劉曉麗 韓利濤 魏 楠 申 飛 蔡一林

（1河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學院食品工程學院，451450，河南鄭州；2西南大學玉米研究所，400715，重慶）

產(chǎn)量性狀由多基因控制，表現(xiàn)為典型的數(shù)量性狀遺傳，對產(chǎn)量性狀的研究可為育種工作提供重要的參考信息[1]。目前，國內(nèi)外關于玉米產(chǎn)量性狀的研究主要集中在控制產(chǎn)量性狀基因的定位方面[2]。籽粒的發(fā)育是影響產(chǎn)量的一個重要因素，報道的玉米籽粒發(fā)生突變的基因有50多個[3]，大部分突變基因主要作用于胚乳細胞[4]或糊粉層細胞[5]，如ae1、su1、su2、wx、du、bt1和bt2等影響籽粒發(fā)育、淀粉形態(tài)、物理特性以及酶活性[5]；少部分突變基因，如os[6]、dek1[7]和mee1[8]等影響胚和胚乳特性[3]。

OsGS5是水稻中控制水稻籽粒大小和粒重的主效基因，該基因編碼絲氨酸羧肽酶，功能研究表明它是水稻中控制籽粒大小的正向調(diào)節(jié)因子。水稻基因組相對較小，OsGS5基因的克隆和功能研究已取得突破性的進展，較高的OsGS5表達水平可參與促進細胞周期循環(huán)，加快細胞循環(huán)進程，從而促進水稻穎殼細胞的橫向分裂，增大穎殼的寬度，繼而加快谷粒的充實和胚乳的生長速度，最終增大種子、增加谷粒重和單株產(chǎn)量。在除谷粒大小目標性狀有差異而遺傳背景完全相同的兩個遺傳材料中，谷粒大的材料比谷粒小的含有較高OsGS5基因表達，大粒比小粒寬8.7%，千粒重增加7.0%，單株產(chǎn)量提高7.4%[9]。

水稻和玉米都是禾本科植物，來自一個共同的祖先，它們大約在5 500萬年前開始分化[10]。水稻和玉米基因組具有較高的線性，基因功能在這兩個作物之間也高度保守[11]。因此，玉米ZmGS5可能與水稻OsGS5一樣在玉米籽粒發(fā)育中發(fā)揮重要作用，從而影響玉米產(chǎn)量。從NCBI可下載到玉米同源旁系基因26個，但到目前為止，國內(nèi)外未見玉米ZmGS5基因的相關報道?；贠sGS5的研究，采用同源克隆的方法克隆ZmGS5，對其蛋白質(zhì)理化特性、空間結(jié)構(gòu)及功能進行分析預測，并對其在各組織中的相對表達量進行分析，最后采用農(nóng)桿菌介導法，對純合轉(zhuǎn)基因株系的千粒重進行研究，為研究ZmGS5的生物功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

主要試驗材料為玉米自交系B73、Mo17、鄭58、昌7-2、黃C和178等；轉(zhuǎn)基因所需的模式植物為野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana，Columbia生態(tài)型）。

1.2 菌種及主要試劑

轉(zhuǎn)基因所需的菌株為農(nóng)桿菌EHA105和大腸桿菌Trans 5α，植物表達載體為pCAMBIA3301。試劑及材料有克隆載體pGM-T vector、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、RACE PCR試劑盒（TIANGEN生物技術(shù)有限公司）、卡那霉素（kanamycin，Kan）、草銨膦（phosphinothricin，PPT）、高保真酶HiFi（北京全式金生物技術(shù)有限公司）和實時熒光定量試劑盒（QPS-201 THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix，日本TOYOBO公司）。引物合成和產(chǎn)物測序均由上海生工生物科技有限公司完成。

1.3 總RNA的提取及質(zhì)量檢測

分別收集玉米自交系B73穗期的根、莖、葉、雌穗、雄穗及授粉后14d的（14 days after pollination，14DAP）胚和胚乳，自交系Mo17、鄭58、昌7-2、黃C和178葉片于–80℃保存。采用Invitrogen公司的TRIzol裂解液提取總RNA，參照說明書的步驟進行。利用1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合超微量分光光度計測定OD260和OD280的吸光值來檢測總RNA的質(zhì)量。

1.4 cDNA第一條鏈的合成

RNA質(zhì)量檢測合格后，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成 cDNA 第一鏈。反轉(zhuǎn)錄體系為 40μL：20μL RNA、4μL dNTP mixture、8μL Rtbuffer、2μL RNase Inhibitor、2μL Reverse Transcriptase 和 4μL RNase free ddH2O。

1.5 基因克隆

通過NCBI網(wǎng)站下載OsGS5序列，利用Blast（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）工具與玉米EST數(shù)據(jù)庫比對，并用BioEdit軟件將比對結(jié)果進行拼接，初步得到玉米的GS5基因序列，利用Primer 5.0軟件設計特異性引物ZmGS5-F和ZmGS5-R（表 1）。

表1 所有PCR擴增引物Table 1 Sequences of all PCR primers used

以B73 14DAP胚乳cDNA為模板進行PCR擴增。20μL反應體系：2μL cDNA模板、2μL HiFi Buffer I、0.5μL dNTPs、1.5μL 特異性引物（上下游混合物）、0.3μL HiFi酶和13.7μL ddH2O。PCR反應程序：94℃預變性 5min；94℃ 45s，64℃ 45s，72℃2min，35個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，回收DNA目的片段，進行克隆篩選后選取陽性克隆送上海生工生物科技有限公司進行測序。

利用DNAMAN軟件和BLAST檢索GenBank進行多重序列比對和同源性分析。根據(jù)克隆測序的ZmGS5序列，利用Primer 5.0設計特異性引物（表1）進行3′和5′端RACE PCR擴增。

以14DAP胚乳cDNA為模板，分別進行第一次PCR和巢式PCR。第一次PCR擴增反應體系為 20μL：1μL cDNA 模板、2μL HiFi Buffer I、0.5μL dNTPs、1μL 基因特異性引物 GSP1、1μL 通用引物UPM、0.3μL HiFi酶和14.2μL ddH2O，PCR擴增程序：94℃預變性 3min；94℃ 30s，70℃ 45s，72℃2min，10 個循環(huán)；94℃ 30s，66℃ 45s，72℃ 2min，30個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。將第一次PCR產(chǎn)物稀釋20倍（取5μL產(chǎn)物用TE Buffer稀釋至100μL）作為巢式PCR的模板。巢式PCR擴增的反應體系和擴增程序同上，產(chǎn)物回收進行克隆篩選后送測序。

1.6 實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）分析

以玉米β-actin基因作為內(nèi)參基因，依據(jù)qRTPCR引物設計要求，使用Primer 5.0設計特異性引物ZmGS5-qF和ZmGS5-qR（表1）。玉米自交系B73根、莖、葉、雌穗、雄穗、14DAP胚和14DAP胚乳cDNA分別用ddH2O稀釋80倍后，采用CFX96 TouchTM熒光定量PCR儀（BIO-RAD）進行 qRT-PCR 反應，反應體系 12μL：6μL SYBR Premix EX，正反向引物各0.5μL，模板cDNA 5μL。每個樣品3次重復。反應程序：95℃預變性3min；95℃變性10s、64℃退火/延伸30s（每次循環(huán)后采集熒光），40個循環(huán)，以每5s增加0.5℃的速度從65℃增至95℃進行溶解曲線分析；試驗數(shù)據(jù)運用Bio-Rad ManagerTM軟件進行分析，采用2-ΔΔCT法獲得ZmGS5基因的相對表達量[12]。

1.7 ZmGS5蛋白的理化性質(zhì)分析

用 ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析目的蛋白的氨基酸組成、等電點、分子量和帶正負電荷的殘基數(shù)；用ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）分析目的蛋白的親/疏水性。

1.8 ZmGS5蛋白的結(jié)構(gòu)分析

運用SMART（http：//smart.embl.de/）分析目的蛋白結(jié)構(gòu)域；用TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）分析目的蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域；分別用SOPM（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=npsa_sopm.html）和SWISS-MODEL Workspace（http：//swissmodel.expasy.org/workspace/）分析ZmGS5蛋白的二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)。

1.9 ZmGS5蛋白的功能預測

利用BaCelLo（http：//gpcr2.biocomp.unibo.it/bacello/）預測目的蛋白的亞細胞定位；利用SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進行目的蛋白信號肽的分析；用NetPro 2.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析目的蛋白的磷酸化位點；利用 ProtFun（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/）預測蛋白質(zhì)的功能；用DNAMAN軟件進行多序列比對；用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.10 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化[13]

1.10.1 超表達載體的構(gòu)建 采用質(zhì)粒提取試劑盒提取擴增和測序結(jié)果均正確無誤的pGM-T-ZmGS5質(zhì)粒，然后用內(nèi)切酶Bgl II和Pml I分別對pGM-TZmGS5質(zhì)粒和pCAMBIA3301載體進行雙酶切。酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，且對ZmGS5目標片段及pCAMBIA3301骨架進行膠回收，然后通過連接酶對ZmGS5目標片段和pCAMBIA3301骨架進行連接，構(gòu)建重組表達載體。

1.10.2 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài) 首先制備農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)，然后將陽性pCAMBIA3301-ZmGS5克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)，陽性菌液于–80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.10.3 轉(zhuǎn)化野生型擬南芥 采用組培法培養(yǎng)野生型擬南芥，長出四葉一心后移栽進行土培，有花苞后用農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)侵染并轉(zhuǎn)化擬南芥。利用pCAMBIA3301載體上Kan和PPT抗性位點，用適當濃度的Kan和PPT溶液進行篩選，為防止出現(xiàn)假陽性增加工作量，需要對T0疑似陽性植株葉片DNA進行序列檢測，最終篩選至T3代純合陽性轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。

1.10.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥千粒重的測定 隨機選取若干擬南芥轉(zhuǎn)基因植株，測定其T3代及同批次的對照野生型擬南芥種子的千粒重，利用統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)。將T3代轉(zhuǎn)基因種子和對照野生型擬南芥種子用組培法（不含抗生素的固體培養(yǎng)基）在相同的條件下種植，同時移栽，進行觀察鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmGS5基因的克隆及分析

采用RACE PCR方法從玉米自交系B73 14DAP胚乳中克隆ZmGS5的全長cDNA序列，結(jié)果（圖1）顯示，5′-RACE結(jié)果有500bp左右，3′-RACE結(jié)果有750bp左右。序列拼接后ZmGS5全長 cDNA 1 695bp，5′-UTR（非編碼區(qū)）長 52bp，3′-UTR長152bp，編碼區(qū)長1 491bp，編碼496個氨基酸。

圖1 ZmGS5基因3′和5′端RACE擴增Fig.1 Rapid amplification of 3′ and 5′ ends of ZmGS5

2.2 ZmGS5蛋白的理化性質(zhì)

根據(jù)ZmGS5推測其編碼蛋白的氨基酸序列，利用ProtParam分析ZmGS5蛋白的理化性質(zhì)。結(jié)果顯示其分子量為55.45kDa，等電點為7.6。其一級結(jié)構(gòu)（圖2）丙氨酸（Ala，10.1%）、亮氨酸（Leu，8.90%）、絲氨酸（Ser，8.70%）、纈氨酸（Val，7.50%）和甘氨酸（Gly，7.10%）的含量較多，而蛋氨酸（Met，1.40%）、半胱氨酸（Cys，1.6%）和色氨酸（Trp，2.20%）的含量較少，帶正電荷的氨基酸（Arg+Lys）有48個，帶負電荷的氨基酸（Asp+Glu）有47個。ZmGS5蛋白的脂溶性指數(shù)為76.53，親水性指數(shù)為–0.264。ZmGS5蛋白親/疏水性結(jié)果（圖3）顯示，多肽鏈的第28位數(shù)值（2.778）最高，第335位數(shù)值（–3.211）最低，親水性氨基酸略多于疏水性氨基酸，初步判定其為親水蛋白[15]。

圖2 ZmGS5蛋白的氨基酸組成Fig.2 Amino acid composition of ZmGS5

圖3 ZmGS5蛋白的親/疏水性分析Fig.3 ProtScale analysis of ZmGS5

2.3 ZmGS5蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)

ZmGS5蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成與其他植物中的同源蛋白類似，均是α螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈和β轉(zhuǎn)角依次遞減（圖4）。

圖4 不同植物ZmGS5同源蛋白的二級結(jié)構(gòu)Fig.4 Secondary structure of different plants homologous proteins of ZmGS5

利用SWISS-MODEL進行進一步空間結(jié)構(gòu)預測，結(jié)果（圖5）表明ZmGS5含有豐富的α螺旋和無規(guī)則卷曲，與二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果一致。

圖5 ZmGS5蛋白的空間結(jié)構(gòu)Fig.5 Spatial structure of ZmGS5 protein

2.4 ZmGS5蛋白的結(jié)構(gòu)域、信號肽及跨膜區(qū)

采用SMART預測ZmGS5蛋白的結(jié)構(gòu)域，從第64個氨基酸到第489個氨基酸之間有1個保守的Peptidase-S10結(jié)構(gòu)域，2個蛋白的E值都非常低，表明這個結(jié)構(gòu)域?qū)儆赟10超家族[16]，編碼絲氨酸羧肽酶，是一類蛋白水解因子（表2）。

表2 ZmGS5和OsGS5蛋白的信號肽、重復組件和結(jié)構(gòu)域特征值Table 2 Confidently predicted signal peptides, repeats,and domains of OsGS5 and ZmGS5

使用SignalP 4.1 Server軟件預測ZmGS5蛋白的信號肽，結(jié)果顯示在N端1-37氨基酸位置含有1個細胞內(nèi)分泌和轉(zhuǎn)運信號肽（表2，圖6），這是SCP氨基酸序列相似的蛋白質(zhì)（SCP-like proteins，SCPL），具有SCP的典型結(jié)構(gòu)特征，因此推測ZmGS5蛋白為分泌蛋白，這與其作為酶類蛋白的生物學功能吻合。利用TMHMM Server v.2.0軟件預測ZmGS5蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示其與水稻相同，不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，表明ZmGS5蛋白為非膜蛋白。

圖6 ZmGS5蛋白信號肽的預測Fig.6 Prediction of signal peptides of ZmGS5

2.5 亞細胞定位及磷酸化位點

利用軟件BaCelLo預測ZmGS5蛋白的亞細胞定位，結(jié)果顯示其定位在葉綠體，定位過程為細胞內(nèi)到細胞器，再到葉綠體。

利用軟件NetPhos 2.0 Server預測ZmGS5蛋白的磷酸化位點，結(jié)果顯示目的蛋白含有絲氨酸識別位點15個、蘇氨酸識別位點5個和酪氨酸識別位點14個，其中6個絲氨酸、2個蘇氨酸和9個酪氨酸識別位點與水稻相同（表3），表明玉米ZmGS5蛋白極有可能是被絲氨酸蛋白激酶、蘇氨酸蛋白激酶和酪氨酸蛋白激酶進行了磷酸化修飾而激活的，從而調(diào)控了二級響應基因的表達。

表3 ZmGS5和OsGS5蛋白磷酸化位點比較Table 3 Comparison of ZmGS5 and OsGS5 in phosphorylation sites

2.6 序列多態(tài)性分析

2.6.1ZmGS5基因同源性分析 同源性分析表明，ZmGS5基因與大芻草TeGS5基因、高粱SbGS5基因、水稻OsGS5基因及擬南芥AtGS5基因序列的同源性高達60%～98%，其中與水稻的同源性達77%，與大芻草的同源性達98%（圖7）。

圖7 ZmGS5與其他植物GS5基因序列同源性分析Fig.7 The homology analysis of ZmGS5 and GS5 in other plants

2.6.2 基因及蛋白質(zhì)的多序列比對 以ZmGS5-F和ZmGS5-R為引物，以玉米自交系Mo17、昌7-2、鄭58、黃C和178 cDNA為模板進行PCR擴增，測序結(jié)果與B73中ZmGS5序列比對，結(jié)果顯示有3個堿基的插入或缺失，有17個SNP（single nucleotide polymorphism）位點（表4），說明ZmGS5cDNA序列在玉米各自交系中具有較高的保守性。

玉米各自交系ZmGS5蛋白與水稻品種H94和Zhenshan97、擬南芥、大芻草及高粱GS5蛋白氨基酸序列比對結(jié)果（圖8）顯示，所有氨基酸序列都在N端含有1個信號肽，都含有1個絲氨酸羧肽酶特有的Ser-Asp-His催化三聯(lián)體活性位點（ISGESYAG），此結(jié)果與在水稻中的研究結(jié)果相同[9]。在11個玉米自交系中有7個氨基酸突變位點與cDNA序列突變位點相對應（表4），其中，1個氨基酸插入或缺失，1個氨基酸的突變位點位于N端信號肽上，另外5個位點（44、230、293、465和486）位于Peptidase-S10保守結(jié)構(gòu)域上。

圖8 蛋白質(zhì)的多序列比對Fig.8 Alignment of the amino acid sequence

表4 ZmGS5基因cDNA序列和ZmGS5蛋白序列的等位基因的多態(tài)性Table 4 The change of allelic variation in cDNA sequences of ZmGS5 and amino acid sequence of ZmGS5

2.6.3 系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建 從NCBI下載玉米SCPL家族基因序列26個，與B73、Mo17、鄭58、昌 7-2、黃 C、178、H94、Zhenshan97、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、大芻草和高粱中GS5蛋白序列比對，利用MEGA5.0軟件，選擇NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果（圖9）顯示SCPL家族被分為4個群體，B73、Mo17、鄭58、昌7-2、黃C、178、H94、Zhenshan97、擬南芥、大芻草和高粱都處于第Ⅱ群體，B73與大芻草進化關系最近。并且從圖9可看出GS5基因在各植物間進化相對保守。

圖9 SCPL蛋白家族系統(tǒng)進化樹Fig.9 Neighbor-joining tree of SCPL family proteins

2.7 ZmGS5基因在玉米不同組織中的表達分析

以玉米β-actin為內(nèi)參基因，通過qRT-PCR分析ZmGS5在不同組織中的表達。結(jié)果（圖10）顯示，ZmGS5在雄穗和葉中表達量高，在胚和胚乳中表達量低，其表達量趨勢與GS5在水稻各組織中的表達量趨勢相似。水稻qRT-PCR結(jié)果顯示GS5在綠色組織葉中的表達量較高；非綠色組織中GS5的表達量在不同時期和不同長短穗中相對較高，而在胚及胚乳中的表達量相對較低[23]，此結(jié)果為探索ZmGS5基因的功能奠定了理論基礎。

圖10 ZmGS5基因在玉米不同組織中的qRT-PCR分析Fig.10 The qRT-PCR analysis of ZmGS5 gene expression in different tissues of maize

2.8 ZmGS5基因多態(tài)性與玉米籽粒大小的關系

上述11個玉米自交系籽粒表型各不相同（圖11）。Mo17籽粒最大，I15016籽粒最小，它們的cDNA序列和氨基酸序列有較大不同。11個自交系籽粒表型相關指標測定結(jié)果（表5）顯示，Mo17百粒重28.28g為最大值，I15016百粒重18.04g為最小值。綜合兩品種的測定結(jié)果，Mo17仍為11個自交系中的最大籽粒，I15016為最小籽粒，此結(jié)果與多序列分析結(jié)果相對照，11個自交系的籽粒表型差異顯著且序列有多個位點存在差異，推測存在差異的第15、23、44、230、293、465和486這7個氨基酸突變位點可能在籽粒發(fā)育過程中起重要作用，可為其進一步的功能驗證提供參考信息。

圖11 11個自交系的籽粒表型Fig.11 Kernel phenotypes of eleven inbred lines

表5 11個自交系籽粒表型分析Table 5 Phenotypic analysis of eleven inbred lines kernels

2.9 ZmGS5基因轉(zhuǎn)化擬南芥

待野生型擬南芥抽薹3～8cm且剛開始開花時，將從B73中克隆的ZmGS5的cDNA序列連接到表達載體pCAMBIA3301上，通過農(nóng)桿菌浸染花絮法將ZmGS5轉(zhuǎn)入擬南芥中，待到莢果自然成熟干燥后收取T0代種子。

2.10 陽性ZmGS5轉(zhuǎn)基因種子的篩選

經(jīng)過抗生素篩選及基因序列檢測選出了T0代（圖12），繼續(xù)經(jīng)過抗生素篩選，根據(jù)孟德爾遺傳定律T1代兩個株系都出現(xiàn)約3∶1的分離比（圖13）；T2代種子一些株系按照3∶1的分離比分離（培養(yǎng)基上部），而不發(fā)生分離的株系即為純合株系（培養(yǎng)基下部）；收取T2代純合株系的種子，得到T3代純合陽性轉(zhuǎn)基因株系。

圖12 T0代擬南芥葉片檢測ZmGS5基因Fig.12 The detection of ZmGS5 in the leaves of T0 generation

圖13 T1代和T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選Fig.13 Screening of the T1 and T2 generations of transgenic Arabidopsis

2.11 ZmGS5基因?qū)M南芥籽粒重的影響

得到13個純合轉(zhuǎn)基因株系的255個擬南芥單株的T3代種子，以及5個單株同批次的野生型擬南芥種子。隨機選取37份T3代純合轉(zhuǎn)基因株系和5份野生型種子分別測定千粒重（表6），T3代千粒重最大值與最小值分別為0.0192和0.0147g。

表6 野生型和T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥的千粒重Table 6 The 1000-seed weight of the wildtype plants and T3 plants of Arabidopsis

與野生型擬南芥相比，所有T3代的千粒重均有所增加。野生型千粒重的平均值為0.0139g，T3代千粒重的平均值為0.0169g，相比野生型增加22.29%。顯著性測驗（t0.01=2.704）結(jié)果顯示T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥千粒重之間達到極顯著水平，表明ZmGS5基因可以增加擬南芥的千粒重。

3 討論

經(jīng)過對ZmGS5分析可知，ZmGS5編碼的蛋白含有15個絲氨酸蛋白激酶磷酸化位點、5個蘇氨酸蛋白激酶磷酸化位點和14個酪氨酸蛋白激酶磷酸化位點。蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化在細胞信號轉(zhuǎn)導中起重要作用，幾乎涉及所有的生理過程，如糖代謝、細胞生長發(fā)育和基因表達等，是生物體中普遍存在的一種調(diào)節(jié)機制[14-15]，因此，這些磷酸化位點的發(fā)現(xiàn)可為ZmGS5在玉米生長發(fā)育過程中的具體功能研究奠定基礎。

本研究結(jié)果顯示，ZmGS5編碼的絲氨酸羧肽酶是一類真核生物蛋白水解酶，屬于α/β水解酶類蛋白家族，絲氨酸羧肽酶屬于SC族羧肽酶中的S10家族[16]，SCPL基因在參與種子發(fā)育、種子萌發(fā)中貯藏蛋白的水解、細胞程序性死亡中細胞成分的自溶等過程中起作用。已有大量絲氨酸羧肽酶及其類蛋白編碼基因從植物中分離出來，己從水稻、擬南芥、玉米、大麥、番茄和豌豆等高等植物中分離出SCP基因，且已從水稻、擬南芥和豌豆等植物中分離純化到SCP蛋白，并對其特性及表達進行分析[17-20]。雖然絲氨酸羧肽酶及其類蛋白家族龐大，成員眾多，但其確切的生物學功能尚不清楚[13]。

與OsGS5相比較可知，ZmGS5蛋白與OsGS5蛋白在結(jié)構(gòu)上相似，在N端都含有1個信號肽，都含有SCPL蛋白所特有的催化活性中心，且在系統(tǒng)發(fā)育進化中具有較高的親緣關系，在qRT-PCR分析中得到相同的結(jié)論。

采用農(nóng)桿菌介導法進行ZmGS5基因的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化，通過篩選和鑒定后，得到陽性轉(zhuǎn)基因植株，最終得到純合T3代轉(zhuǎn)基因株系，通過對純合轉(zhuǎn)基因株系和野生型擬南芥進行比較鑒定，推測ZmGS5基因在擬南芥中的功能。

4 結(jié)論

根據(jù)水稻中已經(jīng)克隆的決定籽粒大小的關鍵基因OsGS5，利用同源克隆的方法，從玉米基因組中克隆出1條全長1 695bp的基因片段，開放閱讀框1 491bp，編碼496個氨基酸殘基，蛋白序列與OsGS5基因編碼的蛋白序列高度同源，一致性達77%。推測ZmGS5在籽粒發(fā)育過程中具有重要作用，從而影響玉米產(chǎn)量。ZmGS5可增加擬南芥千粒重。