/TA）n序列的平均長度最大，為38.67bp，（AG/CT）n序列的平均長度最小，為13.38bp；三核苷酸重復(fù)型SSR序列的長度變化范圍15～66bp，平均長度為17.84bp，其中（ACC/GGT）n序列的平均長度最大，為21.72bp，（CCG/CGG）n序列的平均長度最小，為16.14bp。

圖2 不同長度重復(fù)單元SSR序列長度變異情況Fig.2 Variation in sequence length of different repeat types of SSR

2.3 苦蕎基因組SSR引物的有效性檢測

利用Primer 3.0模塊進(jìn)行SSR引物批量設(shè)計，共設(shè)計479對引物，經(jīng)檢測有386對引物可擴增出目的條帶，有效比例為80.58%。利用來源地不同表型差異大的5份苦蕎資源和3份甜蕎資源對其中的200對引物進(jìn)行多態(tài)性檢測，有56對SSR引物擴增出了清晰的多態(tài)性條帶，其中17對在苦蕎資源具有多態(tài)性，48對在甜蕎資源中具有多態(tài)性，9對引物同時在苦蕎資源和甜蕎資源中具有多態(tài)性（表4，圖3）。

圖3 引物34和39在5份苦蕎材料和3份甜蕎材料中的多態(tài)性Fig.3 Polymorphisms of primer 34 and primer 39 in five tartary buckwheat germplasms and three common buckwheat germplasms

表4 56對SSR引物在8份蕎麥材料中擴增產(chǎn)物的多態(tài)性分析Table 4 Polymorphic analysis for PCR amplicons of 56 SSR primer pairs in eight buckwheat genotypes

續(xù)表4 Table 4 (continued)

續(xù)表4 Table 4 (continued)

3 討論

3.1 苦蕎全基因組SSR的分布特征

本研究應(yīng)用苦蕎全基因組數(shù)據(jù)檢測SSR位點，共檢測序列34 554條，共檢測到SSR位點1 640個，包含SSR位點的序列1 196條，SSR位點發(fā)生頻率3.46%，平均每21.3kb出現(xiàn)1個SSR位點，低于苦蕎EST-SSR位點的平均1.73kb出現(xiàn)1個SSR位點[20]，這可能與數(shù)據(jù)量大小、轉(zhuǎn)錄組Unigene序列數(shù)量和長度以及設(shè)定的SSR搜索標(biāo)準(zhǔn)等因素相關(guān)[28]，苦蕎EST-SSR對單核苷酸重復(fù)位點篩選的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定在10次及以上，使得其篩選到的單核苷酸重復(fù)類型數(shù)量最多，有1 407個，占總數(shù)的52.11%，而本研究將該標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定的重復(fù)次數(shù)為12次及以上，得到的單核苷酸重復(fù)數(shù)僅有54個，占總數(shù)的3.29%。

苦蕎基因組上SSR種類較為豐富，1～6核苷酸均有分布，但數(shù)量上差異較大。從SSR重復(fù)堿基類型上看，苦蕎的三核苷酸重復(fù)型（63.29%）和二核苷酸重復(fù)型（24.39%）最多，這與水稻[29]、玉米[30]和棉花[31]的結(jié)果一致，表明苦蕎進(jìn)化水平相對較高。從SSR重復(fù)基序結(jié)構(gòu)上看，二核苷酸重復(fù)型SSR以（AT/TA）n為主，這與苦蕎轉(zhuǎn)錄組EST-SSR[21]和普通蕎麥轉(zhuǎn)錄組EST-SSR分析結(jié)果一致[19]，也與花生[32]和煙草[33]基因組SSR研究結(jié)果相同，與水稻[29]、玉米[30]、大豆[34]和小麥[35]中以AT/GC出現(xiàn)的頻數(shù)最高有所不同；三核苷酸重復(fù)型SSR以（AAG/CTT）n為主，這與雙子葉植物中以AAG/CTT三核苷酸主要重復(fù)類型的研究結(jié)果相同，也與苦蕎EST-SSR[20]、普通蕎麥EST-SSR[22]和擬南芥基因組的研究結(jié)果相同，與水稻[29]和玉米[30]等的研究結(jié)果不同。不同物種重復(fù)基序主導(dǎo)類型的差異可能與物種基因組或轉(zhuǎn)錄組序列的特異性以及EST數(shù)據(jù)來源和數(shù)量等有關(guān)。

多態(tài)性是評價SSR分子標(biāo)記可用性的重要指標(biāo)，低級SSR重復(fù)基序往往呈現(xiàn)較高的多態(tài)性，當(dāng)SSR長度≥20bp時多態(tài)性較高，長度在12～20bp之間的SSR多態(tài)性中等[36-38]?？嗍w中單、二和三核苷酸重復(fù)序列占90.97%，SSR序列長度變化范圍為12～476bp，平均長度23.14bp，長度均在12bp以上，其中長度≥20bp的共464條，占28.29%，這些SSR位點變異較大，多態(tài)性較豐富，有利于SSR引物的開發(fā)。

3.2 SSR引物多態(tài)性

本研究用5份苦蕎和3份甜蕎對200對合成SSR引物進(jìn)行了多態(tài)性分析，共有56對引物表現(xiàn)出多態(tài)性，占比28%，比苦蕎EST-SSR[20]多態(tài)性引物比例32.97%稍低，比韓瑞霞等[18]（10.8%）、Ma等[15]（7.4%）和Konishi等[14]（26.7%）得到的苦蕎和甜蕎多態(tài)性引物比例高。本研究開發(fā)的SSR引物，在苦蕎資源中的多態(tài)性比例低于甜蕎的多態(tài)性比例，這可能與供試材料的數(shù)量和材料本身之間的差異性有關(guān)，一方面是由于選擇的苦蕎材料數(shù)量較少，只涵蓋了部分苦蕎代表性狀，另一方面甜蕎資源TQ2為普通栽培甜蕎與野生等花柱甜蕎經(jīng)過雜交和回交的方式得到的自交可育甜蕎新類型品種，這使得該材料表現(xiàn)出較高的多態(tài)性。后期可選擇包含更多的不同類型資源的核心種質(zhì)進(jìn)行多態(tài)性SSR引物的進(jìn)一步篩選。

有研究表明，SSR引物在植物種屬間具有極高的通用性[39-40]，甜蕎和苦蕎是蕎麥屬的2個栽培種，前人得到的蕎麥SSR引物在蕎麥的近緣種中也表現(xiàn)出不同程度的通用性[6，14-15]，本研究結(jié)果表明基于苦蕎全基因組SSR位點開發(fā)的部分引物在甜蕎中也適用，可同時用于兩者的相關(guān)遺傳分析。

4 結(jié)論

本研究根據(jù)苦蕎全基因組測序數(shù)據(jù)，對1～6核苷酸重復(fù)的SSR位點進(jìn)行了查找和序列特征分析。結(jié)果顯示，苦蕎基因組SSR序列長度變化范圍為12～476bp，平均長度23.14bp，以三核苷酸重復(fù)型SSR最多，五核苷酸重復(fù)型最少。出現(xiàn)頻率較高的重復(fù)基序為AT/TA、AAG/CTT、ACC/GGT和ATC/GAT。根據(jù)不同類型SSR位點設(shè)計合成引物并對其進(jìn)行了有效性和多態(tài)性檢測，有56對引物具有多態(tài)性，其中9對同時在苦蕎種質(zhì)和甜蕎種質(zhì)中產(chǎn)生多態(tài)性條帶。開發(fā)的SSR分子標(biāo)記可用于蕎麥遺傳多樣性分析、連鎖圖譜構(gòu)建和品種鑒定等研究。